eng
Выпуск #4/2012
А.Аболин, Пьер-Франсуа Икар
Современная препаративная флеш-хроматография. Часть I
Современная препаративная флеш-хроматография. Часть I
Просмотры: 4576
Статья посвящена флеш-хроматографии – современному методу препаративной жидкостной хроматографии. Описано оборудование компании Interchim SA (Франция) как для классической флеш-хроматографии и ультрапроизводительной флеш-очистки, так и самые современные приборы – так называемые флеш-кроссоверы.
Теги: preparative chromatography, flash chromatography, organic synthe препаративная хроматография, флеш-хроматография, органический си
В 20 веке произошла настоящая революция в инструментальных методах анализа вещества. Это УФ- и ИК-спектроскопия, ЯМР- и ЭПР- спектроскопия, масс-спектрометрия, рентгеноструктурный и рентгенофлуоресцентный анализы, атомно-адсорбционная спектроскопия, калориметрические и другие методы физико-химического анализа. Но вот уже и 21 век, а что же мы имеем в нашем распоряжении, чтобы предоставить аналитикам максимально чистое вещество? Кристаллизация, дистилляция, сублимация, жидкофазная экстракция – вот методы, пришедшие к нам еще из средневековья. 20 век добавил препаративную жидкостную хроматографию, сверхкритическую флюидную хроматографию и твердофазную экстракцию (мы говорим об инструментальном оформлении анализа, а не о теоретических основах метода). Вот, пожалуй, и все.
Конечно, никто не собирается отменять старые добрые методы: если можно получить идеально чистое вещество путем простой перекристаллизации из водного раствора, то так и надо поступать. Но что делать, если речь идет о сложной многокомпонентной смеси? Скорее всего, вы обратитесь к жидкостной хроматографии – на сегодняшний день это самый универсальный метод и разделения, и препаративного выделения. Тем более, что в своем простейшем варианте это еще и один из самых дешевых методов, ведь все, что нам нужно – это стеклянная колонка и силикагель 40/60 мкм. Этой технологии уже много лет, но она до сих пор используется в самых разных лабораториях.
В 1978 году профессор Колумбийского университета У.Кларк Стилл опубликовал вместе с двумя соавторами статью "Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution" [Journal of. Organic. Chemistry., 1978, 43(14)], в которой ввел термин "флеш-хроматография" (flash chromatography), а на семинаре химического департамента продемонстрировал своим коллегам, что разделение на отдельные компоненты черной пасты из шариковой авторучки по предложенной им методике происходит быстрее, чем на пластине для тонкослойной хроматографии. Установка для флеш-хроматографии, описанная в этой статье, представляла собой обычную стеклянную 45-сантиметровую хроматографическую колонку с краном, на верхний конец которой надевался простейший игольчатый кран для регулирования скорости потока элюента, а сорбент (силикагель 60) уплотнялся продувкой воздухом. Мы полагаем, что нет необходимости подробно пересказывать методику 34-летней давности, желающие могут обратиться к тексту упомянутой выше статьи. Достаточно примитивная методика давала удовлетворительные результаты для соединений, имеющих ΔRf ≥ 0,15 (и даже меньше) в течение 5–10 мин. В дальнейшем эта установка была существенно изменена (рис.1) и представляла собой ту же стеклянную хроматографическую колонку, в которую вставлялась стеклянная воронка с запаянным носиком, над ним по всему периметру были проделаны отверстия, из которых элюент попадал на стенки колонки. Сверху на слой силикагеля, как и в первоначальном варианте, помещался небольшой слой чистого песка. Такое сочетание подачи растворителя на стенки колонки и демпфирующая подушка из слоя песка уменьшают размытие фронта элюента. Сам профессор К.Стилл так определял свою методику: "Флеш-хроматография – простой процесс препаративного хроматографического разделения на прямой фазе средней эффективности". Метод флеш-хроматографии ускорял процесс разделения даже относительно сложных смесей, но имел и ряд недостатков. Вот только некоторые из них: самостоятельная набивка колонок, ухудшающая воспроизводимость результатов; переупаковка колонки для каждого нового процесса; проблема ввода в колонку труднорастворимых образцов; контроль разделения веществ, не поглощающих в видимой области спектра; ручной сбор фракций.
Большинство из перечисленных выше проблем еще в конце 1970-х годов успешно решались классической высокоэффективной препаративной хроматографией, хотя для повышения эффективности получения чистых соединений химики вынуждены балансировать между чистотой вещества, затратами времени и экологическими соображениями, поэтому очистка материалов с помощью жидкостной хроматографии – это всегда и вызов, и компромисс для получения желаемой чистоты вещества, объемов загрузки и производительности хроматографической системы. У препаративной ВЭЖХ есть свои недостатки, например, высокая стоимость колонок. Кроме того, колонки большого объема, как правило, поставляются производителями в неупакованном виде, так что процесс набивки колонки остается за конечным пользователем, что, как и в случае с "классической" флеш-хроматографией, приводит к проблеме воспроизводимости результатов. Кроме высокой цены колонок для препаративной ВЭЖХ следует учитывать еще и стоимость сорбента, применяемого для наполнения колонки, особенно если речь идет об обращенно-фазных сорбентах. Да и не всегда вы вольны в выборе самого хроматографического сорбента: достаточно обычна ситуация, когда можно купить необходимую уже наполненную аналитическую или препаративную колонку, но нельзя отдельно приобрести фазу, которой заполнена эта колонка.
