eng
Выпуск #4/2012
К.Сычев, И.Стыскин
Анализ полифенольных соединений кофе и чая в условиях гидрофильного режима ВЭЖХ
Анализ полифенольных соединений кофе и чая в условиях гидрофильного режима ВЭЖХ
Просмотры: 2971
Для разделения спектра кофеилхинных кислот кофе и катехинов чая применен
гидрофильный режим жидкостной хроматографии. Основная цель исследования – установить последовательность элюирования целевых соединений
в условиях гидрофильной хроматографии.
гидрофильный режим жидкостной хроматографии. Основная цель исследования – установить последовательность элюирования целевых соединений
в условиях гидрофильной хроматографии.
Теги: catechins гидрофильная вэжх coffeyl-quinic acids hilic natural compounds гидроксикоричные кислоты катехины природные соединения
Термином "гидрофильная хроматография" обозначим хроматографический режим, формально соответствующий нормально-фазовой жидкостной хроматографии (ЖХ), в котором в качестве подвижных фаз применяют полярные водно-органические смеси. В международной литературе этот режим обозначают аббревиатурой HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography – хроматография за счет гидрофильного взаимодействия). Оборот "… за счет гидрофильного взаимодействия", скорее всего, отражает специфику профессии автора термина – Эндрю Алперт (Andrew J. Alpert), который занимался хроматографическим разделением и очисткой биологических полимеров. Термин "HILIC" введен им в обращение в 1990 году [1]; однако сам метод достаточно широко применялся в практике и ранее без специального названия или под другими названиями. Например, в России режим гидрофильной хроматографии активно продвигался Леонидом Сапрыкиным под названием "ДИРФ" (динамически-индуцированный раздел фаз). Специфика такого названия объясняется тем, что автор часто работал в режиме динамического модифицирования, варьируя селективность силикагеля и попутно борясь с его низким качеством. В 1990 и 1992 годах в "Заводской лаборатории" опубликованы одни из первых отечественных статей, в которых описывались аналитические подходы с применением режима гидрофильной хроматографии [2, 3].
Популярность HILIC-режиму принесло сочетание жидкостной хроматографии с масс-спектроскопическим (МС) детектированием. Появились новые аналитические задачи из области протеомики и фармацевтики. Многие полипептиды и фармацевтические субстанции обладают высокой полярностью, для их разделения в обращенно-фазовом (ОФ) режиме подвижная фаза должна большей частью состоять из воды, что не всегда удобно с точки зрения МС-детектирования. Гидрофильный режим, в котором подвижная фаза обогащена органическим растворителем, выглядел весьма перспективным методом хроматографического разделения. По этой причине его "достали с пыльной полки" и начали применять вновь. Мода на HILIC началась в начале двухтысячных годов, а бум публикаций по гидрофильной хроматографии пришелся на 2004 год [4].
В процессе применения HILIC выяснилось, что гидрофильная хроматография полезна и как самостоятельный метод без оглядки на его применение исключительно в сочетании с ВЭЖХ/МС-инструментальным оформлением. Рассеялись также многие мифы прошлого, связанные с HILIC, например, о принципиально низкой эффективности разделения или о низкой гидролитической устойчивости силикагеля в условиях гидрофильной хроматографии. Тем не менее, закономерности данного режима до сих пор остаются исследованными очень плохо. Сейчас даже специалист не сможет внятно ответить на вопрос о том, какие вещества удерживаются в гидрофильной хроматографии лучше, а какие хуже. В такой ситуации важные задачи – накопление и систематизация хроматографических данных по удерживанию в HILIC-соединений различных химических классов.
В этой работе мы акцентировали внимание на изучении поведения в гидрофильном режиме двух классов полифенольных соединений: полярных гидроксикоричных кислот на примере кофеилхинных кислот и катехинов.
Разделение гидроксикоричных кислот кофе
Кофеилхинные кислоты, как следует из названия, являются сложными эфирами, которые состоят из двух структурных единиц: хинной кислоты и кофейной кислоты, где хинная кислота выступает в роли многоядерного спирта. В водном экстракте кофе содержатся как моно-, так и дикофеилхинные кислоты, т.е. с одним или с двумя остатками кофейной кислоты, присоединенными к хинной кислоте сложноэфирной связью. Наиболее широко известный представитель кофеилхинных кислот – 3-кофеилхинная, или хлорогеновая, кислота (рис.1). У хлорогеновой кислоты есть два изомера: 4-кофеилхинная и 5-кофеилхинная кислоты. В экстрактах кофе содержатся все три изомера.
