eng
Выпуск #5/2012
М.Дикунец, И.Прасолов, И.Суханова, Т.Соболевский, Г.Родченков
Изучение метаболизма новых допинговых препаратов методом in vitro для их последующего определения в биожидкости человека Часть I. Селективные модуляторы андрогенных рецепторов
Изучение метаболизма новых допинговых препаратов методом in vitro для их последующего определения в биожидкости человека Часть I. Селективные модуляторы андрогенных рецепторов
Просмотры: 5573
Авторы предлагают методологию определения допинговых веществ из Запрещенного списка Всемирного антидопингового агентства в биожидкостях человека на основе данных исследований in vitro.
Теги: in vitro in vivo metabolism sarm (selective androgen receptor modulator) метаболизм смар (селективный модулятор андрогенных рецепторов)
Фармакологическая индустрия не стоит на месте: на рынке постоянно появляются новые препараты. В связи с этим Запрещенный список веществ и методов Всемирного Антидопингового агентства (ВАДА) обновляется каждый год [1]. В 2009 году в него внесены новые классы допинговых препаратов – селективные модуляторы андрогенных рецепторов (СМАР) – синтетические аналоги андрогенов, связывающиеся с андрогенными рецепторами с высокой степенью избирательности к определенным типам тканей. Пока ни один СМАР не прошел полный цикл клинических исследований и не продается официально, однако S-4 (андарин) и S-22 (остарин), наиболее близкие с тестостероном по анаболическому действию, уже появились на черном рынке пищевых добавок. Они не имеют характерных для тестостерона побочных эффектов, способствуют наращиванию мышечной массы, увеличению силовых показателей и выносливости.
Кроме того, в последние годы рынок наркотических средств многих стран существенно расширился за счет класса синтетических каннабиноидов. Это нафтоилиндолы JWH-018 и другие, AM-2201, AM-2233, тетраметилциклопропилиндолы – UR-144, XLR-11, адамантилкарсоксамиды – AB-001, APINACA. Они поступают в продажу под видом ароматических курительных смесей. До января 2010 года курительные смеси открыто продавались в РФ через Интернет и успели приобрести статус легальной альтернативы продуктам на основе марихуаны. Активность этих соединений на каннабиноидные рецепторы человека выше, чем у продуктов, выделенных из конопли. Запрет на оборот синтетических каннабиноидов в РФ последовал после ряда тяжелых отравлений в 2009 году, связанных с употреблением курительных смесей. В 2010 году ВАДА ввело каннабимиметики в Запрещенный список препаратов и методов.
Разработка эффективной скрининговой процедуры для допинг-контроля невозможна без изучения путей биотрансформации соединений, внесенных в Запрещенный список веществ и методов ВАДА, поскольку многие вещества, попав в организм человека, подвергаются изменению и выделяются в виде метаболитов. Данные по систематическому изучению метаболизма в организме человека новых допинговых препаратов и их выведения из организма ограничены, поскольку СМАРы проходят различные стадии клинических исследований. В настоящее время стали коммерчески доступными предполагаемые метаболиты некоторых наиболее часто встречающихся каннабимиметиков, однако рынок наркотических веществ постоянно пополняется новыми модифицированными аналогами известных синтетических каннабиноидов, информация о метаболизме которых в организме человека отсутствует.
В основе биотрансформации по большей части лежат ферментативные реакции преобразования молекул. Биологический смысл метаболизма – превращение химического вещества в форму, удобную для выведения из организма и, тем самым, сокращение времени его действия. Выделяют две фазы метаболизма препаратов. В ходе фазы I метаболизма (несинтетические реакции) к молекуле соединения присоединяется функциональная группа, например, –ОН, –NH2, –SH, либо эта группа становится доступной в результате химических превращений. Основные реакции фазы I – реакции окисления, из которых наиболее распространены реакции гидроксилирования. К менее частым реакциям фазы I относят процессы восстановления и гидролиза. В ходе фазы II (синтетические реакции) образуется ковалентная связь между функциональной группой препарата или его метаболита и эндогенными соединениями: глюкуроновой кислотой, сульфатом, ацетатом, глутатионом, аминокислотами. Глюкуронидация является основным путем биотрансформации препаратов у многих видов млекопитающих за исключением семейства кошачьих.