К концу 1990-х годов образовался разрыв между не дорогим, но не самым эффективным методом флеш-хроматографии, и эффективным, но весьма дорогостоящим методом препаративной ВЭЖХ. Ситуация была достаточно очевидной и несколько компаний в разных странах (Biotage в Швеции, Buchi в Швейцарии, Grace в США и др.) начали выпуск флеш-хроматографов, в которых с разной степенью успеха были устранены недостатки, присущие классической флеш-хроматографии. В 2009 году французская компания Interchim SA (основной производитель материалов для хроматографии и твердофазной экстракции во Франции) начала выпуск хроматографов серии puriFlash, которые имеют ряд особенностей, выгодно отличающих их от аналогичного оборудования других производителей. Идеология этих приборов основана на современной концепции Ultra-Performance Flash Purification (UPFP), т.е. "Ультрапроизводительной флеш-очистки". Концепция UPFP, созданная и успешно воплощаемая компанией Interchim, сокращает время и затраты на очистку образца с одновременным увеличением производительности всего процесса. UPFP отличается от традиционной флеш-хроматографии применением хроматографических фаз со сферическими частицами малого размера, что максимально сближает такие материалы с сорбентами аналитического качества. Замена стеклянных колонок пластиковыми картриджами дает выигрыш в скорости потока элюента и давления в системе. Картриджи заполняются производителем по собственной запатентованной системе, близкой к методике наполнения металлических HPLC-колонок, а это означает повышение эффективности разделения, увеличение максимальной нагрузки на колонку (картридж) и обеспечивает воспроизводимость процесса при смене картриджа. Кроме того, увеличение давления потока растворителя (до 250 бар!) позволяет многим моделям серии puriFlash работать не только с пластиковыми флеш-картриджами, но и с металлическими HPLC-колонками.
Мы считаем, что флеш-хроматография, а точнее UPFP-технологии, в первую очередь могут быть полезны в следующих областях:
органический синтез, особенно многостадийные процессы, при которых примеси могут накапливаться от стадии к стадии;
биотехнологические процессы: очистка и выделение пептидов, олигонуклеотидов, олигосахаридов и исходных продуктов;
очистка экстрактов из растительного сырья, особенно в производстве БАДов;
любые технологические процессы, где требуется осветление конечных растворов с помощью патронов, наполненных активированным углем;
фарминдустрия: очистка исходного сырья, очистка промежуточных и конечных продуктов. Список европейских фармацевтических предприятий, где используются хроматографы puriFlash весьма внушительный (см. врезку).
Сегодня компания Interchim предлагает линейку модульных хроматографов, состоящих из отдельных однотипных блоков, что позволяет использовать не только стандартные конфигурации, предлагаемые изготовителем, но и подбирать комплектацию под свои конкретные задачи.
В табл.1 представлены основные характеристики хроматографов серий 200, 400 и 800.
Младшая модель pF-210 (рис.2) – классический флэш-хроматограф с относительно небольшой максимальной скоростью подачи элюента (150 мл/мин) и скромным максимальным рабочим давлением в 10 бар. В своей базовой конфигурации работает в бинарном градиентном режиме и оснащена рутинным УФ-детектором с фиксированной длиной волны 254 нм. Фильтры, обеспечивающие измерение поглощения на других длинах волн, являются опцией, также опционно pF-210 может быть оснащен диодно-матричным детектором с диапазоном от 190 до 840 нм.
Если придерживаться классификации самой компании Interchim, то следующая флеш-модель – хроматограф pF-800, хотя этот прибор и отличается радикально от 210-й модели. Прежде всего, это огромная для настольной компактной модели (габариты pF-800 такие же, как и у модели pF-210) производительность насоса: 800 мл/мин. Во-вторых, pF-800 в базовой комплектации оснащается детектором с диодно-матричной решеткой (спектральный диапазон 200–600 нм, но, как и для любых моделей, может быть расширен до 190–840 нм). Еще одно отличие: вы можете выбирать как бинарный, так и четверной градиент. Все эти характеристики делают pF-800 абсолютно уникальной компактной настольной пилотной установкой для очистки килограммовых количеств.