Традиционный метод разделения – обращенно-фазовая (ОФ) хроматография на С18-силикагелях. Изомеры хлорогеновой кислоты и кофеин элюируются в порядке "3-, кофеин, 5-, 4-", дикофеилхинные кислоты элюируются после монокофеилхинных (рис.2).
Применяют также ОФ-разделение на С16-амидных силикагелях. Изомеры хлорогеновой кислоты и кофеин элюируются в порядке "3-, кофеин, 4-, 5-", дикофеилхинные кислоты также элюируются после монокофеилхинных (рис.3). По сравнению с "С18-вариантом" разделения, "16-амидное" характеризуется в целом более сильным удерживанием и лучшим разделением хлорогеновых кислот друг от друга и от сопутствующих минорных гидроксикоричных кислот. Большее удерживание наблюдается и для дикофеилхинных кислот, продолжительность анализа увеличивается, а это уже минус данной методики.
Более сильное удерживание и иную селективность разделения гидроксикоричных кислот на С16-амидных фазах можно объяснить, исходя из предположения о наблюдаемом смешанном ОФ/НФ (обращенно-фазовом/нормально-фазовом) режиме. Определенный вклад нормально-фазового режима в этом случае обусловлен наличием амидных групп в структуре адсорбента и наличием протон-донорных и протон-акцепторных (прежде всего, гидроксильных алифатических и фенольных) функциональных групп в составе целевых соединений. Исходя из этого предположения, в режиме гидрофильной хроматографии мы ожидали, что монокофеилхинные кислоты будут элюироваться после кофеина. Порядок элюирования изомеров предсказать не пытались, поскольку эксперимент проводили не на специальных амидных фазах для HILIC, а на традиционных силикагеле и силикагельной аминофазе.
Наиболее же интригующим был вопрос о порядке элюирования дикофеилхинных кислот: они либо должны были элюироваться полностью после, либо полностью до монокофеилхинных. В пользу первого свидетельствовало большее количество гидроксильных групп в дикофеилхинных кислотах (плюс две фенольные при минусе в одну алифатическую), в пользу второго – значительно больший размер их молекулы, так как существует тенденция, согласно которой в гидрофильном режиме при условии равного количества полярных функциональных групп сильнее удерживаются меньшие по размеру молекулы. На практике оказалось, что реализуется второй вариант: и на силикагеле, и на аминофазе в условиях гидрофильной хроматографии все дикофеилхинные кислоты элюируются до монокофеилхинных. Предположение об элюировании монокофеилхинных кислот после кофеина оправдалось для аминофазы, но не для силикагеля (рис.4). Порядок элюирования изомеров хлорогеновой кислоты и кофеина для аминофазы – "кофеин, 5-, 4-, 3-". Для силикагеля его установить не удалось из-за отсутствия разделения.
Оптимальный состав подвижной фазы для аминофазы – несколько процентов подкисленной воды в ацетонитриле. Пяти процентов достаточно для приемлемого разделения при минимальной продолжительности анализа. Для оптимизации разделения за счет увеличения удерживания содержание воды в подвижной фазе можно уменьшить до 2–3%. Увеличение температуры с 25 до 60°С существенно не влияет на удерживание целевых соединений в целом, лишь несколько изменяя селективность их разделения. Перепад давления при работе на 150×4,6 колонке с 3-мкм фазой на скорости 1,5 мл/мин составляет менее 100 атм (25°С). "Дружественная" гидродинамика хроматографической системы сокращает время анализа путем увеличения скорости потока до 3–4 мл/мин, либо существенно улучшает разделение за счет увеличения эффективности путем наращивания длины колонки до 250–300 мм (например, применяя две 150×4,6 колонки с 3-мкм фазой, соединенных последовательно).
