eng
Выпуск #1/2012
И.Суханова, М.Дикунец, Г.Родченков, Т.Соболевский, Э.Вирюс
Нанотехнологии в допинговом контроле: перспективы применения магнитной сепарации для пробоподготовки
Нанотехнологии в допинговом контроле: перспективы применения магнитной сепарации для пробоподготовки
Просмотры: 2820
Предложен новый способ экстракции допинговых препаратов из мочи человека с применением нанотехнологичных ферромагнитных микрочастиц с поверхностью, модифицированной группами С18. С применением такого подхода степень извлечения исследуемых веществ из биожидкости человека приближается к 100%, в то время как эффект подавления ионизации соединений компонентами матрицы сводится к минимуму. Время подготовки одного образца для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией составляет 5 мин.
Теги: doping control hplc-ms magnetic separation microextraction вэжх-мс допинг-контроль магнитная сепарация микроэкстракция
Методы пробоподготовки
в допинговом контроле
В Запрещенный список веществ и методов Всемирного антидопингового агентства (ВАДА) входят следующие классы веществ: кортикостероиды, диуретики, наркотические вещества, стимуляторы центральной нервной системы, анаболические стероиды, бета-адреноблокаторы, бета-2-агонисты, селективные модуляторы андрогенных рецепторов (СМАР), агонисты дельта-рецепторов активации пролиферации пероксисом (δ-РАПП), полипептидные гормоны и антиэстрогены [1]. Согласно требованиям ВАДА, предел обнаружения запрещенных веществ или/и их метаболитов должен составлять от 1 нг/мл до 500 нг/мл в зависимости от класса [2]. Для определения этих соединений в допинговом контроле широко используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс–спектрометрией (ВЭЖХ–МС/МС) [3]. Этот высокочувствительный метод требует эффективной очистки образца, чтобы снизить эффект подавления ионизации определяемых соединений компонентами матрицы. Традиционно для снижения влияния эффекта матрицы на ионизацию соединений веществ и их концентрирования используют жидкостно-жидкостную (ЖЖЭ) или твердофазную (ТФЭ) экстракцию.
Основные достоинства ЖЖЭ – универсальность, простота, доступность оборудования, а также возможность селективного концентрирования. Экстрагенты, применяемые в ЖЖЭ, должны хорошо извлекать определяемые соединения или группу веществ, обладать малой растворимостью в воде, иметь низкую температуру кипения. Недостатками ЖЖЭ являются расход большого количества растворителей, плохая кинетика экстракции, трудность автоматизации, а также возможное искажение состава пробы за счет потерь летучих соединений при упаривании экстракта и привнесения примесей из растворителей.
Переворотом в практике пробоподготовки стал предложенный более 30 лет назад простой и эффективный метод ТФЭ, основанный на выделении компонентов сорбцией на твердом носителе. ТФЭ основана на специфических взаимодействиях компонента с сорбентом и за счет этого объединила стадии концентрирования и извлечения. Адсорбция определяемых соединений происходит под воздействием различных нековалентных (обычно гидрофобных) сил сорбционного взаимодействия. Для ТФЭ характерны более широкие возможности варьирования природы и силы взаимодействия образца с сорбентом и элюентом, что позволяет более эффективно выделять определяемые соединения. Однако разработка методик с применением ТФЭ требует временных затрат для оптимизации условий ее проведения, а также определенного опыта и экспериментальных навыков специалиста.
В допинговом контроле традиционно для извлечения из мочи человека неконъюгированных веществ, таких как диуретики, стимуляторы и наркотики, применяют ЖЖЭ [4]. Для извлечения кортикостероидов, конъюгированных наркотических веществ и анаболических стероидов сначала проводят ферментативный гидролиз, а затем ТФЭ или ЖЖЭ [5, 6]. Рядом исследователей [7, 8] предложены методики одновременного определения кортикостероидов, диуретиков, стимуляторов, наркотиков и анаболических стероидов, что позволило сократить количество процедур, уменьшив тем самым затраты на проведение допингового контроля одной пробы. Однако проблема больших временных затрат остается актуальной, поскольку проведение ЖЖЭ и ТФЭ сопряжено с длительной процедурой упаривания.