Традиционно процессы абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции, характеризующие фармакокинетический профиль вещества, изучаются в экспериментах in vivo на лабораторных животных. Основанием для данного подхода служит генетическое сходство млекопитающих и вытекающая отсюда схожая физиологическая реакция человеческого организма на введение соединения. Вместе с тем у животных разных видов и человека биотрансформации одних и тех же препаратов обладают своей спецификой, поскольку ферменты, участвующие в превращениях чужеродных веществ, часто видоспецифичны. Так, например, метаболический профиль бикалютамида – антиандрогена, используемого при лечении рака простаты [2], отличается у разных видов (рис.1) [3]. G.W.Boyle показал, что от 20 до 30% дозы бикалютамида, полученной мышами и крысами, выводилось после гидролиза в виде метаболитов 1 и 2, однако у собак и кроликов этих метаболитов практически не наблюдалось. Бикалютамид и его метаболиты склонны к образованию глюкуронидов. У мышей и крыс этот метаболит выводится с фекалиями, у людей и собак – с мочой. Таким образом, из-за межвидовых различий для изучения метаболизма необходимо использовать несколько видов животных, при этом для достижения статистической достоверности количество особей должно составлять значительное число.
В список ограничений использования лабораторных животных для изучения метаболизма допинговых соединений входят этические проблемы, но не менее важны экономические и временные затраты. Стоит отметить, что исследования в условиях in vitro позволяют практически полностью заменить экспериментальные исследования на животных и частично – клинические испытания. Клеточные культуры различных типов тканей человека и животных используют для изучения механизма действия, всасываемости, метаболизма лекарств и наличия побочных эффектов на клеточном уровне. Главное преимущество исследований in vitro – возможность проведения эксперимента непосредственно на тканях человека. В перспективе подобные исследования должны привести к созданию оптимальных моделей in vitro, наиболее адекватно отражающих ситуацию in vivo.
В организме человека лекарственные средства метаболизируются несколькими ферментными системами, основной из которых является суперсемейство цитохромов P450 [4]. Около 75% препаратов метаболизируется цитохромами P450, в основном 3A4, 2C9, 2C19, 2D6 и 1A2. Эти ферменты осуществляют ароматическое и алифатическое гидроксилирование, N-деалкилирование, C-окисление с образованием кетонов, альдегидов, карбоновых кислот, O-деалкилирование, разрыв сложноэфирной связи, дегалогенирование [5]. Под воздействием одного и того же цитохрома субстраты могут подвергаться одной или более реакциям, в то же время некоторые из реакций биотрансформации осуществляются более чем одним цитохромом и, напротив, некоторые реакции являются уникальными для конкретной изоформы. В связи с этим, для изучения фазы I метаболизма новых допинговых препаратов выбраны микросомы человека CYP3A4 с ДНК-экспрессированной редуктазой, микросомы CYP2В6 с ДНК-экспрессированной редуктазой, микросомы Р450 с оксиредуктазой из клеток насекомых и микросомы печени человека HLM 150, отвечающие за разные пути биотрансформации препарата в организме человека. Для изучения фазы II биотрансформации соединений использовали ДНК-экспрессированные УДФ-глюкуронозилтрансферазы человека, относящиеся к разным семействам, – УГТ1А9, УГТ1А8 и УГТ2В7, контрольные микросомы УГТ человека и микросомы печени человека HLM 150.
В качестве объектов исследования выбраны новые допинговые препараты, появившиеся на рынке спортивной фармакологии – СМАРы (остарин, андарин), а также синтетические каннабиноиды – фторированный аналог JWH-018 (AM-2201) и UR-144. Поскольку информация о метаболизме этих соединений в организме человека ограничена, целью данной работы было изучение путей биотрансформации веществ в условиях in vitro для идентификации метаболитов, а также сравнение полученных данных с полученными в эксперименте in vivo.
Образцы для исследования фазы I и II метаболизма допинговых препаратов в условиях in vitro готовили согласно стандартным процедурам, приведенными на сайте производителя [6, 7]. Дополнительно анализировали два холостых образца в каждой партии инкубационных реакций: одна проба содержала все компоненты реакционной смеси за исключением субстрата для проверки наличия потенциальных загрязняющих компонентов, имитирующих метаболиты, другая проба содержала все компоненты пробы фракции микросом печени человека для проверки возможности неферментативных реакций во время инкубации.
Пробоподготовку образцов мочи проводили согласно разработанным нашей лабораторией методикам определения нелетучих соединений, находящихся в моче в коньюгированном и/или неконьюгированном ("свободном") виде – прямой анализ мочи, анализ свободной и гидролизной фракций.
Пробоподготовка мочи для прямого анализа: в центрифужную микропробирку объемом 1,7 мл помещали 200 мкл образца мочи, добавляли 800 мкл раствора-разбавителя (раствор мефрузида 30 нг/мл в смеси вода/метанол/муравьиная кислота (97/2,9/0,1 об.%), центрифугировали при 14000 об./мин в течение 10 мин, супернатант переносили в виалу.