Разделение в гидрофильном режиме имеет определенное преимущество перед разделением в обращенно-фазовых условиях. Поскольку дикофеилхинные кислоты элюируются до монокофеилхинных, после пика хлорогеновой кислоты хроматограмма однозначно может быть остановлена – дальше на длинах волн 270/330 нм на хроматограмме нет ни одного пика существенной интенсивности. Таким образом, все разделение ограничено фактором удерживания всего k' = 3 (в выбранных условиях элюирования). При изократическом элюировании в обращенно-фазовом режиме (на С18-фазах) из условия хорошего разделения хлорогеновых кислот автоматически следуют высокие значения удерживания дикофеилхинных кислот вплоть до k' = 40! Соответственно, разделение в гидрофильном режиме больше подходит для применения в рутинных аналитических методиках, чем разделение в ОФ-режиме, поскольку при изократическом элюировании за ограниченное k' = 3 полностью решаются две основные аналитические задачи: количественный анализ изомеров монокофеилхинных кислот (на длине волны 330 нм) и количественный анализ кофеина (на длине волны 270 нм).
Разделения же в ОФ-режиме на С18 или С16-амидных фазах больше подходят для исследовательских целей, поскольку позволяют достичь в целом больших величин разрешения пиков целевых соединений. Наиболее информативным, на наш взгляд, было бы разделение на С16-амидной фазе в условиях градиентного элюирования при правильно оптимизированном профиле градиента "вогнутой" формы. И еще небольшой комментарий, касающийся условий детектирования. Кофеин практически не поглощает на длине волны 330 нм. Совпадения пиков кофеина на 270 нм и некоторых пиков на длине волны 330 нм на рис.4а и рис.4б случайны. Соответственно, кофеин не может помешать детектированию гидроксикоричных кислот, но обратное не верно: гидроксикоричные кислоты поглощают на длине волны 270 нм, и наложение их пиков на пик кофеина может привести к завышенным результатам определения кофеина. Подобное наложение не критично для разделения в гидрофильном режиме, поскольку на пик кофеина накладываются минорные пики дикофеилхинных кислот. Тем не менее, для аналитических целей специфичность детектирования кофеина можно повысить, установив вместо 270-нм волну в диапазоне 290–300 нм. В спектрах гидроксикоричных кислот в этом диапазоне наблюдается "провал", а кофеин все еще обладает существенным поглощением.
Разделение
катехинов зеленого чая
Катехины – основные полифенольные компоненты зеленого и белого чая. Как правило, в спиртовых экстрактах зеленого чая определяют четыре катехина: эпигаллокатехин, эпикатехин, галлат эпигаллокатехина (рис.5) и галлат эпикатехина.
Традиционный метод анализа – обращенно-фазовая хроматография (рис.6). В принципе, ОФ-разделение катехинов лишено каких-либо существенных недостатков. Небольшой минус селективности обращенно-фазовой системы состоит в том, что последний пик эпикатехингаллата имеет довольно высокое удерживание (расположен немного "на отшибе") и за счет этого увеличивает общее время хроматографирования. Попытка экстенсивными способами (т.е. не меняя селективность) уменьшить время анализа приводит к ухудшению разделения критической пары эпикатехин/эпигаллокатехингаллат. Таким образом, разумный ресурс удерживания для разделения катехинов в ОФ-режиме составляет порядка k' = 7.
Интересно такое альтернативное разделение, селективность которого обеспечивала бы сопоставимое разрешение при существенно меньших затратах k'. В принципе, полученное на аминофазе разделение катехинов в режиме гидрофильной хроматографии отвечает этому условию (рис.7). В условиях гидрофильной хроматографии на аминофазе катехины элюируются после кофеина в порядке "эпикатехин, галлат эпикатехина, эпигаллокатехин, галлат эпигаллокатехина", который в целом соответствует увеличению полярности целевых соединений. Увеличение температуры с 25 до 60°С, как и для оксикоричных кислот, не приводит к существенному изменению удерживания целевых соединений, однако несколько улучшает селективность их разделения. При использовании в качестве подвижной фазы 5%-ного раствора подкисленной воды в ацетонитриле разделение занимает всего k' = 1,3. При этом перепад давления при работе на 150×4,6 колонке с 3-мкм фазой на скорости 1,5 мл/мин составляет менее 50 атм (при 60°С).