Следующие три модели попадают по классификации Interchim в группу Ultra Performance Flash Purification, т.е. приборы, работающие при более высоком давлении, чем традиционные флеш-хроматографы. К этой группе можно отнести три модели: pF-430, pF-450 и совершенно новый хроматограф pF-4100-250.
pF-430 – добротная бюджетная модель для лабораторий, где не требуется работа с большими количествами веществ, а ввод пробы осуществляется или вручную, или используя один из четырех имеющихся каналов, поскольку pF-430 имеет четверной градиент. В качестве детектора используется диодно-матричная решетка, но прибор может работать и с рефрактометрическим, и с ELSD-детекторами. Несмотря на средние показатели по производительности потока (200 мл/мин) и максимальному давлению (30 бар), pF-430 можно использовать не только со стандартными картриджами для флеш-хроматографии, но и с полупрепаративными ВЭЖХ-колонками небольшого размера. Главное – не превышать ограничение по максимальному рабочему давлению.
Более универсальной моделью, настоящей "рабочей лошадкой", можно считать pF-450. Этот хроматограф отличается от 430-й модели и скоростью подачи элюента (250 мл/мин), и максимальным рабочим давлением (50 бар), но главное отличие состоит в комплектации этой модели шестипортовым электрическим краном-дозатором с заменяемыми петлями различного объема (от 100 мкл до 40 мл; в стандартной комплектации поставляется с петлей объемом 2 мл), а также наличием дополнительного второго держателя колонок. Это позволяет работать с картриджами максимального размера (2500 г) на основном держателе колонок и колонками среднего размера, устанавливая их в дополнительный держатель. Благодаря мощному насосу pF-450 способен работать с металлическими ВЭЖХ-колонками с диаметром частиц сорбента до 15 мкм. Большое количество опций, возможность сконфигурировать прибор и без шестипортового крана делает pF-450 самым востребованным и продаваемым хроматографом из всего модельного ряда приборов компании Interchim.
В 2012 году начато производство трех новых моделей: пограничный прибор pF-4100-250 и две модели совершенно нового поколения, так называемые флеш-кроссоверы – хроматографы Premium класса pF-4250-040 и pF-4250-250. Из названия моделей понятно, что это хроматографы с четверным градиентом и максимальным рабочим давлением 250 бар. На рис.3 показан pF-4100-250. C одной стороны, это модификация модели pF-450. Тот же шестипортовый кран, та же максимальная скорость подачи растворителей – 250 мл/мин, габариты такие же, как и у всех вышеописанных моделей. С другой стороны, применение совершенно нового насоса с максимальным рабочим давлением до 100 бар, во-первых окончательно выводит этот прибор из числа устройств для "классической" флеш-хроматографии. Во-вторых, и это самое главное, такой насос позволяет использовать не только флеш-картриджи любых размеров, но и полупрепаративные и препаративные ВЭЖХ-колонки диаметром до 80 мм и размером частиц до 10 мкм. Еще одна деталь, отличающая новый Premium класс от предыдущих моделей: камера предварительного смешения растворителей с переменным объемом. Это новшество введено для того, чтобы и для таких больших значений давления поддерживать высокую точность градиента. В остальном новый pF-4100-250 аналогичен модели pF-450. Мы уверены, что этот прибор займет свое достойное место в ряду самых продаваемых хроматографов компании Interchim. В табл.2 представлены основные характеристики флеш-кроссоверов серии 4000.
Обе модели серии 4250 (рис.4) во многом схожи с хроматографом 4100: та же камера предвари-тельного смешения растворителей с изменяемым объемом; от pF-450 к этим моделям перешли большой и малый держатели колонок, оба прибора в базе оснащаются шестипортовым программно-управляемым краном-переключателем с возможностью петлевого ввода. Обе модели предназначены для работы как со стандартными флеш-картриджами, так и с препаративными ВЭЖХ-колонками с размером частиц сорбента до 5 мкм. Отличие, по сути, одно: модель pF-4250-040 оснащена насосом с максимальным расходом элюента до 40 мл/мин и рассматривается производителем как прибор, предназначенный в первую очередь для отработки методик и очистки сравнительно небольших количеств вещества на пятнадцатмикронных флеш-картриджах размером до 800 г (или для работы с пятимикронными ВЭЖХ-колонками диаметром до 30 мм). "Старший" на сегодняшний день кроссовер pF-4250-250 – абсолютно уникальная модель с широчайшими возможностями работы с флеш-картриджами любого объема и препаративными пятимикронными ВЭЖХ-колонками диаметром до 80 мм!
