eng
Выпуск #2/2012
Э.Вирюс, М.Дикунец, Т.Соболевский, Г.Родченков
Многокомпонентный скрининг допинговых препаратов методами жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии
Многокомпонентный скрининг допинговых препаратов методами жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии
Просмотры: 3553
Списки запрещенных к применению в спорте веществ
с каждым годом расширяются, появляются новые классы соединений, поэтому особо остро стоит вопрос разработки и внедрения новых подходов, позволяющих обнаружить большое число соединений разных классов в одной процедуре.
с каждым годом расширяются, появляются новые классы соединений, поэтому особо остро стоит вопрос разработки и внедрения новых подходов, позволяющих обнаружить большое число соединений разных классов в одной процедуре.
Теги: chromatography doping control mass spectrometry orbitrap допинговый контроль жидкостная хроматография масс-спектрометрия
История вопроса
Исторически многокомпонентный скрининг запрещенных органических веществ в аналитической практике допингового контроля был основан на применении метода газовой хроматографии/масс-спектрометрии с электронной ионизацией [1]. До 2008 года для каждого класса запрещенных веществ (анаболические стероиды, диуретики, стимуляторы, кортикостероиды, бета-блокаторы и т.д.) существовала отдельная процедура. В этих процедурах использовали селективные реагенты для дериватизации отдельных классов запрещенных веществ [2]. Исключительное положение метода газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией низкого и высокого разрешения в допинговых, токсикологических, клинических, экологических и ветеринарных лабораториях сохранялось до начала нашего века [3]. Такому положению дел мы обязаны чувствительности, селективности и универсальности метода, а также оригинальным способам дериватизации термолабильных и полярных соединений. Не стоит забывать о больших библиотеках масс-спектров (несколько сотен тысяч соединений), полученных с электронной ионизацией на протяжении сорока лет. На высокоэффективную жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию (ВЭЖХ/МС) обратили внимание после того, как в заметно расширенные списки запрещенных веществ все чаще стали входить вещества (кортикостероиды, гестринон, тетрагидрогестринон и т.д.), для которых существующие способы дериватизации перестали отвечать требованиям к продолжительности и стоимости анализа [4]. Согласитесь, что быстрое получение результатов всегда останется актуальным для любой аналитической лаборатории, а длительная стадия подготовки образцов к анализу или дериватизация этому не способствуют. Поэтому в начале 21 века ВЭЖХ/МС стала постепенно внедряться в аналитическую практику. Речь шла, главным образом, о ВЭЖХ/МС в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ/МС/МС) с ионизацией электрораспылением. В 2005 году в нашем центре был разработан способ определения кортикостероидов в моче с применением метода ВЭЖХ/МС/МС с ионной ловушкой в режиме регистрации отрицательных ионов [5]. На рис.1 представлена масс-хроматограмма мочи, содержащей кортикостероиды, полученная методом ВЭЖХ/МС/МС регистрацией отрицательно заряженных ионов. Тогда селективность метода нас приятно удивила. До создания универсальной процедуры скрининга оставалось несколько лет.
Безусловно, с появлением новых классов запрещенных веществ и ростом их числа мы все чаще стали задумываться о процедуре, включающей несколько классов запрещенных веществ (см. врезку). Список запрещенных веществ ВАДА объединяет вещества с различными физико-химическими и фармакологическими свойствами. От фармакологических свойств этих веществ зависят требования к чувствительности применяемых методов. В свою очередь, физико-химические свойства определяют условия пробоподготовки. Тем не менее, накопленный нами опыт применения ВЭЖХ/МС подсказывал, что данный метод имеет большой потенциал, когда речь идет о разработке процедуры многокомпонентного скрининга запрещенных веществ. В 2007 году в нашем центре был разработан способ одновременного скрининга стимуляторов, наркотиков, диуретиков, бета-блокаторов, кортикостероидов в моче методом ВЭЖХ/МС/МС с ионизацией электрораспылением. На рис. 2–4 приводятся масс-хроматограммы с применением данного способа [6]. Новизна выполненной нашим центром работы подтверждена авторским свидетельством [7]. Метод не только чрезвычайно чувствителен, но также исключает стадию дериватизации. На рис.5 приведена схема пробоподготовки для разработанного способа. В то время казалось, что теоретически, при эффективной ионизации всех определяемых веществ, можно создать одну процедуру, объединяющую все процедуры ("все в одном"). Очевидно, что уменьшение числа процедур приводит к снижению себестоимости анализа.