Разрешение на рис.7, конечно, меньше, чем на ОФ-хроматограмме на рис.6, но простое масштабирование разделения (например, с наращиванием длины колонки и скорости потока) показывает, что сопоставимого по величине разрешения в гидрофильном режиме можно добиться за время, по крайней мере, вдвое меньшее, чем длительность анализа в обращенно-фазовом режиме. Соответственно, альтернативное разделение катехинов методом гидрофильной хроматографии не лишено некоторого преимущества.
Выводы
Оптимальный баланс скорости анализа и эффективности разделения при использовании трехмикронных адсорбентов достигается при длине колонки не менее 250–300 мм. Таким образом, при работе с 3-мкм фазами в гидрофильной хроматографии целесообразно применять либо коммерчески доступные 250-мм колонки, либо связки по две 150-мм колонки. Для лучшего разделения можно конструировать и более длинные связки.
При разделении природных соединений в гидрофильном режиме наблюдается тенденция, согласно которой аминофаза показывает лучшие результаты, чем силикагель, и фазы с большей удельной площадью выигрывают у фаз с меньшей удельной поверхностью.
Повышение температуры не оказывает заметного влияния на удерживание природных соединений на аминофазе в гидрофильном режиме, лишь немного изменяя селективность. При этом при повышении температуры закономерно снижается вязкость подвижных фаз, в результате чего оптимальный баланс скорости анализа и эффективности разделения, по всей видимости, смещается в пользу 150-мм колонок с 2-мкм адсорбентами. В этом случае вопросы уже вызывают гидролитическая стабильность таких упаковок при повышенных температурах и вообще технологическая возможность их производства.
На аминофазе в гидрофильном режиме (5% подкисленной воды в ацетонитриле) дикофеилхинные кислоты элюируются до монокофеилхинных. Монокофеилхинные кислоты элюируются после кофеина, порядок их элюирования: 5-, 4-, 3-.
На аминофазе в гидрофильном режиме (5% подкисленной воды в ацетонитриле) катехины элюируются после кофеина в порядке эпикатехин, галлат эпикатехина, эпигаллокатехин, галлат эпигаллокатехина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Alpert A. Hydrophilic-interaction chromato-graphy for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. – Journal of Chromatography, 1990, v.499, p.177–196.
2. Гусаров А., Сапрыкин Л., Киселева Н. Методика определения пантотената кальция методом ВЭЖХ с применением нетрадиционного режима хроматографии на силикагеле. – Заводская лаборатория, 1992, т.58, №11,c.7–9.
3. Сапрыкин Л., Киселева Н, Васильев В. Хроматографический анализ витамина В6 и полупродуктов его синтеза. – Заводская лаборатория, 1990, т.56, №1, с.49–54.
4. Grumbach E. Silica Columns for the Retention of Polar Analytes and Enhanced ESI-MS Sensitivity. – LCGC NORTH AMERICA, 2004, v.22, №10, p.1010–1023.
http://www.chromatographyonline.com/lcgc/data/articlestandard/lcgc/402004/126190/
article.pdf
Популярность HILIC-режиму принесло сочетание жидкостной хроматографии с масс-спектроскопическим (МС) детектированием. Появились новые аналитические задачи из области протеомики и фармацевтики. Многие полипептиды и фармацевтические субстанции обладают высокой полярностью, для их разделения в обращенно-фазовом (ОФ) режиме подвижная фаза должна большей частью состоять из воды, что не всегда удобно с точки зрения МС-детектирования. Гидрофильный режим, в котором подвижная фаза обогащена органическим растворителем, выглядел весьма перспективным методом хроматографического разделения. По этой причине его "достали с пыльной полки" и начали применять вновь. Мода на HILIC началась в начале двухтысячных годов, а бум публикаций по гидрофильной хроматографии пришелся на 2004 год [4].