Одним из перспективных способов извлечения полярных лекарственных препаратов и их метаболитов из биожидкостей человека и их концентрирования может стать магнитная сепарация (МС), имеющая ряд преимуществ перед классическими методами экстракции. Прежде всего, она экспресснее и проще в практическом применении.
Магнитная сепарация
Принцип МС заключается в концентрировании исследуемых соединений на поверхности микрочастиц со средним размером 1 мкм, модифицированной группами С18. Ядро микрочастиц содержит 106 нанокристаллов маггемита (γ-Fe2O3) диаметром около 8 нм, погруженных в полистирольную матрицу и покрытых тонким слоем полимера (рис. 1) [9, 10].
Нанокристаллы оксида железа придают микрочастицам суперпарамагнитные свойства*, благодаря чему микрочастицы мигрируют к магниту, только когда попадают в магнитное поле. После прекращения его действия они мгновенно теряют свои магнитные свойства и вновь превращаются в суспензию [11]. Это позволяет упростить и ускорить процедуру отбора экстракта после элюирования и исключить стадию упаривания. Время подготовки одного образца перед анализом составляет всего 5 минут. На рис.2 представлена блок-схема магнитной сепарации, на рис.3 – магнитный штатив для проведения сепарации.
МС уже нашла широкое применение в биохимии для извлечения клеток, субклеточных культур, белков и ДНК [12]. Магнитные микрочастицы используют для извлечения фенольных соединений из водных образцов [13] и противогрибкового средства интраконазола из плазмы крови человека [14]. Нами предложено использовать МС для извлечения лекарственных и допинговых средств из такой сложной матрицы, как моча человека [15].
Экстракции допинговых препаратов новых классов с применением ферромагнитных микрочастиц
При извлечении органических веществ из биожидкости человека с применением МС эффективность экстракции зависит от сродства определяемых соединений к поверхности частиц. Поэтому при выборе оптимальных условий проведения экстракции мы исследовали влияние природы, объема сорбента и элюирующих органических растворителей.
В качестве объектов исследования были выбраны допинговые препараты новых классов – селективные модуляторы андрогенных рецепторов (СМАР) и агонисты дельта-рецепторов активации пролиферации пероксисом (δ-РАПП). СМАР воздействуют на андрогенные рецепторы, ответственные за рост мышечных волокон, и обладают анаболическими свойствами, приводящими к увеличению мышечной массы и силы [16]. Активация δ-РАПП стимулирует сжигание жировых клеток, являющихся энергетическим депо живых организмов, что приводит к одновременному увеличению выносливости и силы за счет изменения метаболических процессов в мышечных тканях [17]. СМАР и агонисты δ-РАПП, находящиеся на заключительной стадии клинических испытаний, потенциально могут использоваться спортсменами в качестве допинга, поэтому с 2009 года они включены в Запрещенный список ВАДА.
Нами показано [15], что для экстракции из мочи СМАР и агонистов δ-РАПП целесообразно использовать 200 мкл суспензии с концентрацией 1,25 мг/мл (масса сорбента 0,25 мг) магнитных частиц с поверхностью, модифицированной группами C18, а в качестве растворителя (элюента) – 150 мкл метанола.
В табл.1 приведены аналитические характеристики разработанного способа одновременного определения δ-РАПП и СМАР с применением магнитной сепарации для их извлечения из мочи человека и последующим анализом полученного экстракта методом ВЭЖХ–МС/МС.
Во всем диапазоне изученных концентраций соединений (0,5–50 нг/мл) мы наблюдали селективное извлечение аналитов, причем не отмечали значимых изменений степени извлечения СМАР и δ-РАПП из мочи и их степени отмывки с микрочастиц от количества аналитов. Предел детектирования исследуемых соединений по массе составил 0,02–0,33 нг. Было проведено сравнение эффективности извлечения из мочи человека допинговых препаратов методом МС с традиционными способами экстракции, такими как ЖЖЭ и ТФЭ. Показано, что в случае МС степень извлечения аналитов была заметно выше, а эффект подавления ионизации определяемых соединений компонентами матрицы ниже. Стоит подчеркнуть, что извлечение и концентрирование СМАР и δ-РАПП с применением микрочастиц является более экспрессным, время подготовки одного образца для анализа методом ВЭЖХ–МС/МС составляет всего 5 минут.
