eng
Выпуск #3/2012
С.Антонова, Б.Тяглов, Е.Барсуков, Н.Демина, Н.Румянцева, Л.Эрраис Лопес, Н.Королькова, К.Лобанов, Р.Шакулов, А.Миронов
Количественный хроматографический анализ культуральных жидкостей штаммов-продуцентов акадезина
Количественный хроматографический анализ культуральных жидкостей штаммов-продуцентов акадезина
Просмотры: 3811
Акадезин (AICAR) – новый препарат широкого терапевтического применения. Он привлекает к себе внимание как лечебное, так и профилактическое средство, интересен он и для спорта. Для определения содержания нуклеозида акадезина в культуральных жидкостях (КЖ) авторы разработали и валидировали метод количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ТСХ) с последующей денситометрией. В качестве референсного метода использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
Акадезин (AICAR) – природное соединение, аналог и предшественник аденозина. Будучи активатором протеинкиназы, активируемой AMP (AMPK), акадезин имеет широкий терапевтический потенциал, поскольку он нормализует углеводный и липидный обмен и ограничивает пролиферацию опухолевых клеток [1–3]. Известна его эффективность в предупреждении сахарного диабета второго типа, нельзя переоценить его роль и при лечении хронических и острых лейкозов. Все эти факторы обусловили большой интерес к изучению свойств нуклеозида акадезина, методам его получения и количественного определения. Цель настоящей работы – разработка и валидация методики хроматографического количественного определения акадезина в культуральных жидкостях.
Материалы и методы
Для получения акадезина была выбрана культура Bacillus subtilis. Синтез акадезина в клетках Bacillus subtilis контролируется ферментами биосинтеза пуринов, гены которых входят в состав пуринового оперона (pur–оперона). Ранее нами была проведена реконструкция пуринового метаболизма в клетках штамма B.subtilis, направленная на сверхпродукцию акадезина [4]. С этой целью из генома B. subtilis был удален ген purH, кодирующий формилтрансферазу/IMP-циклогидролазу – фермент, контролирующий превращение акадезина в IMP, что обеспечивает накопление акадезина. Кроме того, в геноме штамм-продуцента были получены мутации, обеспечивающие повышенный уровень синтеза пуриновых нуклеотидов и их предшественников [4].
Органические растворители очищали согласно методикам [5]. Вода была получена на установке Super Q (Millipore, США). Использовали стандарты акадезина, инозина и гипоксантина фирмы Sigma, (США). Стандартные растворы в концентрациях 0,1; 0,25; 0,5 и 0,75 мг/мл готовили в воде и хранили при температуре 4°С. Срок хранения растворов 2 недели. Дополнительный контроль концентрации стандартных растворов акадезина осуществляли с помощью метода спектрофотометрии [6].
Пробы КЖ тщательно перемешивали, отбирали аликвоты по 1,0 мл, центрифугировали на центрифуге MiniSpin фирмы Eppendorf (Германия) при 16100 g в течение 15–20 мин, надосадочную жидкость разбавляли водой таким образом, чтобы содержание акадезина в подготовленных пробах находилось бы в пределах от 0,15 до 0,75 мг/мл. Анализ проб проводили в день приготовления.
Для ТСХ использовали стандартные пластинки "Сорбфил" ПТСХ-АФ-В-УФ размером 10×15 см, ТУ 26-11-17-89, АО "Сорбполимер" (Краснодар), изготовленные по технологии, разработанной в НТЦ "Ленхром" (Санкт-Петербург). ТСХ-пластинки промывали смесью хлороформ-метанол (1:1) и активировали в течение 30 мин. при 110-115°С в сушильном шкафу. Растворы стандартных образцов и проб КЖ наносили на пластинки с помощью автоматического аппликатора ATS-4 фирмы CAMAG, (Швейцария). Объем наносимых проб – 0,5 мкл.
Хроматографию осуществляли восходящим методом в стеклянной камере (22,5×29,0×16,0 см) производства НТЦ "Ленхром". Подвижная фаза состояла из хлороформа, метанола и 25%-ного водного раствора аммиака. Насыщение камеры – 1 ч. Время разделения составило 20–25 мин. После элюирования хроматограмму выдерживали в течение 10 мин. при 200С. Для визуализации пятен нуклеозидов использовали трансиллюминатор модели UVP-300 фирмы Ultraviolet Products (США).