Пробоподготовка мочи для получения гидролизной фракции: к образцу мочи (3 мл) добавляли 1,0 мл фосфатного буферного раствора (0,8 М; рН 6,5), содержащего 30 мкл β-глюкуронидазы и 0,3 мкг метилтестостерона. После инкубации в течение часа при температуре 57°С образец подщелачивали 1 мл карбонатного буферного раствора (3 М, рН 10), проводили жидкостно-жидкостную экстракцию в течение 10 мин 5 мл диэтилового эфира в присутствии сульфата аммония, центрифугировали при 3000 об./мин в течение 4 мин и органический растворитель упаривали досуха при температуре 70°C. Сухой остаток перерастворяли в 50 мкл метанола, затем добавляли 50 мкл воды, полученный экстракт переносили в виалу. В случае анализа неконъюгированной фракции стадию инкубирования с β-глюкуронидазой опускали.
Анализ методом сверхпроизводительной высокоэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ) проводили на хроматографе модели Acquity UPLC (Waters, США) с системой автоматического ввода образцов (автосамплер), автоматическим податчиком образцов, термостатом колонки и дегазатором. Хроматограф подключали к тандемному масс-спектрометрометру TSQ Quantum Access Max (Thermo Scientific, США) с электрораспылительной ионизацией с нагреваемым потоком (ЭРИ). Сбор и обработка данных осуществлялись с применением программного обеспечения Xcalibur, версия 2.1.
Для разделения соединений использовали колонку Acquity UPLC BEH C18 2,1×100, размер частиц 1,7 мкм (Waters, Ирландия). Скорость потока подвижной фазы 350 мкл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в воде (А) и метаноле (В). Начальный состав подвижной фазы: 95% А и 5% В, изменяемый в течение 5 мин до 95% В. После 2,5 мин при 95% В осуществляли возврат состава подвижной фазы к исходным параметрам. Общее время анализа – 10 мин. Для понижения общего рабочего давления системы использовали термостатирование колонки при 60°С. Объем вводимой пробы составлял 5 мкл.
Для поиска метаболитов соединений, образующихся в результате реакций фазы I и II метаболизма в эксперименте in vitro, а также в условиях in vivo, использовали режимы регистрации полного ионного тока и сканирования ионов-предшественников. Детальный анализ масс-спектров, полученных в результате столкновительной диссоциации в камере соударений ионов-предшественников, позволил сделать предположение о возможных путях биотрансформации изучаемых соединений.
Анализ образцов до и после проведения реакции фазы I метаболизма остарина показал, что в условиях in vitro основные процессы биотрансформации СМАРа – гидроксилирование, дезфенилирование и декарбоксилирование. На рис.2 представлена масс-хроматограмма различных метаболитов остарина, полученная при инкубации вещества с микросомами 3А4. Предложенные на основе масс-спектров, полученных в условиях диссоциации, индуцированной соударениями, структуры метаболитов представлены на рис.3.
При изучении активности различных изоферментов в процессе биотрансформации остарина в условиях in vitro обнаружили, что микросомы CYP2В6 и Р450 в реакциях фазы I метаболизма СМАР активности не проявляют, в то время как под воздействием микросом печени человека HLM150 и изофермента CYP3А4 субстрат подвергается реакции гидроксилирования, дезфенилирования и последующего декарбоксилирования (рис.4). Данные виды изофермента цитохрома (HLM150, CYP3А4) обладают высокой активностью, но имеют низкую специфичность. Наибольшую концентрацию метаболитов остарина наблюдали при использовании изофермента CYP3А4.
В реакции фазы II метаболизма остарин, содержащий гидроксильную группу, взаимодействует с глюкуроновой кислотой с образованием О-глюкуронового эфира. Сравнительный анализ данных по активности различных изоферментов в реакции фазы II метаболизма СМАР в условиях in vitro показал, что микросомы УГТ1А8 и контрольные микросомы человека не участвуют в конъюгации субстрата. Образование глюкуронида остарина в присутствии ферментов УГТ2В7 и УГТ1А9 происходит лишь в незначительной степени. Наибольшую активность в реакции фазы II метаболизма данного СМАРа проявил изофермент HLM150 (рис.5).