Орбитальная ионная
ловушка, Ваше слово
Как ни досадно было в этом признаться, несмотря на свои очевидные достоинства (высокая селективность и чувствительность), ВЭЖХ-тандемная масс-спекткрометрия имеет ограничения, которые несовместимы с "всеохватывающей" процедурой. К этим ограничениям относятся:
необходимость оптимизации условий детектирования (выбор ионапредшественника, иона-продукта, значение энергии столкновительной диссоциации) для каждого определяемого вещества (добавление новых веществ в процедуру становится проблемой, приводящей к значительным временным и финансовым затратам);
число детектируемых веществ в ходе одного анализа ограничено;
детектируются исключительно вещества, включенные в процеруру анализа (с появлением новых веществ необходимо обновлять условия инструментального определения);
необходимо задавать временные окна с установленными условиями детектирования для каждой группы определяемых соединений. На практике правильность задания временных окон требует постоянного внимания от аналитика (программное обеспечение, признанное решить эту проблему, приводит к снижению чувствительности);
Ретроспективный анализ полученных данных невозможен по определению.
Эти ограничения стали причиной нашего интереса к орбитальной ионной ловушке. Мы мечтали о методе, позволяющем определять неограниченное число веществ и проводить ретроспективный анализ. В 2008 году в качестве альтернативы тандемной масс-спектрометрии, нами предложен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с орбитальной ионной ловушкой для скрининга запрещенных веществ [8–10]. До нас метод использовали исключительно для задач протеомики и метаболомики [11]. Принцип метода основан на удерживании ионов в электростатическом поле. Квадрат частоты осцилляций ионов вдоль центрального электрода обратно пропорционален отношению массы к заряду. Технически это выглядит следующим образом. Между двумя аксиально-симметричными электродами прикладывают постоянное напряжение, добиваясь распределения электростатического потенциала в пространстве благодаря форме внешнего электрода. В этом случае создаваемое поле может рассматриваться как сумма квадрупольного поля в ловушке и логарифмического поля в цилиндрическом конденсаторе. Таким образом, ионы, оказавшись в ловушке, приобретают стабильные траектории [12]. Схема орбитальной ионной ловушки представлена на рис.6. Свою работу мы начинали на гибридном масс-спектрометре LTQ Orbitrap, включающем в себя линейную и орбитальную ионные ловушки (рис.7). В дальнейшем, чтобы повысить чувствительность метода, использвалась только орбитальная ионная ловушка.
Неоспоримыми достоинствами орбитальной ионной ловушки являются точность определения масс (несколько миллионых долей) и разрешение, которое может составлять 106 на половине высоты пика. Благодаря этим достоинствам нам удалось селективно детектировать запрещенные вещества в режиме полного сканирования в моче. Как видно из рис. 8–10, на хроматограммах практически отсутствуют интерференции. Мы не наблюдаем мешающего влияния компонентов матрицы при определении запрещенных веществ. Полное сканирование позволяет нам гипотетически одновременно детектировать неограниченное число веществ. Более того, с этим методом возможно ретроспективное исследование "старых" данных для обнаружения веществ, не оказавшихся по разным причинам в поле зрения аналитика.