Количественное определение нуклеозидов осуществляли на денситометрах CS-920 фирмы Shimadzu (Япония) и TLC Scanner 3 фирмы Camag, (Швейцария) при длине волны 265 нм. Статистическая обработка полученных результатов проводилась согласно методике [7].
Для количественного анализа нуклеозидов в КЖ использовался также метод ВЭЖХ. Хроматограф для ВЭЖХ – Alliance (Separation Module, Waters 2695 и Photodiode Array Detector, Waters 2996) фирмы Waters (США). Колонка (С-18, выполненная из нержавеющей стали, 250,0×4,0 мм, 5 мкм. Температура колонки 30°С. Объем инжекции 5,0 мкл. Подвижная фаза: 2,5%-ный этиловый спирт в ацетатном буфере (0,005 М), содержащем 10-3 М азида натрия, рН – 4,7. Скорость потока элюента – 1,0 мл/мин. Длина волны детектирования – 265 нм. Прием и обработку данных производили с использованием программного обеспечения Empower Pro (США).
Результаты и обсуждение
Количественное определение
акадезина в КЖ методами ТСХ и ВЭЖХ
Ранее определение нуклеозидов с помощью метода ТСХ проводилось с использованием стационарной фазы на основе силикагеля и целлюлозы, а также ее модифицированных форм производства фирмы Merck (Германия) [8–10]. ТСХ пластинки на основе целлюлозы в России в промышленном масштабе не выпускаются. ТСХ пластинки Kieselgel 60 фирмы Merck имеют "химию поверхности" активного слоя существенно отличную от пластинок "Сорбфил", поэтому предложенные ранее подвижные фазы неэффективны для отечественных пластинок. Учитывая это обстоятельство, мы разработали подходящую подвижную фазу с помощью модели "Призма", которая широко используется для конструирования подвижных фаз в ТСХ и ВЭЖХ [11]. Ее состав: хлороформ – метанол – 25%-ный водный раствор аммиака, при этом время разделения составило 20–25 мин (l=70 мм), t=20°С, пятно акадезина имело круглую компактную форму. Предел обнаружения акадезина – 0,05 мкг в пятне.
Количественную обработку хроматограмм осуществляли с помощью денситометров сразу же после проведения элюирования. На рис.1 представлена денситограмма КЖ штамма-продуцента акадезина. Было установлено, что зависимость величин денситометрических сигналов акадезина линейна в диапазоне от 0,1 до 0,75 мкг в пятне. Градуировочный график был выполнен по четырем точкам веществ-стандартов, взятых в трех повторениях (0,1; 0,25; 0,5 и 0,75 мкг в пятне), r = 0,9963. Предел количественного определения акадезина – 0,1 мкг в пятне.
Для количественного определения акадезина в пробах КЖ также использовалась ВЭЖХ в качестве референсного метода. Была разработана подвижная фаза: 2,5%-ный этиловый спирт в 0,005 М натрийацетатном буфере, содержащем 10-3 М азида натрия, рН – 4,7. Эта фаза позволила осуществить селективное разделение акадезина в виде основания, гипоксантина, акадезина, инозина, гуанозина, аденина и аденозина. Хроматограмма и величины времен удерживания акадезина и минорных примесей показаны на рис.2.
В таблице 1 представлены результаты измерения акадезина в различных партиях КЖ, полученные методами ТСХ и ВЭЖХ. Как можно видеть из таблицы, результаты обоих методов хорошо коррелируют друг с другом (r = 0,99350).
С практической точки зрения важно знать, как долго и в каких условиях можно хранить стерильную КЖ штамма-продуцента акадезина. Для этих целей в конце ферментации (72 часа) КЖ стерильно разливали по пробиркам и выдерживали 2,4,6,8 и 10 суток при температурах 20°С, 4° С и -18° С. По истечении каждого из этих сроков пробы анализировали методом хроматоденситометрии (таб.2). Было установлено, что при хранении КЖ при указанных выше температурах в течение 10 суток содержание акадезина в КЖ не изменяется.