Таким образом, серия 4000 хроматографов действительно представляет собой линейку приборов, одинаково приспособленных как для классической флеш-хроматографии, так и для классической препаративной ВЭЖХ, а пришедший совсем из других областей термин "кроссовер" абсолютно оправдано применяется компанией Interchim ко всему 4000 ряду приборов. Все модели, выпускаемые компанией Interchim, производятся во Франции и управляются электроникой концерна Hitachi, выпускаемой на заводах Hitachi в Японии. "Сердце" любой модели – высокопроизводительный классический двухплунжерный насос (рис.5), обеспечивающий прецизионную подачу растворителей с точностью градиента в пределах 1%. Все насосы изготовлены из специальной нержавеющей стали и обеспечивают долговременную работу узла с любыми растворителями и буферными растворами. Различные модели снабжаются разными насосами, имеющими производительность 50, 150, 200, 250 и 800 мл/мин. Максимальное давление, с которым могут работать разные модели насосов, варьируется от 50 до 250 бар (см. табл.1 и 2)
Все хроматографы в базовой комплектации оснащаются спектрофтометрическим детектором с диодной матрицей (за исключением модели pF 210), позволяющим проводить измерения в диапазоне длин волн от 200 до 600 нм (рис.6). При желании этот диапазон может быть расширен до 190–840 нм. Применение диодной матрицы позволяет реализовывать несколько режимов детектирования: произвольно выбранная длина волны и одновременное отслеживание всего спектрального диапазона или детектирование сигнала на двух произвольно выбранных длинах волн. Для работы в изократическом режиме предназначен рефрактометрический детектор IOTA-2 французской компании Precision Instruments, специализирующейся на производстве детекторов для ВЭЖХ. Особый интерес представляет комбинация спектрофотометрического детектора и испарительного детектора светорассеяния (ELSD-детектора). ELSD-детекторы уже достаточно широко применяются в аналитической ВЭЖХ, но максимальная скорость потока элюента ограничена 4–5 мл/мин, что исключает их прямое применение в препаративных системах. Компания Interchim в сотрудничестве с французским производителем ELSD-детекторов SEDERE модифицировали стандартный анализатор так, что он работает при рекордной скорости потока в препаративной системе до 160 мл/мин. Принцип работы ELSD-детектора основан на том, что раствор исследуемой смеси, пройдя через хроматографическую колонку, распыляется и смешивается с азотом или воздухом и образует жидко-капельную дисперсию. Этот аэрозольный поток проходит через нагретую трубку, в которой происходит испарение подвижной фазы. Образующаяся дисперсия частиц анализируемого вещества проходит через лазерный луч, приводя к рассеянию потока фотонов. Изменение параметров лазерного луча обрабатывается и выводится на экран в виде обычной хроматограммы. ELSD-детекторы обнаруживают любое соединение при условии, что температура перехода в газообразное состояние этого вещества больше, чем у подвижной фазы, при этом определение вещества происходит в изократических или градиентных условиях независимо от поглощения, флуоресценции или электроактивности исследуемых веществ. На рис.7 сопоставлены анализы смеси продуктов спектрофотометрическим и ELSD-детекторами. Из этого рисунка хорошо видно, что детектор по светорассеянию позволяет определять не поглощающие в УФ-области вещества (полимеры, аминокислоты, углеводы, липиды, стероиды, терпены и т.д.). При всех положительных качествах устройства надо отметить его более высокую по сравнению с традиционными спектрофотометрическими детекторами стоимость, а также ту особенность, что ELSD-детектор – датчик разрушающего типа, т.е. часть вещества, проходящего через ELSD, теряется безвозвратно. Последнее, впрочем, компенсируется тем, что при препаративном использовании через ELSD-детектор проходит несоизмеримо малая по сравнению с основным потоком часть вещества.
После прохождения анализируемого образца через колонку и детектор разделенные фракции собираются в коллекторе фракций (рис.8), который стандартно поставляется с четырьмя штативами из нержавеющей стали. Каждый штатив (в стандартной комплектации) рассчитан на 44 пробирки высотой до 180 мм и диаметром до 18 мм, но существуют держатели и под другие размеры пробирок, так что при полной загрузке всех четырех штативов пробирками 18х180 мм общий объем коллектора фракций составляет 5 632 мл. Если вы работаете с колонками большого объема и с высокими скоростями потока элюента, то вместо пробирочных штативов можно использовать вороночные штативы, при этом различные фракции собираются в ваши собственные емкости, соединенные шлангами с воронками. Легко создать свой собственный вариант, используя емкости любого типа.
Следует обратить внимание, что любая из описанных выше моделей хроматографов, хотя и является модульной конструкцией, но самостоятельная работа любого из блоков невозможна, т.е. нельзя использовать, например, какой-либо из насосов серии puriFlash как самостоятельный модуль. Это не всегда удобно, особенно в тех случаях, когда в лаборатории уже имеется что-то из оборудования, необходимого для хроматографии: коллектор фракций, детектор и т.д. Именно для таких случаев компания Interchim разработала серию One, во всем аналогичную традиционным моделям, но в этой серии каждый из блоков (насос, детектор, коллектор фракций) – абсолютно независимый прибор, который может работать практически с любым оборудованием других производителей. Каждый из блоков этой серии имеет собственный сенсорный дисплей, а в программное обеспечение каждого модуля уже заложены управляющие коды для многих моделей хроматографического оборудования других производителей (Gilson, Knauer и т.п.). И, конечно, собранные вместе, все три модуля (насос, детектор и коллектор фракций) прекрасно "понимают" друг друга и составляют мощный, компактный препаративный хроматограф для любых задач.