В процессе применения HILIC выяснилось, что гидрофильная хроматография полезна и как самостоятельный метод без оглядки на его применение исключительно в сочетании с ВЭЖХ/МС-инструментальным оформлением. Рассеялись также многие мифы прошлого, связанные с HILIC, например, о принципиально низкой эффективности разделения или о низкой гидролитической устойчивости силикагеля в условиях гидрофильной хроматографии. Тем не менее, закономерности данного режима до сих пор остаются исследованными очень плохо. Сейчас даже специалист не сможет внятно ответить на вопрос о том, какие вещества удерживаются в гидрофильной хроматографии лучше, а какие хуже. В такой ситуации важные задачи – накопление и систематизация хроматографических данных по удерживанию в HILIC-соединений различных химических классов.
В этой работе мы акцентировали внимание на изучении поведения в гидрофильном режиме двух классов полифенольных соединений: полярных гидроксикоричных кислот на примере кофеилхинных кислот и катехинов.
Разделение гидроксикоричных кислот кофе
Кофеилхинные кислоты, как следует из названия, являются сложными эфирами, которые состоят из двух структурных единиц: хинной кислоты и кофейной кислоты, где хинная кислота выступает в роли многоядерного спирта. В водном экстракте кофе содержатся как моно-, так и дикофеилхинные кислоты, т.е. с одним или с двумя остатками кофейной кислоты, присоединенными к хинной кислоте сложноэфирной связью. Наиболее широко известный представитель кофеилхинных кислот – 3-кофеилхинная, или хлорогеновая, кислота (рис.1). У хлорогеновой кислоты есть два изомера: 4-кофеилхинная и 5-кофеилхинная кислоты. В экстрактах кофе содержатся все три изомера.
Традиционный метод разделения – обращенно-фазовая (ОФ) хроматография на С18-силикагелях. Изомеры хлорогеновой кислоты и кофеин элюируются в порядке "3-, кофеин, 5-, 4-", дикофеилхинные кислоты элюируются после монокофеилхинных (рис.2).
Применяют также ОФ-разделение на С16-амидных силикагелях. Изомеры хлорогеновой кислоты и кофеин элюируются в порядке "3-, кофеин, 4-, 5-", дикофеилхинные кислоты также элюируются после монокофеилхинных (рис.3). По сравнению с "С18-вариантом" разделения, "16-амидное" характеризуется в целом более сильным удерживанием и лучшим разделением хлорогеновых кислот друг от друга и от сопутствующих минорных гидроксикоричных кислот. Большее удерживание наблюдается и для дикофеилхинных кислот, продолжительность анализа увеличивается, а это уже минус данной методики.
Более сильное удерживание и иную селективность разделения гидроксикоричных кислот на С16-амидных фазах можно объяснить, исходя из предположения о наблюдаемом смешанном ОФ/НФ (обращенно-фазовом/нормально-фазовом) режиме. Определенный вклад нормально-фазового режима в этом случае обусловлен наличием амидных групп в структуре адсорбента и наличием протон-донорных и протон-акцепторных (прежде всего, гидроксильных алифатических и фенольных) функциональных групп в составе целевых соединений. Исходя из этого предположения, в режиме гидрофильной хроматографии мы ожидали, что монокофеилхинные кислоты будут элюироваться после кофеина. Порядок элюирования изомеров предсказать не пытались, поскольку эксперимент проводили не на специальных амидных фазах для HILIC, а на традиционных силикагеле и силикагельной аминофазе.
Наиболее же интригующим был вопрос о порядке элюирования дикофеилхинных кислот: они либо должны были элюироваться полностью после, либо полностью до монокофеилхинных. В пользу первого свидетельствовало большее количество гидроксильных групп в дикофеилхинных кислотах (плюс две фенольные при минусе в одну алифатическую), в пользу второго – значительно больший размер их молекулы, так как существует тенденция, согласно которой в гидрофильном режиме при условии равного количества полярных функциональных групп сильнее удерживаются меньшие по размеру молекулы. На практике оказалось, что реализуется второй вариант: и на силикагеле, и на аминофазе в условиях гидрофильной хроматографии все дикофеилхинные кислоты элюируются до монокофеилхинных. Предположение об элюировании монокофеилхинных кислот после кофеина оправдалось для аминофазы, но не для силикагеля (рис.4). Порядок элюирования изомеров хлорогеновой кислоты и кофеина для аминофазы – "кофеин, 5-, 4-, 3-". Для силикагеля его установить не удалось из-за отсутствия разделения.