Предложенный метод микроэкстракции обеспечивает высокую точность, эффективность и экспрессность всей аналитической процедуры с применением масс-спектрометрии.
Литература
1. World Anti-Doping Agency, The 2011 Prohibited List. International standard (2011).
URL: http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-Prohibited-list/To_be_effective/WADA_Prohibited_List_ 2011_ EN. pdf
2. World Anti-Doping Agency, Technical documents, Minimum required performance levels (2011). URL: http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-IS-Laboratories/WADA_TD2010MRPLv1.0_ Minimum%20Required%20Performance%20Levels_Sept%2001%202010_EN.pdf
3. Thevis M., Thomas A., Schänzer W. Current role of LC-MS(/MS) in doping control. – Anal. Bioanal. Chem., 2011, v.401(2), p.405-420.
4. Deventer K., Delbeke F.T., Roels K., Van Eenoo P. Screening for 18 diuretics and probenecid in doping analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. – Biomedical chromatography, 2002, v.16, p.529-535.
5. Cho H.J., Kim J.D., Lee W.Y., Chung B.C., Choi M.H. Quantitative metabolic profiling of 21 endogenous corticosteroids in urine by liquid chromatography-triple quadrupole-mass spectrometry. – Analytica Chimica Acta, 2009, v.632, p.101-108.
6. Gonzalo-Lumbreras, Pimentel-Trapero D., Izquierodo-Hornillos R. Solvent and solid-phase extraction of natural and synthetic anabolic steroids in human urine. – Journal of Chromatography B, 2001, v.754, p.419–425.
7. Дикунец М.А., Апполонова С.А., Родченков Г.М. Одновременное определение широкого круга неконьюгированных ксенобиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. – Журнал аналитической химии, 2009, т.64(8), с.854–864.
8. Kolmonen M., Leinonen A., Kuurann T., Pelander A., Ojanperä I. Generic sample preparation and dual polarity liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry for high-throughput screening in doping analysis. – Drug Testing and Analysis, 2009, v.1, p.250–266.
9. Fonnum G., Johansson C., Molteberg A.,
Morup S., Aksnes E. Characterisation of Dynabeads by magnetization measurement
and Mössbauer spectroscopy. – Journal of magnetism and magnetic materials, 2005, v.293(1), p.41–47.
10. Sinclair B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. – The Scientist, 1998, v.12(13), p.17–20.
11. Fallesen T., Hill D.B., Steen M., Macosko J.C., Bonin K., Holzwarth G. Magnet polepiece design for uniform magnetic force on superparamagnetic beads. – Review of scientific instruments, 2010, v.81(7), p.074303-1-074303-5.
12. Hafeli U.O. Magnetically modulated therapeutic systems. - International Journal of Pharmaceutics, 2004, v.277(1), p.19–24.
13. Faraji M., Yamini Y., Rezaee M. Magnetic nanoparticles: synthesis, stabilization, functionalization, characterization and applications. – Journal of the Iranian Chemical Society, 2010, v.7(1), p.1–37.
14. Vogeser M., Geiger A., Herrmann R., Kobold U. Sample preparation for liquid chromatography-tandem mass spectrometry using functionalized ferromagnetic micro-particles. – Clinical Biochemistry, 2008, v.41(16-17), p.1417–1419.
15. Суханова И.И., Дикунец М.А., Вирюс Э.Д., Родченков Г.М. Магнитная сепарация как новый метод экстракции низкомолекулярных соединений из биожидкости человека. –Журнал аналитической химии, 2011, т.66(9), с.923–930.
16. Thevis M., Kamber M., Schänzer W. Screening for metabolically stable aryl¬propionamide-derived selective androgen receptor modulators for doping control purposes. – Rapid Commun. Mass Spectrom, 2006, v.20(5), p.870_876.