Последняя уникальная разработка компании Interchim – система REVOLUTIon – первая в мире препаративная флеш-хроматографическая система puriFlash-MS. В октябре 2012 года специалисты компании "ГалаХим" пройдут очередной ежегодный тренинг официальных дистрибьютеров компании Interchim, где на практике познакомятся с этой действительно революционной разработкой.
Продолжение следует
Конечно, никто не собирается отменять старые добрые методы: если можно получить идеально чистое вещество путем простой перекристаллизации из водного раствора, то так и надо поступать. Но что делать, если речь идет о сложной многокомпонентной смеси? Скорее всего, вы обратитесь к жидкостной хроматографии – на сегодняшний день это самый универсальный метод и разделения, и препаративного выделения. Тем более, что в своем простейшем варианте это еще и один из самых дешевых методов, ведь все, что нам нужно – это стеклянная колонка и силикагель 40/60 мкм. Этой технологии уже много лет, но она до сих пор используется в самых разных лабораториях.
В 1978 году профессор Колумбийского университета У.Кларк Стилл опубликовал вместе с двумя соавторами статью "Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution" [Journal of. Organic. Chemistry., 1978, 43(14)], в которой ввел термин "флеш-хроматография" (flash chromatography), а на семинаре химического департамента продемонстрировал своим коллегам, что разделение на отдельные компоненты черной пасты из шариковой авторучки по предложенной им методике происходит быстрее, чем на пластине для тонкослойной хроматографии. Установка для флеш-хроматографии, описанная в этой статье, представляла собой обычную стеклянную 45-сантиметровую хроматографическую колонку с краном, на верхний конец которой надевался простейший игольчатый кран для регулирования скорости потока элюента, а сорбент (силикагель 60) уплотнялся продувкой воздухом. Мы полагаем, что нет необходимости подробно пересказывать методику 34-летней давности, желающие могут обратиться к тексту упомянутой выше статьи. Достаточно примитивная методика давала удовлетворительные результаты для соединений, имеющих ΔRf ≥ 0,15 (и даже меньше) в течение 5–10 мин. В дальнейшем эта установка была существенно изменена (рис.1) и представляла собой ту же стеклянную хроматографическую колонку, в которую вставлялась стеклянная воронка с запаянным носиком, над ним по всему периметру были проделаны отверстия, из которых элюент попадал на стенки колонки. Сверху на слой силикагеля, как и в первоначальном варианте, помещался небольшой слой чистого песка. Такое сочетание подачи растворителя на стенки колонки и демпфирующая подушка из слоя песка уменьшают размытие фронта элюента. Сам профессор К.Стилл так определял свою методику: "Флеш-хроматография – простой процесс препаративного хроматографического разделения на прямой фазе средней эффективности". Метод флеш-хроматографии ускорял процесс разделения даже относительно сложных смесей, но имел и ряд недостатков. Вот только некоторые из них: самостоятельная набивка колонок, ухудшающая воспроизводимость результатов; переупаковка колонки для каждого нового процесса; проблема ввода в колонку труднорастворимых образцов; контроль разделения веществ, не поглощающих в видимой области спектра; ручной сбор фракций.
Большинство из перечисленных выше проблем еще в конце 1970-х годов успешно решались классической высокоэффективной препаративной хроматографией, хотя для повышения эффективности получения чистых соединений химики вынуждены балансировать между чистотой вещества, затратами времени и экологическими соображениями, поэтому очистка материалов с помощью жидкостной хроматографии – это всегда и вызов, и компромисс для получения желаемой чистоты вещества, объемов загрузки и производительности хроматографической системы. У препаративной ВЭЖХ есть свои недостатки, например, высокая стоимость колонок. Кроме того, колонки большого объема, как правило, поставляются производителями в неупакованном виде, так что процесс набивки колонки остается за конечным пользователем, что, как и в случае с "классической" флеш-хроматографией, приводит к проблеме воспроизводимости результатов. Кроме высокой цены колонок для препаративной ВЭЖХ следует учитывать еще и стоимость сорбента, применяемого для наполнения колонки, особенно если речь идет об обращенно-фазных сорбентах. Да и не всегда вы вольны в выборе самого хроматографического сорбента: достаточно обычна ситуация, когда можно купить необходимую уже наполненную аналитическую или препаративную колонку, но нельзя отдельно приобрести фазу, которой заполнена эта колонка.