Представим себе следующую ситуацию. Чтобы уйти от допингового контроля, спортсмен применяет новый допинговый препарат, который является небольшой модификацией существующего. В этом случае, чтобы его обнаружить, нам достаточно, используя возможности программного обеспечения, вернуться к старым данным и построить масс-хроматограмму с высокой точностью по характеристичным ионам этого препарата. Нам не нужно заново анализировать пробу спортсмена или хранить бесконечное число старых проб мочи. Прямая экономия средств и времени – мечта.
В 2011 году разработан способ обнаружения анаболических стероидов, кортикостероидов, диуретиков, стимуляторов, наркотиков, бета-агонистов, веществ с антиэстрогенной активностью и бета-блокаторов c применением нетривиальной электрораспытельной ионизации [13]. Сегодня мы предлагаем новый метод – с использованием фотоионизации при атмосферном давлении, который позволяет обнаружить в моче около 250 соединений. Подана заявка на получение авторского свидетельства на изобретение. Предложенный нами подход будет использован на Олимпиаде 2012 года в Лондоне.
Литература
1. Ayotte C., Goudreault D., Charlebois A. Testing for natural and synthetic anabolic agents in human urine. – Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1996, 687(1), p.3–25.
2. M. Tsivou, N.Kioukia-Fougia, E.Lyris, Y.Aggelis, A.Fragkaki, X.Kiousi, Ph.Simitsek, H.Dimopoulou, I.-P.Leontiou, M.Stamou, M.-H.Spyridaki, C.Georgakopoulos. An overview of the doping control analysis during the Olympic Games of 2004 in Athens, Greece. – Analytica Chimica Acta, V. 555, Issue 1, 2006, p. 1–13.
3. Marcos J., Pascual J.A., de la Torre X., Segura J. Fast screening of anabolic steroids and other banned doping substances in human urine by gas chromatography/tandem mass spectrometry – Journal of Mass Spectrometry, 2002, 37(10), p.1059–1073.
4. Catlin D.H, Sekera M.H, Ahrens B.D, Starcevic B., Chang Y.C., Hatton C.K. Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urine. – Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2004; 18(12), p.1245–1249
5. Дикунец М.А., Апполонова С.А., Родченков Г.М. Определение эндогенных и экзогенных глюкокортикоидов методом ВЭЖХ/МС в моче человека. – Химико-фармацевтический журнал, T 44, № 6, 2010, с.3–10.
6. Дикунец М.А. , Апполонова С.А. , Родченков Г.М. Одновременное определение широкого круга неконъюгированных ксенобиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. – Журнал аналитической химии, 2009, т. 64, № 8, с. 854–865.
7. Патент №2390773 РФ, МПК G01N 33/493, G01N 30/00, G01N 21/00. Способ определения ксенобиотиков в моче человека при допинговом контроле / ФГУП "Антидопинговый центр" (РФ). – Заявлено 05.06.2008; Опубл. 27.05.2010, Бюл. № 15.
8.Вирюс Э.Д., Родченков Г.M. Определение следовых количеств 6β-гидрокси-4-хлордегидрометилтестостерон в моче методом ВЭЖХ/Орбитальная масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией. – Заводская Лаборатория, 2008, 74 (7), с.17–21.
9. Virus E.D., Sobolevsky T.G., Rodchenkov G.M. Introduction of HPLC/orbitrap mass spectrometry as screening method for doping control. – Journal of Mass Spectrometry, 2008, 43(7), с.949–957.
10. Вирюс Э.Д, Соболевский Т.Г., Родченков Г.М. Обнаружение оксандролона и его метаболита в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии высокого разрешения с химической ионизацией при атмосферном давлении после прекращения приема. – Журнал аналитической химии. 2009, 64(1), с.31–35.
11.Yates Jr., Cociorva D., Liao L., Zabrouskov V. Performance of a linear ion trap-Orbitrap hybrid for peptide analysis. – Analytical Chemistry, 2006, 78(2), p.493–500.
12.Hu Q, Noll R.J., Li H., Makarov A., Hardman M., Graham Cooks R. The Orbitrap: a new mass spectrometer. – Journal of Mass Spectrometry, 2005, Apr, 40(4), p.430–443.