17. Narkar V.A., Downes M., Yu R.T, Embler E., Wang Y.X., Banayo E., Mihaylova M.M.,
Nelson M.C., Zou Y., Juguilon H., Kang H.,
Shaw R.J., Evans R.M. AMPK and PPARβ/δ agonists are exercise mimetics. – Cell, 2008, v.134(3), p.405_415.
в допинговом контроле
В Запрещенный список веществ и методов Всемирного антидопингового агентства (ВАДА) входят следующие классы веществ: кортикостероиды, диуретики, наркотические вещества, стимуляторы центральной нервной системы, анаболические стероиды, бета-адреноблокаторы, бета-2-агонисты, селективные модуляторы андрогенных рецепторов (СМАР), агонисты дельта-рецепторов активации пролиферации пероксисом (δ-РАПП), полипептидные гормоны и антиэстрогены [1]. Согласно требованиям ВАДА, предел обнаружения запрещенных веществ или/и их метаболитов должен составлять от 1 нг/мл до 500 нг/мл в зависимости от класса [2]. Для определения этих соединений в допинговом контроле широко используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс–спектрометрией (ВЭЖХ–МС/МС) [3]. Этот высокочувствительный метод требует эффективной очистки образца, чтобы снизить эффект подавления ионизации определяемых соединений компонентами матрицы. Традиционно для снижения влияния эффекта матрицы на ионизацию соединений веществ и их концентрирования используют жидкостно-жидкостную (ЖЖЭ) или твердофазную (ТФЭ) экстракцию.
Основные достоинства ЖЖЭ – универсальность, простота, доступность оборудования, а также возможность селективного концентрирования. Экстрагенты, применяемые в ЖЖЭ, должны хорошо извлекать определяемые соединения или группу веществ, обладать малой растворимостью в воде, иметь низкую температуру кипения. Недостатками ЖЖЭ являются расход большого количества растворителей, плохая кинетика экстракции, трудность автоматизации, а также возможное искажение состава пробы за счет потерь летучих соединений при упаривании экстракта и привнесения примесей из растворителей.
Переворотом в практике пробоподготовки стал предложенный более 30 лет назад простой и эффективный метод ТФЭ, основанный на выделении компонентов сорбцией на твердом носителе. ТФЭ основана на специфических взаимодействиях компонента с сорбентом и за счет этого объединила стадии концентрирования и извлечения. Адсорбция определяемых соединений происходит под воздействием различных нековалентных (обычно гидрофобных) сил сорбционного взаимодействия. Для ТФЭ характерны более широкие возможности варьирования природы и силы взаимодействия образца с сорбентом и элюентом, что позволяет более эффективно выделять определяемые соединения. Однако разработка методик с применением ТФЭ требует временных затрат для оптимизации условий ее проведения, а также определенного опыта и экспериментальных навыков специалиста.
В допинговом контроле традиционно для извлечения из мочи человека неконъюгированных веществ, таких как диуретики, стимуляторы и наркотики, применяют ЖЖЭ [4]. Для извлечения кортикостероидов, конъюгированных наркотических веществ и анаболических стероидов сначала проводят ферментативный гидролиз, а затем ТФЭ или ЖЖЭ [5, 6]. Рядом исследователей [7, 8] предложены методики одновременного определения кортикостероидов, диуретиков, стимуляторов, наркотиков и анаболических стероидов, что позволило сократить количество процедур, уменьшив тем самым затраты на проведение допингового контроля одной пробы. Однако проблема больших временных затрат остается актуальной, поскольку проведение ЖЖЭ и ТФЭ сопряжено с длительной процедурой упаривания.
Одним из перспективных способов извлечения полярных лекарственных препаратов и их метаболитов из биожидкостей человека и их концентрирования может стать магнитная сепарация (МС), имеющая ряд преимуществ перед классическими методами экстракции. Прежде всего, она экспресснее и проще в практическом применении.