К концу 1990-х годов образовался разрыв между не дорогим, но не самым эффективным методом флеш-хроматографии, и эффективным, но весьма дорогостоящим методом препаративной ВЭЖХ. Ситуация была достаточно очевидной и несколько компаний в разных странах (Biotage в Швеции, Buchi в Швейцарии, Grace в США и др.) начали выпуск флеш-хроматографов, в которых с разной степенью успеха были устранены недостатки, присущие классической флеш-хроматографии. В 2009 году французская компания Interchim SA (основной производитель материалов для хроматографии и твердофазной экстракции во Франции) начала выпуск хроматографов серии puriFlash, которые имеют ряд особенностей, выгодно отличающих их от аналогичного оборудования других производителей. Идеология этих приборов основана на современной концепции Ultra-Performance Flash Purification (UPFP), т.е. "Ультрапроизводительной флеш-очистки". Концепция UPFP, созданная и успешно воплощаемая компанией Interchim, сокращает время и затраты на очистку образца с одновременным увеличением производительности всего процесса. UPFP отличается от традиционной флеш-хроматографии применением хроматографических фаз со сферическими частицами малого размера, что максимально сближает такие материалы с сорбентами аналитического качества. Замена стеклянных колонок пластиковыми картриджами дает выигрыш в скорости потока элюента и давления в системе. Картриджи заполняются производителем по собственной запатентованной системе, близкой к методике наполнения металлических HPLC-колонок, а это означает повышение эффективности разделения, увеличение максимальной нагрузки на колонку (картридж) и обеспечивает воспроизводимость процесса при смене картриджа. Кроме того, увеличение давления потока растворителя (до 250 бар!) позволяет многим моделям серии puriFlash работать не только с пластиковыми флеш-картриджами, но и с металлическими HPLC-колонками.
Мы считаем, что флеш-хроматография, а точнее UPFP-технологии, в первую очередь могут быть полезны в следующих областях:
органический синтез, особенно многостадийные процессы, при которых примеси могут накапливаться от стадии к стадии;
биотехнологические процессы: очистка и выделение пептидов, олигонуклеотидов, олигосахаридов и исходных продуктов;
очистка экстрактов из растительного сырья, особенно в производстве БАДов;
любые технологические процессы, где требуется осветление конечных растворов с помощью патронов, наполненных активированным углем;
фарминдустрия: очистка исходного сырья, очистка промежуточных и конечных продуктов. Список европейских фармацевтических предприятий, где используются хроматографы puriFlash весьма внушительный (см. врезку).
Сегодня компания Interchim предлагает линейку модульных хроматографов, состоящих из отдельных однотипных блоков, что позволяет использовать не только стандартные конфигурации, предлагаемые изготовителем, но и подбирать комплектацию под свои конкретные задачи.
В табл.1 представлены основные характеристики хроматографов серий 200, 400 и 800.
Младшая модель pF-210 (рис.2) – классический флэш-хроматограф с относительно небольшой максимальной скоростью подачи элюента (150 мл/мин) и скромным максимальным рабочим давлением в 10 бар. В своей базовой конфигурации работает в бинарном градиентном режиме и оснащена рутинным УФ-детектором с фиксированной длиной волны 254 нм. Фильтры, обеспечивающие измерение поглощения на других длинах волн, являются опцией, также опционно pF-210 может быть оснащен диодно-матричным детектором с диапазоном от 190 до 840 нм.
Если придерживаться классификации самой компании Interchim, то следующая флеш-модель – хроматограф pF-800, хотя этот прибор и отличается радикально от 210-й модели. Прежде всего, это огромная для настольной компактной модели (габариты pF-800 такие же, как и у модели pF-210) производительность насоса: 800 мл/мин. Во-вторых, pF-800 в базовой комплектации оснащается детектором с диодно-матричной решеткой (спектральный диапазон 200–600 нм, но, как и для любых моделей, может быть расширен до 190–840 нм). Еще одно отличие: вы можете выбирать как бинарный, так и четверной градиент. Все эти характеристики делают pF-800 абсолютно уникальной компактной настольной пилотной установкой для очистки килограммовых количеств.
Следующие три модели попадают по классификации Interchim в группу Ultra Performance Flash Purification, т.е. приборы, работающие при более высоком давлении, чем традиционные флеш-хроматографы. К этой группе можно отнести три модели: pF-430, pF-450 и совершенно новый хроматограф pF-4100-250.
pF-430 – добротная бюджетная модель для лабораторий, где не требуется работа с большими количествами веществ, а ввод пробы осуществляется или вручную, или используя один из четырех имеющихся каналов, поскольку pF-430 имеет четверной градиент. В качестве детектора используется диодно-матричная решетка, но прибор может работать и с рефрактометрическим, и с ELSD-детекторами. Несмотря на средние показатели по производительности потока (200 мл/мин) и максимальному давлению (30 бар), pF-430 можно использовать не только со стандартными картриджами для флеш-хроматографии, но и с полупрепаративными ВЭЖХ-колонками небольшого размера. Главное – не превышать ограничение по максимальному рабочему давлению.