Валидация методики количественного определения акадезина методом хроматоденситометрии
Согласно требованиям ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 неотъемлемая часть современного количественного анализа – валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает в себя следующие характеристики: специфичность, линейную зависимость, правильность (точность), предел обнаружения, предел количественного определения, пригодность системы [12–13]. Молекула акадезина имеет имидазольный цикл, который может быть нестабильным ввиду следующих причин: взаимодействие растворителя с молекулой акадезина, фотохимическое разложение в растворе, деструкция молекулы акадезина, обусловленная разложением на активной поверхности слоя силикагеля [13–14]. Известно, что акадезин устойчив в водных и водно-спиртовых растворах в течение нескольких суток при комнатной температуре [4].
Для доказательства устойчивости акадезина на слое силикагеля были проведены следующие предвалидационные тесты:
• проведена двумерная хроматография акадезина, показано, что он после двумерного элюирования дает только одно пятно. Условия проведения анализа для акадезина: элюент – хлороформ-метанол-25%-ный водный раствор аммиака, t = 20°С, насыщение камеры 1 ч, содержание акадезина в пятне 0,5 мкг. Дополнительная идентификация гомогенности пятен акадезина, полученных при разделении, была проведена с помощью метода ВЭЖХ, после элюирования пятен с хроматограммы. Установлено, что акадезин практически не содержал примесей и элюировался в виде одного острого симметричного пика;
• проведена хроматография растворов одних и тех же проб акадезина в следующие промежутки времени: 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин, при этом установлено, что акадезин элюируется одним пятном, при этом интенсивность этих пятен не изменяется. Условия проведения анализа аналогичны предыдущим;
• пробы акадезина наносили на пластинки, после чего проводилось элюирование этих пластинок через: 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин. Пластинки выдерживались в лабораторном помещении, при комнатной температуре 20–25°С в незащищенном от света месте. Было обнаружено, что акадезин проявляется одним пятном и интенсивность этого пятна не изменяется. Только в случае, когда пятна акадезина выдерживались на хроматограмме более 180 мин, они приобретали желтый цвет и хроматографировались в виде трех хроматографических зон различной интенсивности.
Полученные таким образом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что акадезин устойчив на тонких слоях силикагеля в течение 180 мин, по истечении этого срока его молекулы подвергаются деструкции (скорее всего, окислению имидазольного цикла).
Разработанная нами подвижная фаза для разделения компонентов КЖ штамма-продуцента акадезина является весьма селективной, величины ΔRf >> 0,05 (для пятен акадезина, инозина и гипоксантина). Гомогенность соединений в пятнах, принадлежащих акадезину, гипоксантину и инозину, была подтверждена данными ВЭЖХ после элюирования последних из соответствующих хроматографических зон. Таким образом, показана специфичность разработанной методики, поскольку она позволяет достоверно определять как акадезин, так и сопутствующие ему компоненты в КЖ.
Было установлено, что аналитическая область методики, в пределах которой соблюдается линейная зависимость, охватывает интервал для акадезина от 0,1 до 0,75 мкг в пятне (включая эти пределы).
Правильность (точность) [Precision] разработанной в пределах аналитической области методики, иллюстрируют результаты, представленные в табл.2. Кроме того, данные, представленные в табл.3, демонстрируют хорошую внутрилабораторную воспроизводимость результатов. Была также проверена межлабораторная воспроизводимость результатов (табл.4). Видно, что результаты, полученные на межлабораторных испытаниях, хорошо коррелируют друг с другом. Предел обнаружения акадезина составляет 0,05 мкг. Предел количественного определения акадезина – 0,1 мкг в пятне (S/N=20).
Мы исследовали зависимость селективности разделения от величины объемного содержания хлороформа и метанола, входящих в состав подвижной фазы. Было установлено, что величины ΔRf пятен акадезина, гипоксантина и инозина практически не изменяются (ΔRf=±0,05, n =5, P 0,95) в интервале содержания хлороформа от 13,0 до 15,5% ( по объему) и метанола от 8,5 до 11,0% ( по объему).
Температура в интервале от 15 до 35°С и время насыщения камеры от 30 до 120 минут также не оказывают влияния на величины ΔRf =±0,05 ( n =5, P 0,95) акадезина, гипоксантина и инозина.