Магнитная сепарация
Принцип МС заключается в концентрировании исследуемых соединений на поверхности микрочастиц со средним размером 1 мкм, модифицированной группами С18. Ядро микрочастиц содержит 106 нанокристаллов маггемита (γ-Fe2O3) диаметром около 8 нм, погруженных в полистирольную матрицу и покрытых тонким слоем полимера (рис. 1) [9, 10].
Нанокристаллы оксида железа придают микрочастицам суперпарамагнитные свойства*, благодаря чему микрочастицы мигрируют к магниту, только когда попадают в магнитное поле. После прекращения его действия они мгновенно теряют свои магнитные свойства и вновь превращаются в суспензию [11]. Это позволяет упростить и ускорить процедуру отбора экстракта после элюирования и исключить стадию упаривания. Время подготовки одного образца перед анализом составляет всего 5 минут. На рис.2 представлена блок-схема магнитной сепарации, на рис.3 – магнитный штатив для проведения сепарации.
МС уже нашла широкое применение в биохимии для извлечения клеток, субклеточных культур, белков и ДНК [12]. Магнитные микрочастицы используют для извлечения фенольных соединений из водных образцов [13] и противогрибкового средства интраконазола из плазмы крови человека [14]. Нами предложено использовать МС для извлечения лекарственных и допинговых средств из такой сложной матрицы, как моча человека [15].
Экстракции допинговых препаратов новых классов с применением ферромагнитных микрочастиц
При извлечении органических веществ из биожидкости человека с применением МС эффективность экстракции зависит от сродства определяемых соединений к поверхности частиц. Поэтому при выборе оптимальных условий проведения экстракции мы исследовали влияние природы, объема сорбента и элюирующих органических растворителей.
В качестве объектов исследования были выбраны допинговые препараты новых классов – селективные модуляторы андрогенных рецепторов (СМАР) и агонисты дельта-рецепторов активации пролиферации пероксисом (δ-РАПП). СМАР воздействуют на андрогенные рецепторы, ответственные за рост мышечных волокон, и обладают анаболическими свойствами, приводящими к увеличению мышечной массы и силы [16]. Активация δ-РАПП стимулирует сжигание жировых клеток, являющихся энергетическим депо живых организмов, что приводит к одновременному увеличению выносливости и силы за счет изменения метаболических процессов в мышечных тканях [17]. СМАР и агонисты δ-РАПП, находящиеся на заключительной стадии клинических испытаний, потенциально могут использоваться спортсменами в качестве допинга, поэтому с 2009 года они включены в Запрещенный список ВАДА.
Нами показано [15], что для экстракции из мочи СМАР и агонистов δ-РАПП целесообразно использовать 200 мкл суспензии с концентрацией 1,25 мг/мл (масса сорбента 0,25 мг) магнитных частиц с поверхностью, модифицированной группами C18, а в качестве растворителя (элюента) – 150 мкл метанола.
В табл.1 приведены аналитические характеристики разработанного способа одновременного определения δ-РАПП и СМАР с применением магнитной сепарации для их извлечения из мочи человека и последующим анализом полученного экстракта методом ВЭЖХ–МС/МС.
Во всем диапазоне изученных концентраций соединений (0,5–50 нг/мл) мы наблюдали селективное извлечение аналитов, причем не отмечали значимых изменений степени извлечения СМАР и δ-РАПП из мочи и их степени отмывки с микрочастиц от количества аналитов. Предел детектирования исследуемых соединений по массе составил 0,02–0,33 нг. Было проведено сравнение эффективности извлечения из мочи человека допинговых препаратов методом МС с традиционными способами экстракции, такими как ЖЖЭ и ТФЭ. Показано, что в случае МС степень извлечения аналитов была заметно выше, а эффект подавления ионизации определяемых соединений компонентами матрицы ниже. Стоит подчеркнуть, что извлечение и концентрирование СМАР и δ-РАПП с применением микрочастиц является более экспрессным, время подготовки одного образца для анализа методом ВЭЖХ–МС/МС составляет всего 5 минут.
Предложенный метод микроэкстракции обеспечивает высокую точность, эффективность и экспрессность всей аналитической процедуры с применением масс-спектрометрии.