Более универсальной моделью, настоящей "рабочей лошадкой", можно считать pF-450. Этот хроматограф отличается от 430-й модели и скоростью подачи элюента (250 мл/мин), и максимальным рабочим давлением (50 бар), но главное отличие состоит в комплектации этой модели шестипортовым электрическим краном-дозатором с заменяемыми петлями различного объема (от 100 мкл до 40 мл; в стандартной комплектации поставляется с петлей объемом 2 мл), а также наличием дополнительного второго держателя колонок. Это позволяет работать с картриджами максимального размера (2500 г) на основном держателе колонок и колонками среднего размера, устанавливая их в дополнительный держатель. Благодаря мощному насосу pF-450 способен работать с металлическими ВЭЖХ-колонками с диаметром частиц сорбента до 15 мкм. Большое количество опций, возможность сконфигурировать прибор и без шестипортового крана делает pF-450 самым востребованным и продаваемым хроматографом из всего модельного ряда приборов компании Interchim.
В 2012 году начато производство трех новых моделей: пограничный прибор pF-4100-250 и две модели совершенно нового поколения, так называемые флеш-кроссоверы – хроматографы Premium класса pF-4250-040 и pF-4250-250. Из названия моделей понятно, что это хроматографы с четверным градиентом и максимальным рабочим давлением 250 бар. На рис.3 показан pF-4100-250. C одной стороны, это модификация модели pF-450. Тот же шестипортовый кран, та же максимальная скорость подачи растворителей – 250 мл/мин, габариты такие же, как и у всех вышеописанных моделей. С другой стороны, применение совершенно нового насоса с максимальным рабочим давлением до 100 бар, во-первых окончательно выводит этот прибор из числа устройств для "классической" флеш-хроматографии. Во-вторых, и это самое главное, такой насос позволяет использовать не только флеш-картриджи любых размеров, но и полупрепаративные и препаративные ВЭЖХ-колонки диаметром до 80 мм и размером частиц до 10 мкм. Еще одна деталь, отличающая новый Premium класс от предыдущих моделей: камера предварительного смешения растворителей с переменным объемом. Это новшество введено для того, чтобы и для таких больших значений давления поддерживать высокую точность градиента. В остальном новый pF-4100-250 аналогичен модели pF-450. Мы уверены, что этот прибор займет свое достойное место в ряду самых продаваемых хроматографов компании Interchim. В табл.2 представлены основные характеристики флеш-кроссоверов серии 4000.
Обе модели серии 4250 (рис.4) во многом схожи с хроматографом 4100: та же камера предвари-тельного смешения растворителей с изменяемым объемом; от pF-450 к этим моделям перешли большой и малый держатели колонок, оба прибора в базе оснащаются шестипортовым программно-управляемым краном-переключателем с возможностью петлевого ввода. Обе модели предназначены для работы как со стандартными флеш-картриджами, так и с препаративными ВЭЖХ-колонками с размером частиц сорбента до 5 мкм. Отличие, по сути, одно: модель pF-4250-040 оснащена насосом с максимальным расходом элюента до 40 мл/мин и рассматривается производителем как прибор, предназначенный в первую очередь для отработки методик и очистки сравнительно небольших количеств вещества на пятнадцатмикронных флеш-картриджах размером до 800 г (или для работы с пятимикронными ВЭЖХ-колонками диаметром до 30 мм). "Старший" на сегодняшний день кроссовер pF-4250-250 – абсолютно уникальная модель с широчайшими возможностями работы с флеш-картриджами любого объема и препаративными пятимикронными ВЭЖХ-колонками диаметром до 80 мм!