Оптимальный состав подвижной фазы для аминофазы – несколько процентов подкисленной воды в ацетонитриле. Пяти процентов достаточно для приемлемого разделения при минимальной продолжительности анализа. Для оптимизации разделения за счет увеличения удерживания содержание воды в подвижной фазе можно уменьшить до 2–3%. Увеличение температуры с 25 до 60°С существенно не влияет на удерживание целевых соединений в целом, лишь несколько изменяя селективность их разделения. Перепад давления при работе на 150×4,6 колонке с 3-мкм фазой на скорости 1,5 мл/мин составляет менее 100 атм (25°С). "Дружественная" гидродинамика хроматографической системы сокращает время анализа путем увеличения скорости потока до 3–4 мл/мин, либо существенно улучшает разделение за счет увеличения эффективности путем наращивания длины колонки до 250–300 мм (например, применяя две 150×4,6 колонки с 3-мкм фазой, соединенных последовательно).
Разделение в гидрофильном режиме имеет определенное преимущество перед разделением в обращенно-фазовых условиях. Поскольку дикофеилхинные кислоты элюируются до монокофеилхинных, после пика хлорогеновой кислоты хроматограмма однозначно может быть остановлена – дальше на длинах волн 270/330 нм на хроматограмме нет ни одного пика существенной интенсивности. Таким образом, все разделение ограничено фактором удерживания всего k' = 3 (в выбранных условиях элюирования). При изократическом элюировании в обращенно-фазовом режиме (на С18-фазах) из условия хорошего разделения хлорогеновых кислот автоматически следуют высокие значения удерживания дикофеилхинных кислот вплоть до k' = 40! Соответственно, разделение в гидрофильном режиме больше подходит для применения в рутинных аналитических методиках, чем разделение в ОФ-режиме, поскольку при изократическом элюировании за ограниченное k' = 3 полностью решаются две основные аналитические задачи: количественный анализ изомеров монокофеилхинных кислот (на длине волны 330 нм) и количественный анализ кофеина (на длине волны 270 нм).
Разделения же в ОФ-режиме на С18 или С16-амидных фазах больше подходят для исследовательских целей, поскольку позволяют достичь в целом больших величин разрешения пиков целевых соединений. Наиболее информативным, на наш взгляд, было бы разделение на С16-амидной фазе в условиях градиентного элюирования при правильно оптимизированном профиле градиента "вогнутой" формы. И еще небольшой комментарий, касающийся условий детектирования. Кофеин практически не поглощает на длине волны 330 нм. Совпадения пиков кофеина на 270 нм и некоторых пиков на длине волны 330 нм на рис.4а и рис.4б случайны. Соответственно, кофеин не может помешать детектированию гидроксикоричных кислот, но обратное не верно: гидроксикоричные кислоты поглощают на длине волны 270 нм, и наложение их пиков на пик кофеина может привести к завышенным результатам определения кофеина. Подобное наложение не критично для разделения в гидрофильном режиме, поскольку на пик кофеина накладываются минорные пики дикофеилхинных кислот. Тем не менее, для аналитических целей специфичность детектирования кофеина можно повысить, установив вместо 270-нм волну в диапазоне 290–300 нм. В спектрах гидроксикоричных кислот в этом диапазоне наблюдается "провал", а кофеин все еще обладает существенным поглощением.
Разделение
катехинов зеленого чая
Катехины – основные полифенольные компоненты зеленого и белого чая. Как правило, в спиртовых экстрактах зеленого чая определяют четыре катехина: эпигаллокатехин, эпикатехин, галлат эпигаллокатехина (рис.5) и галлат эпикатехина.
Традиционный метод анализа – обращенно-фазовая хроматография (рис.6). В принципе, ОФ-разделение катехинов лишено каких-либо существенных недостатков. Небольшой минус селективности обращенно-фазовой системы состоит в том, что последний пик эпикатехингаллата имеет довольно высокое удерживание (расположен немного "на отшибе") и за счет этого увеличивает общее время хроматографирования. Попытка экстенсивными способами (т.е. не меняя селективность) уменьшить время анализа приводит к ухудшению разделения критической пары эпикатехин/эпигаллокатехингаллат. Таким образом, разумный ресурс удерживания для разделения катехинов в ОФ-режиме составляет порядка k' = 7.