Литература
1. World Anti-Doping Agency, The 2011 Prohibited List. International standard (2011).
URL: http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-Prohibited-list/To_be_effective/WADA_Prohibited_List_ 2011_ EN. pdf
2. World Anti-Doping Agency, Technical documents, Minimum required performance levels (2011). URL: http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-IS-Laboratories/WADA_TD2010MRPLv1.0_ Minimum%20Required%20Performance%20Levels_Sept%2001%202010_EN.pdf
3. Thevis M., Thomas A., Schänzer W. Current role of LC-MS(/MS) in doping control. – Anal. Bioanal. Chem., 2011, v.401(2), p.405-420.
4. Deventer K., Delbeke F.T., Roels K., Van Eenoo P. Screening for 18 diuretics and probenecid in doping analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. – Biomedical chromatography, 2002, v.16, p.529-535.
5. Cho H.J., Kim J.D., Lee W.Y., Chung B.C., Choi M.H. Quantitative metabolic profiling of 21 endogenous corticosteroids in urine by liquid chromatography-triple quadrupole-mass spectrometry. – Analytica Chimica Acta, 2009, v.632, p.101-108.
6. Gonzalo-Lumbreras, Pimentel-Trapero D., Izquierodo-Hornillos R. Solvent and solid-phase extraction of natural and synthetic anabolic steroids in human urine. – Journal of Chromatography B, 2001, v.754, p.419–425.
7. Дикунец М.А., Апполонова С.А., Родченков Г.М. Одновременное определение широкого круга неконьюгированных ксенобиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. – Журнал аналитической химии, 2009, т.64(8), с.854–864.
8. Kolmonen M., Leinonen A., Kuurann T., Pelander A., Ojanperä I. Generic sample preparation and dual polarity liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry for high-throughput screening in doping analysis. – Drug Testing and Analysis, 2009, v.1, p.250–266.
9. Fonnum G., Johansson C., Molteberg A.,
Morup S., Aksnes E. Characterisation of Dynabeads by magnetization measurement
and Mössbauer spectroscopy. – Journal of magnetism and magnetic materials, 2005, v.293(1), p.41–47.
10. Sinclair B. To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology. – The Scientist, 1998, v.12(13), p.17–20.
11. Fallesen T., Hill D.B., Steen M., Macosko J.C., Bonin K., Holzwarth G. Magnet polepiece design for uniform magnetic force on superparamagnetic beads. – Review of scientific instruments, 2010, v.81(7), p.074303-1-074303-5.
12. Hafeli U.O. Magnetically modulated therapeutic systems. - International Journal of Pharmaceutics, 2004, v.277(1), p.19–24.
13. Faraji M., Yamini Y., Rezaee M. Magnetic nanoparticles: synthesis, stabilization, functionalization, characterization and applications. – Journal of the Iranian Chemical Society, 2010, v.7(1), p.1–37.
14. Vogeser M., Geiger A., Herrmann R., Kobold U. Sample preparation for liquid chromatography-tandem mass spectrometry using functionalized ferromagnetic micro-particles. – Clinical Biochemistry, 2008, v.41(16-17), p.1417–1419.
15. Суханова И.И., Дикунец М.А., Вирюс Э.Д., Родченков Г.М. Магнитная сепарация как новый метод экстракции низкомолекулярных соединений из биожидкости человека. –Журнал аналитической химии, 2011, т.66(9), с.923–930.
16. Thevis M., Kamber M., Schänzer W. Screening for metabolically stable aryl¬propionamide-derived selective androgen receptor modulators for doping control purposes. – Rapid Commun. Mass Spectrom, 2006, v.20(5), p.870_876.
17. Narkar V.A., Downes M., Yu R.T, Embler E., Wang Y.X., Banayo E., Mihaylova M.M.,
Nelson M.C., Zou Y., Juguilon H., Kang H.,
Shaw R.J., Evans R.M. AMPK and PPARβ/δ agonists are exercise mimetics. – Cell, 2008, v.134(3), p.405_415.
Отзывы читателей