13.Virus E.D., Sobolevsky T.G, Rodchenkov G.M. Wrong-way-round ionization and screening for doping substances in human urine by high-performance liquid chromatography/orbitrap mass spectrometry – Journal of Mass Spectrometry, 2012, March, 47(3), p.381–391.
Исторически многокомпонентный скрининг запрещенных органических веществ в аналитической практике допингового контроля был основан на применении метода газовой хроматографии/масс-спектрометрии с электронной ионизацией [1]. До 2008 года для каждого класса запрещенных веществ (анаболические стероиды, диуретики, стимуляторы, кортикостероиды, бета-блокаторы и т.д.) существовала отдельная процедура. В этих процедурах использовали селективные реагенты для дериватизации отдельных классов запрещенных веществ [2]. Исключительное положение метода газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией низкого и высокого разрешения в допинговых, токсикологических, клинических, экологических и ветеринарных лабораториях сохранялось до начала нашего века [3]. Такому положению дел мы обязаны чувствительности, селективности и универсальности метода, а также оригинальным способам дериватизации термолабильных и полярных соединений. Не стоит забывать о больших библиотеках масс-спектров (несколько сотен тысяч соединений), полученных с электронной ионизацией на протяжении сорока лет. На высокоэффективную жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию (ВЭЖХ/МС) обратили внимание после того, как в заметно расширенные списки запрещенных веществ все чаще стали входить вещества (кортикостероиды, гестринон, тетрагидрогестринон и т.д.), для которых существующие способы дериватизации перестали отвечать требованиям к продолжительности и стоимости анализа [4]. Согласитесь, что быстрое получение результатов всегда останется актуальным для любой аналитической лаборатории, а длительная стадия подготовки образцов к анализу или дериватизация этому не способствуют. Поэтому в начале 21 века ВЭЖХ/МС стала постепенно внедряться в аналитическую практику. Речь шла, главным образом, о ВЭЖХ/МС в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ/МС/МС) с ионизацией электрораспылением. В 2005 году в нашем центре был разработан способ определения кортикостероидов в моче с применением метода ВЭЖХ/МС/МС с ионной ловушкой в режиме регистрации отрицательных ионов [5]. На рис.1 представлена масс-хроматограмма мочи, содержащей кортикостероиды, полученная методом ВЭЖХ/МС/МС регистрацией отрицательно заряженных ионов. Тогда селективность метода нас приятно удивила. До создания универсальной процедуры скрининга оставалось несколько лет.
Безусловно, с появлением новых классов запрещенных веществ и ростом их числа мы все чаще стали задумываться о процедуре, включающей несколько классов запрещенных веществ (см. врезку). Список запрещенных веществ ВАДА объединяет вещества с различными физико-химическими и фармакологическими свойствами. От фармакологических свойств этих веществ зависят требования к чувствительности применяемых методов. В свою очередь, физико-химические свойства определяют условия пробоподготовки. Тем не менее, накопленный нами опыт применения ВЭЖХ/МС подсказывал, что данный метод имеет большой потенциал, когда речь идет о разработке процедуры многокомпонентного скрининга запрещенных веществ. В 2007 году в нашем центре был разработан способ одновременного скрининга стимуляторов, наркотиков, диуретиков, бета-блокаторов, кортикостероидов в моче методом ВЭЖХ/МС/МС с ионизацией электрораспылением. На рис. 2–4 приводятся масс-хроматограммы с применением данного способа [6]. Новизна выполненной нашим центром работы подтверждена авторским свидетельством [7]. Метод не только чрезвычайно чувствителен, но также исключает стадию дериватизации. На рис.5 приведена схема пробоподготовки для разработанного способа. В то время казалось, что теоретически, при эффективной ионизации всех определяемых веществ, можно создать одну процедуру, объединяющую все процедуры ("все в одном"). Очевидно, что уменьшение числа процедур приводит к снижению себестоимости анализа.