Основные стадии биотрансформации остарина в организме человека – окисление/гидроксилирование, дезфенилирование и/или реакция конъюгации с глюкуроновой и серной кислотами. В отличие от эксперимента in vitro, в котором наблюдали только гидроксилирование кольца В (метаболит 1а), в условиях in vivo наряду с этим процессом протекает гидроксилирование по алифатическому углероду (метаболит 1б) (см. рис.3). В организме человека метаболита 1а образуется в 50 раз больше, чем метаболита 1б. Кроме этого, в моче после приема остарина обнаружен его дигидроксиметаболит (метаболит 5). Локализацию ОН-групп доказал детальный анализ масс-спектров, полученных в условиях диссоциации, индуцированной соударениями, при этом оказалось, что одна гидроксильная группа находится в кольце В, а вторая – в 20-м положении (см. рис.3). Как и в эксперименте in vitro, в организме человека после приема остарина образуются метаболиты 2 и 3, однако они не представляют диагностической ценности, так как являются минорными. Метаболит 4 – дезфенилированное и карбоксилированное производное остарина, обнаружен только в моче после приема СМАР.
Рассмотрим подробнее возможные структуры глюкуронидов гидроксиметаболитов, образующиеся в организме человека в результате протекания реакции фазы II (см. рис.3). Первая комбинация – глюкуроновая кислота присоединяется к гидроксигруппе кольца В; вторая – глюкуроновый остаток находится у хирального атома углерода (С-2), а гидроксильная группа кольца В остается интактной; третья – гидроксигруппа находится у 20-го атома углерода (С-20), остаток глюкуроновой кислоты присоединяется к гидроксигруппе, находящейся при С-2 (структура не приведена на рис.3). Все вышеперечисленные глюкурониды гидроксиметаболитов образуют депротонированную молекулу с m/z 580, однако из-за различного местоположения как гидроксигруппы, так и остатка глюкуроновой кислоты пути фрагментации будут разными. При прямом анализе мочи с пятикратным разбавлением после разового приема остарина идентифицировали только один глюкуронид метаболита 1а.
Для определения наиболее долгоживущих метаболитов в работе изучена фармакокинетика остарина и его основных метаболитов. Для построения кривых выведения СМАР и метаболитов проанализированы образцы мочи добровольца после разбавления и экстракты свободной и гидролизной фракций. Остарин выводится из организма человека в нативном виде, а также в виде метаболитов, максимальные концентрации которых наблюдаются через 18–24 ч после приема препарата, при этом только 10–15% препарата и образующихся метаболитов находятся в свободном виде, а 85–90% – в виде глюкуроноконъюгатов. Основной процесс выведения происходит в течение 5 суток. Период полувыведения препарата (Т1/2) – время для снижения максимальной концентрации наполовину составляет 48 ч. Основными метаболитами остарина являются гидроксиметаболит (метаболит 1а, рис.3) и дезфенилметаболит (метаболит 2, рис.3).
Наибольшую диагностическую ценность при прямом анализе мочи после пятикратного разбавления представляют глюкурониды остарина и его метаболита 1а, позволяющие идентифицировать прием препарата спустя 8 дней. Поскольку остарин и его метаболиты элиминируются в виде конъюгатов, анализ свободной фракции мочи методом СВЭЖХ–МС/МС позволяет определять СМАР в течение 6 суток после приема, в то время как анализ гидролизной фракции – более 10 суток.
Основными направлениями метаболизма другого СМАР, имеющего арилпропионамидную структуру, – андарина при проведении реакции фазы I метаболизма в условиях in vitro являются гидроксилирование (метаболит 1), деацетилирование (метаболит 2) и гидролиз по связи кислород–углерод (метаболит 3). Дальнейшее гидроксилирование кольца А или В метаболита 2 может приводить к образованию метаболита 4, однако эти возможные метаболиты андарина в in vitro эксперименте не обнаружены. В ходе проведения фазы II глюкуроновая кислота взаимодействует с гидроксильной группой андарина с образованием О-глюкуронового эфира. Возможные структуры идентифицированных метаболитов фазы I и II андарина представлены на рис.6.
Прямой анализ мочи до и после однократного приема андарина показал, что СМАР из организма выводится как в нативном виде, так и в виде свободных и конъюгированных метаболитов. На рис.7 показаны масс-хроматограммы образцов мочи (пятикратное разбавление и экстракт гидролизной фракции) после однократного приема андарина.