Использование ВЭТСХ пластинок "Сорбфил" (предварительно промытых и активированных) различных партий также не вызывает изменений селективности разделения (robustness, ruggedness).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о пригодности разработанной нами методики как для количественного определения акадезина, так и сопутствующих ему в КЖ примесей.
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (ГК №16.522.11.7029) с использованием оборудования ЦКП ФГУП "ГосНИИгенетика".
ЛИТЕРАТУРА
1. Rutter GA, Da Silva Xavier G, Leclerc I. Roles of 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) in mammalian glucose homoeostasis. – Biochemical Journal, 2003,v.375(2), p.1–16.
2. Fediuc S., Anthony N.M, So M., Mirpourian M., Perry R.L., Ceddia R.B. Prolonged AICAR-induced AMP-kinase activation promotes energy dissipation in white adipocytes: novel mechanisms integrating HSL and ATGL. – Journal of Lipid Research, 2009, v.50(4), p. 704–715.
3. Swinnen J.V., Beckers A., Brusselmans K., et al. Mimicry of a cellular low energy status blocks tumor cell anabolism and suppresses the malignant phenotype. – Cancer Research, 2005, v.65,
p.2441–2448.
4. Лобанов К.В., Эрраис Лопес Л., Королькова Н.В.и др. Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AICAR – нового препарата широкого терапевтического применения. – Acta Naturae, 2011, т.2(9), c.83–93.
5. Perrin D.D. Purification of Laboratory Chemicals. – N-Y-London – Pergamon Press, 1988. – 530 p.
6. Досон Р., Эллиот Д., Джонс К. Справочник биохимика. – М:, Мир, 1991, c. 14.
7. Государственная фармакопея СССР. – 11-е изд., М.: Медицина,1987, c. 163–187.
8. Sequars J.M., Direct analysis of high-performance thin-layer chromatography spots of nucleic purine derivatives. – Analytical Chemistry, 1987, v.59(3),
p. 525–537.
9. Bocher B.R., Ames B.N. Complete analysis of cellular nucleotides in thin-layer chromatography. – Journal Biological Chemistry, 1982, v.257(16),
p. 9759–9769.
10. Pfeifer A.M., Toliman G., Kovar K.A. Identification of adenosine in biological samples by HPTLC. – Journal Planar Chromatography, 1996, v.9, p. 31–34.
11. Nyiredy S.Z., Evdelmeier S.A. TLC mobile phase optimization procedure using “PRIZMA" model. – Planta Medica, 1985, N2, p. 241 – 252.
12. Sun S.W., Fabry H. Test procedure validation for the TLC assay of degradation products in pharmaceutical formulation. – Journal Liquid Chromatography, 1994, v.17, p. 2495–2509.
13. Renger B., Vegh Z. Validation of thin layer and high performance thin layer chromatographic methods. – Journal of Chromatography, 2011, v.1218, p. 2712–2721.
14. Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. – Спб.: Химиздат, 2005. – 232 с.
Материалы и методы
Для получения акадезина была выбрана культура Bacillus subtilis. Синтез акадезина в клетках Bacillus subtilis контролируется ферментами биосинтеза пуринов, гены которых входят в состав пуринового оперона (pur–оперона). Ранее нами была проведена реконструкция пуринового метаболизма в клетках штамма B.subtilis, направленная на сверхпродукцию акадезина [4]. С этой целью из генома B. subtilis был удален ген purH, кодирующий формилтрансферазу/IMP-циклогидролазу – фермент, контролирующий превращение акадезина в IMP, что обеспечивает накопление акадезина. Кроме того, в геноме штамм-продуцента были получены мутации, обеспечивающие повышенный уровень синтеза пуриновых нуклеотидов и их предшественников [4].
Органические растворители очищали согласно методикам [5]. Вода была получена на установке Super Q (Millipore, США). Использовали стандарты акадезина, инозина и гипоксантина фирмы Sigma, (США). Стандартные растворы в концентрациях 0,1; 0,25; 0,5 и 0,75 мг/мл готовили в воде и хранили при температуре 4°С. Срок хранения растворов 2 недели. Дополнительный контроль концентрации стандартных растворов акадезина осуществляли с помощью метода спектрофотометрии [6].