Орбитальная ионная
ловушка, Ваше слово
Как ни досадно было в этом признаться, несмотря на свои очевидные достоинства (высокая селективность и чувствительность), ВЭЖХ-тандемная масс-спекткрометрия имеет ограничения, которые несовместимы с "всеохватывающей" процедурой. К этим ограничениям относятся:
необходимость оптимизации условий детектирования (выбор ионапредшественника, иона-продукта, значение энергии столкновительной диссоциации) для каждого определяемого вещества (добавление новых веществ в процедуру становится проблемой, приводящей к значительным временным и финансовым затратам);
число детектируемых веществ в ходе одного анализа ограничено;
детектируются исключительно вещества, включенные в процеруру анализа (с появлением новых веществ необходимо обновлять условия инструментального определения);
необходимо задавать временные окна с установленными условиями детектирования для каждой группы определяемых соединений. На практике правильность задания временных окон требует постоянного внимания от аналитика (программное обеспечение, признанное решить эту проблему, приводит к снижению чувствительности);
Ретроспективный анализ полученных данных невозможен по определению.
Эти ограничения стали причиной нашего интереса к орбитальной ионной ловушке. Мы мечтали о методе, позволяющем определять неограниченное число веществ и проводить ретроспективный анализ. В 2008 году в качестве альтернативы тандемной масс-спектрометрии, нами предложен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с орбитальной ионной ловушкой для скрининга запрещенных веществ [8–10]. До нас метод использовали исключительно для задач протеомики и метаболомики [11]. Принцип метода основан на удерживании ионов в электростатическом поле. Квадрат частоты осцилляций ионов вдоль центрального электрода обратно пропорционален отношению массы к заряду. Технически это выглядит следующим образом. Между двумя аксиально-симметричными электродами прикладывают постоянное напряжение, добиваясь распределения электростатического потенциала в пространстве благодаря форме внешнего электрода. В этом случае создаваемое поле может рассматриваться как сумма квадрупольного поля в ловушке и логарифмического поля в цилиндрическом конденсаторе. Таким образом, ионы, оказавшись в ловушке, приобретают стабильные траектории [12]. Схема орбитальной ионной ловушки представлена на рис.6. Свою работу мы начинали на гибридном масс-спектрометре LTQ Orbitrap, включающем в себя линейную и орбитальную ионные ловушки (рис.7). В дальнейшем, чтобы повысить чувствительность метода, использвалась только орбитальная ионная ловушка.
Неоспоримыми достоинствами орбитальной ионной ловушки являются точность определения масс (несколько миллионых долей) и разрешение, которое может составлять 106 на половине высоты пика. Благодаря этим достоинствам нам удалось селективно детектировать запрещенные вещества в режиме полного сканирования в моче. Как видно из рис. 8–10, на хроматограммах практически отсутствуют интерференции. Мы не наблюдаем мешающего влияния компонентов матрицы при определении запрещенных веществ. Полное сканирование позволяет нам гипотетически одновременно детектировать неограниченное число веществ. Более того, с этим методом возможно ретроспективное исследование "старых" данных для обнаружения веществ, не оказавшихся по разным причинам в поле зрения аналитика.
Представим себе следующую ситуацию. Чтобы уйти от допингового контроля, спортсмен применяет новый допинговый препарат, который является небольшой модификацией существующего. В этом случае, чтобы его обнаружить, нам достаточно, используя возможности программного обеспечения, вернуться к старым данным и построить масс-хроматограмму с высокой точностью по характеристичным ионам этого препарата. Нам не нужно заново анализировать пробу спортсмена или хранить бесконечное число старых проб мочи. Прямая экономия средств и времени – мечта.