Интересно такое альтернативное разделение, селективность которого обеспечивала бы сопоставимое разрешение при существенно меньших затратах k'. В принципе, полученное на аминофазе разделение катехинов в режиме гидрофильной хроматографии отвечает этому условию (рис.7). В условиях гидрофильной хроматографии на аминофазе катехины элюируются после кофеина в порядке "эпикатехин, галлат эпикатехина, эпигаллокатехин, галлат эпигаллокатехина", который в целом соответствует увеличению полярности целевых соединений. Увеличение температуры с 25 до 60°С, как и для оксикоричных кислот, не приводит к существенному изменению удерживания целевых соединений, однако несколько улучшает селективность их разделения. При использовании в качестве подвижной фазы 5%-ного раствора подкисленной воды в ацетонитриле разделение занимает всего k' = 1,3. При этом перепад давления при работе на 150×4,6 колонке с 3-мкм фазой на скорости 1,5 мл/мин составляет менее 50 атм (при 60°С).
Разрешение на рис.7, конечно, меньше, чем на ОФ-хроматограмме на рис.6, но простое масштабирование разделения (например, с наращиванием длины колонки и скорости потока) показывает, что сопоставимого по величине разрешения в гидрофильном режиме можно добиться за время, по крайней мере, вдвое меньшее, чем длительность анализа в обращенно-фазовом режиме. Соответственно, альтернативное разделение катехинов методом гидрофильной хроматографии не лишено некоторого преимущества.
Выводы
Оптимальный баланс скорости анализа и эффективности разделения при использовании трехмикронных адсорбентов достигается при длине колонки не менее 250–300 мм. Таким образом, при работе с 3-мкм фазами в гидрофильной хроматографии целесообразно применять либо коммерчески доступные 250-мм колонки, либо связки по две 150-мм колонки. Для лучшего разделения можно конструировать и более длинные связки.
При разделении природных соединений в гидрофильном режиме наблюдается тенденция, согласно которой аминофаза показывает лучшие результаты, чем силикагель, и фазы с большей удельной площадью выигрывают у фаз с меньшей удельной поверхностью.
Повышение температуры не оказывает заметного влияния на удерживание природных соединений на аминофазе в гидрофильном режиме, лишь немного изменяя селективность. При этом при повышении температуры закономерно снижается вязкость подвижных фаз, в результате чего оптимальный баланс скорости анализа и эффективности разделения, по всей видимости, смещается в пользу 150-мм колонок с 2-мкм адсорбентами. В этом случае вопросы уже вызывают гидролитическая стабильность таких упаковок при повышенных температурах и вообще технологическая возможность их производства.
На аминофазе в гидрофильном режиме (5% подкисленной воды в ацетонитриле) дикофеилхинные кислоты элюируются до монокофеилхинных. Монокофеилхинные кислоты элюируются после кофеина, порядок их элюирования: 5-, 4-, 3-.
На аминофазе в гидрофильном режиме (5% подкисленной воды в ацетонитриле) катехины элюируются после кофеина в порядке эпикатехин, галлат эпикатехина, эпигаллокатехин, галлат эпигаллокатехина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Alpert A. Hydrophilic-interaction chromato-graphy for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. – Journal of Chromatography, 1990, v.499, p.177–196.
2. Гусаров А., Сапрыкин Л., Киселева Н. Методика определения пантотената кальция методом ВЭЖХ с применением нетрадиционного режима хроматографии на силикагеле. – Заводская лаборатория, 1992, т.58, №11,c.7–9.
3. Сапрыкин Л., Киселева Н, Васильев В. Хроматографический анализ витамина В6 и полупродуктов его синтеза. – Заводская лаборатория, 1990, т.56, №1, с.49–54.
4. Grumbach E. Silica Columns for the Retention of Polar Analytes and Enhanced ESI-MS Sensitivity. – LCGC NORTH AMERICA, 2004, v.22, №10, p.1010–1023.
http://www.chromatographyonline.com/lcgc/data/articlestandard/lcgc/402004/126190/
article.pdf
Отзывы читателей