Пробы КЖ тщательно перемешивали, отбирали аликвоты по 1,0 мл, центрифугировали на центрифуге MiniSpin фирмы Eppendorf (Германия) при 16100 g в течение 15–20 мин, надосадочную жидкость разбавляли водой таким образом, чтобы содержание акадезина в подготовленных пробах находилось бы в пределах от 0,15 до 0,75 мг/мл. Анализ проб проводили в день приготовления.
Для ТСХ использовали стандартные пластинки "Сорбфил" ПТСХ-АФ-В-УФ размером 10×15 см, ТУ 26-11-17-89, АО "Сорбполимер" (Краснодар), изготовленные по технологии, разработанной в НТЦ "Ленхром" (Санкт-Петербург). ТСХ-пластинки промывали смесью хлороформ-метанол (1:1) и активировали в течение 30 мин. при 110-115°С в сушильном шкафу. Растворы стандартных образцов и проб КЖ наносили на пластинки с помощью автоматического аппликатора ATS-4 фирмы CAMAG, (Швейцария). Объем наносимых проб – 0,5 мкл.
Хроматографию осуществляли восходящим методом в стеклянной камере (22,5×29,0×16,0 см) производства НТЦ "Ленхром". Подвижная фаза состояла из хлороформа, метанола и 25%-ного водного раствора аммиака. Насыщение камеры – 1 ч. Время разделения составило 20–25 мин. После элюирования хроматограмму выдерживали в течение 10 мин. при 200С. Для визуализации пятен нуклеозидов использовали трансиллюминатор модели UVP-300 фирмы Ultraviolet Products (США).
Количественное определение нуклеозидов осуществляли на денситометрах CS-920 фирмы Shimadzu (Япония) и TLC Scanner 3 фирмы Camag, (Швейцария) при длине волны 265 нм. Статистическая обработка полученных результатов проводилась согласно методике [7].
Для количественного анализа нуклеозидов в КЖ использовался также метод ВЭЖХ. Хроматограф для ВЭЖХ – Alliance (Separation Module, Waters 2695 и Photodiode Array Detector, Waters 2996) фирмы Waters (США). Колонка (С-18, выполненная из нержавеющей стали, 250,0×4,0 мм, 5 мкм. Температура колонки 30°С. Объем инжекции 5,0 мкл. Подвижная фаза: 2,5%-ный этиловый спирт в ацетатном буфере (0,005 М), содержащем 10-3 М азида натрия, рН – 4,7. Скорость потока элюента – 1,0 мл/мин. Длина волны детектирования – 265 нм. Прием и обработку данных производили с использованием программного обеспечения Empower Pro (США).
Результаты и обсуждение
Количественное определение
акадезина в КЖ методами ТСХ и ВЭЖХ
Ранее определение нуклеозидов с помощью метода ТСХ проводилось с использованием стационарной фазы на основе силикагеля и целлюлозы, а также ее модифицированных форм производства фирмы Merck (Германия) [8–10]. ТСХ пластинки на основе целлюлозы в России в промышленном масштабе не выпускаются. ТСХ пластинки Kieselgel 60 фирмы Merck имеют "химию поверхности" активного слоя существенно отличную от пластинок "Сорбфил", поэтому предложенные ранее подвижные фазы неэффективны для отечественных пластинок. Учитывая это обстоятельство, мы разработали подходящую подвижную фазу с помощью модели "Призма", которая широко используется для конструирования подвижных фаз в ТСХ и ВЭЖХ [11]. Ее состав: хлороформ – метанол – 25%-ный водный раствор аммиака, при этом время разделения составило 20–25 мин (l=70 мм), t=20°С, пятно акадезина имело круглую компактную форму. Предел обнаружения акадезина – 0,05 мкг в пятне.
Количественную обработку хроматограмм осуществляли с помощью денситометров сразу же после проведения элюирования. На рис.1 представлена денситограмма КЖ штамма-продуцента акадезина. Было установлено, что зависимость величин денситометрических сигналов акадезина линейна в диапазоне от 0,1 до 0,75 мкг в пятне. Градуировочный график был выполнен по четырем точкам веществ-стандартов, взятых в трех повторениях (0,1; 0,25; 0,5 и 0,75 мкг в пятне), r = 0,9963. Предел количественного определения акадезина – 0,1 мкг в пятне.