В 2011 году разработан способ обнаружения анаболических стероидов, кортикостероидов, диуретиков, стимуляторов, наркотиков, бета-агонистов, веществ с антиэстрогенной активностью и бета-блокаторов c применением нетривиальной электрораспытельной ионизации [13]. Сегодня мы предлагаем новый метод – с использованием фотоионизации при атмосферном давлении, который позволяет обнаружить в моче около 250 соединений. Подана заявка на получение авторского свидетельства на изобретение. Предложенный нами подход будет использован на Олимпиаде 2012 года в Лондоне.
Литература
1. Ayotte C., Goudreault D., Charlebois A. Testing for natural and synthetic anabolic agents in human urine. – Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1996, 687(1), p.3–25.
2. M. Tsivou, N.Kioukia-Fougia, E.Lyris, Y.Aggelis, A.Fragkaki, X.Kiousi, Ph.Simitsek, H.Dimopoulou, I.-P.Leontiou, M.Stamou, M.-H.Spyridaki, C.Georgakopoulos. An overview of the doping control analysis during the Olympic Games of 2004 in Athens, Greece. – Analytica Chimica Acta, V. 555, Issue 1, 2006, p. 1–13.
3. Marcos J., Pascual J.A., de la Torre X., Segura J. Fast screening of anabolic steroids and other banned doping substances in human urine by gas chromatography/tandem mass spectrometry – Journal of Mass Spectrometry, 2002, 37(10), p.1059–1073.
4. Catlin D.H, Sekera M.H, Ahrens B.D, Starcevic B., Chang Y.C., Hatton C.K. Tetrahydrogestrinone: discovery, synthesis, and detection in urine. – Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2004; 18(12), p.1245–1249
5. Дикунец М.А., Апполонова С.А., Родченков Г.М. Определение эндогенных и экзогенных глюкокортикоидов методом ВЭЖХ/МС в моче человека. – Химико-фармацевтический журнал, T 44, № 6, 2010, с.3–10.
6. Дикунец М.А. , Апполонова С.А. , Родченков Г.М. Одновременное определение широкого круга неконъюгированных ксенобиотиков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией. – Журнал аналитической химии, 2009, т. 64, № 8, с. 854–865.
7. Патент №2390773 РФ, МПК G01N 33/493, G01N 30/00, G01N 21/00. Способ определения ксенобиотиков в моче человека при допинговом контроле / ФГУП "Антидопинговый центр" (РФ). – Заявлено 05.06.2008; Опубл. 27.05.2010, Бюл. № 15.
8.Вирюс Э.Д., Родченков Г.M. Определение следовых количеств 6β-гидрокси-4-хлордегидрометилтестостерон в моче методом ВЭЖХ/Орбитальная масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией. – Заводская Лаборатория, 2008, 74 (7), с.17–21.
9. Virus E.D., Sobolevsky T.G., Rodchenkov G.M. Introduction of HPLC/orbitrap mass spectrometry as screening method for doping control. – Journal of Mass Spectrometry, 2008, 43(7), с.949–957.
10. Вирюс Э.Д, Соболевский Т.Г., Родченков Г.М. Обнаружение оксандролона и его метаболита в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии высокого разрешения с химической ионизацией при атмосферном давлении после прекращения приема. – Журнал аналитической химии. 2009, 64(1), с.31–35.
11.Yates Jr., Cociorva D., Liao L., Zabrouskov V. Performance of a linear ion trap-Orbitrap hybrid for peptide analysis. – Analytical Chemistry, 2006, 78(2), p.493–500.
12.Hu Q, Noll R.J., Li H., Makarov A., Hardman M., Graham Cooks R. The Orbitrap: a new mass spectrometer. – Journal of Mass Spectrometry, 2005, Apr, 40(4), p.430–443.
13.Virus E.D., Sobolevsky T.G, Rodchenkov G.M. Wrong-way-round ionization and screening for doping substances in human urine by high-performance liquid chromatography/orbitrap mass spectrometry – Journal of Mass Spectrometry, 2012, March, 47(3), p.381–391.
Отзывы читателей