Таким образом, серия 4000 хроматографов действительно представляет собой линейку приборов, одинаково приспособленных как для классической флеш-хроматографии, так и для классической препаративной ВЭЖХ, а пришедший совсем из других областей термин "кроссовер" абсолютно оправдано применяется компанией Interchim ко всему 4000 ряду приборов. Все модели, выпускаемые компанией Interchim, производятся во Франции и управляются электроникой концерна Hitachi, выпускаемой на заводах Hitachi в Японии. "Сердце" любой модели – высокопроизводительный классический двухплунжерный насос (рис.5), обеспечивающий прецизионную подачу растворителей с точностью градиента в пределах 1%. Все насосы изготовлены из специальной нержавеющей стали и обеспечивают долговременную работу узла с любыми растворителями и буферными растворами. Различные модели снабжаются разными насосами, имеющими производительность 50, 150, 200, 250 и 800 мл/мин. Максимальное давление, с которым могут работать разные модели насосов, варьируется от 50 до 250 бар (см. табл.1 и 2)
Все хроматографы в базовой комплектации оснащаются спектрофтометрическим детектором с диодной матрицей (за исключением модели pF 210), позволяющим проводить измерения в диапазоне длин волн от 200 до 600 нм (рис.6). При желании этот диапазон может быть расширен до 190–840 нм. Применение диодной матрицы позволяет реализовывать несколько режимов детектирования: произвольно выбранная длина волны и одновременное отслеживание всего спектрального диапазона или детектирование сигнала на двух произвольно выбранных длинах волн. Для работы в изократическом режиме предназначен рефрактометрический детектор IOTA-2 французской компании Precision Instruments, специализирующейся на производстве детекторов для ВЭЖХ. Особый интерес представляет комбинация спектрофотометрического детектора и испарительного детектора светорассеяния (ELSD-детектора). ELSD-детекторы уже достаточно широко применяются в аналитической ВЭЖХ, но максимальная скорость потока элюента ограничена 4–5 мл/мин, что исключает их прямое применение в препаративных системах. Компания Interchim в сотрудничестве с французским производителем ELSD-детекторов SEDERE модифицировали стандартный анализатор так, что он работает при рекордной скорости потока в препаративной системе до 160 мл/мин. Принцип работы ELSD-детектора основан на том, что раствор исследуемой смеси, пройдя через хроматографическую колонку, распыляется и смешивается с азотом или воздухом и образует жидко-капельную дисперсию. Этот аэрозольный поток проходит через нагретую трубку, в которой происходит испарение подвижной фазы. Образующаяся дисперсия частиц анализируемого вещества проходит через лазерный луч, приводя к рассеянию потока фотонов. Изменение параметров лазерного луча обрабатывается и выводится на экран в виде обычной хроматограммы. ELSD-детекторы обнаруживают любое соединение при условии, что температура перехода в газообразное состояние этого вещества больше, чем у подвижной фазы, при этом определение вещества происходит в изократических или градиентных условиях независимо от поглощения, флуоресценции или электроактивности исследуемых веществ. На рис.7 сопоставлены анализы смеси продуктов спектрофотометрическим и ELSD-детекторами. Из этого рисунка хорошо видно, что детектор по светорассеянию позволяет определять не поглощающие в УФ-области вещества (полимеры, аминокислоты, углеводы, липиды, стероиды, терпены и т.д.). При всех положительных качествах устройства надо отметить его более высокую по сравнению с традиционными спектрофотометрическими детекторами стоимость, а также ту особенность, что ELSD-детектор – датчик разрушающего типа, т.е. часть вещества, проходящего через ELSD, теряется безвозвратно. Последнее, впрочем, компенсируется тем, что при препаративном использовании через ELSD-детектор проходит несоизмеримо малая по сравнению с основным потоком часть вещества.
После прохождения анализируемого образца через колонку и детектор разделенные фракции собираются в коллекторе фракций (рис.8), который стандартно поставляется с четырьмя штативами из нержавеющей стали. Каждый штатив (в стандартной комплектации) рассчитан на 44 пробирки высотой до 180 мм и диаметром до 18 мм, но существуют держатели и под другие размеры пробирок, так что при полной загрузке всех четырех штативов пробирками 18х180 мм общий объем коллектора фракций составляет 5 632 мл. Если вы работаете с колонками большого объема и с высокими скоростями потока элюента, то вместо пробирочных штативов можно использовать вороночные штативы, при этом различные фракции собираются в ваши собственные емкости, соединенные шлангами с воронками. Легко создать свой собственный вариант, используя емкости любого типа.
Следует обратить внимание, что любая из описанных выше моделей хроматографов, хотя и является модульной конструкцией, но самостоятельная работа любого из блоков невозможна, т.е. нельзя использовать, например, какой-либо из насосов серии puriFlash как самостоятельный модуль. Это не всегда удобно, особенно в тех случаях, когда в лаборатории уже имеется что-то из оборудования, необходимого для хроматографии: коллектор фракций, детектор и т.д. Именно для таких случаев компания Interchim разработала серию One, во всем аналогичную традиционным моделям, но в этой серии каждый из блоков (насос, детектор, коллектор фракций) – абсолютно независимый прибор, который может работать практически с любым оборудованием других производителей. Каждый из блоков этой серии имеет собственный сенсорный дисплей, а в программное обеспечение каждого модуля уже заложены управляющие коды для многих моделей хроматографического оборудования других производителей (Gilson, Knauer и т.п.). И, конечно, собранные вместе, все три модуля (насос, детектор и коллектор фракций) прекрасно "понимают" друг друга и составляют мощный, компактный препаративный хроматограф для любых задач.
Последняя уникальная разработка компании Interchim – система REVOLUTIon – первая в мире препаративная флеш-хроматографическая система puriFlash-MS. В октябре 2012 года специалисты компании "ГалаХим" пройдут очередной ежегодный тренинг официальных дистрибьютеров компании Interchim, где на практике познакомятся с этой действительно революционной разработкой.
Продолжение следует
Отзывы читателей