Для количественного определения акадезина в пробах КЖ также использовалась ВЭЖХ в качестве референсного метода. Была разработана подвижная фаза: 2,5%-ный этиловый спирт в 0,005 М натрийацетатном буфере, содержащем 10-3 М азида натрия, рН – 4,7. Эта фаза позволила осуществить селективное разделение акадезина в виде основания, гипоксантина, акадезина, инозина, гуанозина, аденина и аденозина. Хроматограмма и величины времен удерживания акадезина и минорных примесей показаны на рис.2.
В таблице 1 представлены результаты измерения акадезина в различных партиях КЖ, полученные методами ТСХ и ВЭЖХ. Как можно видеть из таблицы, результаты обоих методов хорошо коррелируют друг с другом (r = 0,99350).
С практической точки зрения важно знать, как долго и в каких условиях можно хранить стерильную КЖ штамма-продуцента акадезина. Для этих целей в конце ферментации (72 часа) КЖ стерильно разливали по пробиркам и выдерживали 2,4,6,8 и 10 суток при температурах 20°С, 4° С и -18° С. По истечении каждого из этих сроков пробы анализировали методом хроматоденситометрии (таб.2). Было установлено, что при хранении КЖ при указанных выше температурах в течение 10 суток содержание акадезина в КЖ не изменяется.
Валидация методики количественного определения акадезина методом хроматоденситометрии
Согласно требованиям ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 неотъемлемая часть современного количественного анализа – валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает в себя следующие характеристики: специфичность, линейную зависимость, правильность (точность), предел обнаружения, предел количественного определения, пригодность системы [12–13]. Молекула акадезина имеет имидазольный цикл, который может быть нестабильным ввиду следующих причин: взаимодействие растворителя с молекулой акадезина, фотохимическое разложение в растворе, деструкция молекулы акадезина, обусловленная разложением на активной поверхности слоя силикагеля [13–14]. Известно, что акадезин устойчив в водных и водно-спиртовых растворах в течение нескольких суток при комнатной температуре [4].
Для доказательства устойчивости акадезина на слое силикагеля были проведены следующие предвалидационные тесты:
• проведена двумерная хроматография акадезина, показано, что он после двумерного элюирования дает только одно пятно. Условия проведения анализа для акадезина: элюент – хлороформ-метанол-25%-ный водный раствор аммиака, t = 20°С, насыщение камеры 1 ч, содержание акадезина в пятне 0,5 мкг. Дополнительная идентификация гомогенности пятен акадезина, полученных при разделении, была проведена с помощью метода ВЭЖХ, после элюирования пятен с хроматограммы. Установлено, что акадезин практически не содержал примесей и элюировался в виде одного острого симметричного пика;
• проведена хроматография растворов одних и тех же проб акадезина в следующие промежутки времени: 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин, при этом установлено, что акадезин элюируется одним пятном, при этом интенсивность этих пятен не изменяется. Условия проведения анализа аналогичны предыдущим;
• пробы акадезина наносили на пластинки, после чего проводилось элюирование этих пластинок через: 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин. Пластинки выдерживались в лабораторном помещении, при комнатной температуре 20–25°С в незащищенном от света месте. Было обнаружено, что акадезин проявляется одним пятном и интенсивность этого пятна не изменяется. Только в случае, когда пятна акадезина выдерживались на хроматограмме более 180 мин, они приобретали желтый цвет и хроматографировались в виде трех хроматографических зон различной интенсивности.
Полученные таким образом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что акадезин устойчив на тонких слоях силикагеля в течение 180 мин, по истечении этого срока его молекулы подвергаются деструкции (скорее всего, окислению имидазольного цикла).
Разработанная нами подвижная фаза для разделения компонентов КЖ штамма-продуцента акадезина является весьма селективной, величины ΔRf >> 0,05 (для пятен акадезина, инозина и гипоксантина). Гомогенность соединений в пятнах, принадлежащих акадезину, гипоксантину и инозину, была подтверждена данными ВЭЖХ после элюирования последних из соответствующих хроматографических зон. Таким образом, показана специфичность разработанной методики, поскольку она позволяет достоверно определять как акадезин, так и сопутствующие ему компоненты в КЖ.
Было установлено, что аналитическая область методики, в пределах которой соблюдается линейная зависимость, охватывает интервал для акадезина от 0,1 до 0,75 мкг в пятне (включая эти пределы).
Правильность (точность) [Precision] разработанной в пределах аналитической области методики, иллюстрируют результаты, представленные в табл.2. Кроме того, данные, представленные в табл.3, демонстрируют хорошую внутрилабораторную воспроизводимость результатов. Была также проверена межлабораторная воспроизводимость результатов (табл.4). Видно, что результаты, полученные на межлабораторных испытаниях, хорошо коррелируют друг с другом. Предел обнаружения акадезина составляет 0,05 мкг. Предел количественного определения акадезина – 0,1 мкг в пятне (S/N=20).
Мы исследовали зависимость селективности разделения от величины объемного содержания хлороформа и метанола, входящих в состав подвижной фазы. Было установлено, что величины ΔRf пятен акадезина, гипоксантина и инозина практически не изменяются (ΔRf=±0,05, n =5, P 0,95) в интервале содержания хлороформа от 13,0 до 15,5% ( по объему) и метанола от 8,5 до 11,0% ( по объему).
Температура в интервале от 15 до 35°С и время насыщения камеры от 30 до 120 минут также не оказывают влияния на величины ΔRf =±0,05 ( n =5, P 0,95) акадезина, гипоксантина и инозина.
Использование ВЭТСХ пластинок "Сорбфил" (предварительно промытых и активированных) различных партий также не вызывает изменений селективности разделения (robustness, ruggedness).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о пригодности разработанной нами методики как для количественного определения акадезина, так и сопутствующих ему в КЖ примесей.
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (ГК №16.522.11.7029) с использованием оборудования ЦКП ФГУП "ГосНИИгенетика".
ЛИТЕРАТУРА
1. Rutter GA, Da Silva Xavier G, Leclerc I. Roles of 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) in mammalian glucose homoeostasis. – Biochemical Journal, 2003,v.375(2), p.1–16.
2. Fediuc S., Anthony N.M, So M., Mirpourian M., Perry R.L., Ceddia R.B. Prolonged AICAR-induced AMP-kinase activation promotes energy dissipation in white adipocytes: novel mechanisms integrating HSL and ATGL. – Journal of Lipid Research, 2009, v.50(4), p. 704–715.
3. Swinnen J.V., Beckers A., Brusselmans K., et al. Mimicry of a cellular low energy status blocks tumor cell anabolism and suppresses the malignant phenotype. – Cancer Research, 2005, v.65,
p.2441–2448.
4. Лобанов К.В., Эрраис Лопес Л., Королькова Н.В.и др. Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AICAR – нового препарата широкого терапевтического применения. – Acta Naturae, 2011, т.2(9), c.83–93.
5. Perrin D.D. Purification of Laboratory Chemicals. – N-Y-London – Pergamon Press, 1988. – 530 p.
6. Досон Р., Эллиот Д., Джонс К. Справочник биохимика. – М:, Мир, 1991, c. 14.
7. Государственная фармакопея СССР. – 11-е изд., М.: Медицина,1987, c. 163–187.
8. Sequars J.M., Direct analysis of high-performance thin-layer chromatography spots of nucleic purine derivatives. – Analytical Chemistry, 1987, v.59(3),
p. 525–537.
9. Bocher B.R., Ames B.N. Complete analysis of cellular nucleotides in thin-layer chromatography. – Journal Biological Chemistry, 1982, v.257(16),
p. 9759–9769.
10. Pfeifer A.M., Toliman G., Kovar K.A. Identification of adenosine in biological samples by HPTLC. – Journal Planar Chromatography, 1996, v.9, p. 31–34.
11. Nyiredy S.Z., Evdelmeier S.A. TLC mobile phase optimization procedure using “PRIZMA" model. – Planta Medica, 1985, N2, p. 241 – 252.
12. Sun S.W., Fabry H. Test procedure validation for the TLC assay of degradation products in pharmaceutical formulation. – Journal Liquid Chromatography, 1994, v.17, p. 2495–2509.
13. Renger B., Vegh Z. Validation of thin layer and high performance thin layer chromatographic methods. – Journal of Chromatography, 2011, v.1218, p. 2712–2721.
14. Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. – Спб.: Химиздат, 2005. – 232 с.
Отзывы читателей