Биотрансформация андарина в организме человека согласуется с данными, полученными ранее в условиях in vitro. В процессе его биотрансформации образуются гидроксиметаболит (метаболит 1), дезацетилметаболит (метаболит 2), дезфенилметаболит (метаболит 3) (см. рис.6). Образование дезацетилгидроксиметаболита (метаболит 4) наблюдали только в условиях in vivo. Процесс гидроксилирования исходного соединения и дезацетилметаболита проходит по кольцу В, а кольцо А остается интактным. В отличие от собак и крыс, у которых основным направлением биотрансформации андарина является процесс восстановления нитрогруппы кольца А [8–9], в организме человека образования данного метаболита не происходит. В моче после приема андарина также идентифицировали дигидроксилированный метаболит (метаболит 5). СМАР и все его метаболиты выводятся в мочу главным образом в виде конъюгатов с глюкуроновой кислотой, только дезацетилгидроксиметаболит (метаболит 4) образует не только глюкуронид, но и конъюгат с серной кислотой.
Для определения наиболее долгоживущих метаболитов изучена фармакокинетика андарина и его основных метаболитов. СМАР из организма человека выводится в неизменном виде и в виде метаболитов, которые практически полностью конъюгированы с глюкуроновой и серной кислотами, что делает необходимым проведение предварительного гидролиза. Около 10% от всего количества андарина присутствует в свободной фракции. Наиболее долгоживущим метаболитом является сульфоконъюгат дезацетилгидроксиметаболита, который не разрушается при проведении ферментативного гидролиза с E. Coli. Для определения андарина предпочтителен прямой анализ мочи или анализ гидролизной фракции, при этом прямым анализом с применением метода СВЭЖХ–МС/МС возможно определять СМАР и его метаболиты в течение 7 суток, а анализ гидролизной фракции позволяет детектировать андарин в течение 9 дней. Основной процесс выведения происходит в течение 24 ч. Период полувыведения препарата (Т1/2) составляет 12,5 ч. Основными метаболитами андарина являются метаболит 3 и метаболит 4.
Изучение метаболизма соединений в модели in vitro не дает целостной картины всех путей биотрансформации веществ, происходящих в организме человека. Особенно важным аспектом в допинговом контроле является поиск долгоживущих метаболитов. В связи с этим, несмотря на все достоинства исследований in vitro, необходимо дополнительно исследовать метаболизм изучаемых соединений в условиях in vivo.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства спорта Российской Федерации в рамках Государственного контракта № 91 от 10 мая 2011 г. "Научное обоснование универсальной методики определения новых классов соединений с потенциальной допинговой активностью, применяемых в видах спорта на выносливость".
Продолжение следует...
ЛИТЕРАТУРА
1. World Anti-Doping Agency. The 2012 Prohibited List. International Standard. http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-Prohibited-list/2012/WADA_Prohibited_List_2012_EN.pdf (Accessed: June 12, 2012).
2 . Cockshott I. Bicalutamide: clinical pharmacokinetics and metabolism. - Clinical Pharmacokinetics, 2004, v.43, №13, p.855–878.
3. Boyle G. et al. Metabolism of Casodex in laboratory animals. – Xenabiotica, 1993, v 23, № 7, p.781–798.
4. Archakov A., Degtyarenko K. Structural classification of the P450 superfamily based on consensus sequence comparison. – Biochemistry and molecular biology international, 1993, v.31, №6, p.1071–1080.
5. Guengerich F. Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. – The AAPS Journal, 2006, v.8, №1, p.E101–E111.
6. CYP BD-SupersomesTM Guidelines for use. BD-Supersomes cDNA-Expressed Cytochrome P450 Enzymes. – URL: http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/adme_supersomes_cytochrome_p450_enzymes.pdf.
7. CYP BD-SupersomesTM Guidelines for use. BD-Supersomes, cDNA-Expressed UDP-glucuronosyl transferase enzymes. – URL: http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/adme_ supersomes_udp_enzymes.pdf.
8. Gao W., Wu Z., Miller D., Dalton J. Phase I metabolism study of selective androgen receptor modulators (SARMs) with human liver microsomes. – AAPS Journal, 2003, v.5, №4 (special issues): AAPS Pharm. Sci., Abstract 1751.
9. Perera M., Yin D., Chung K., Chan K., Miller D., Dalton T. Metabolism of S-4, a novel selective androgen receptor modulator. – AAPS Journal, 2003, v.5, №4 (special issues): AAPS Pharm. Sci., Abstract 2540.
Кроме того, в последние годы рынок наркотических средств многих стран существенно расширился за счет класса синтетических каннабиноидов. Это нафтоилиндолы JWH-018 и другие, AM-2201, AM-2233, тетраметилциклопропилиндолы – UR-144, XLR-11, адамантилкарсоксамиды – AB-001, APINACA. Они поступают в продажу под видом ароматических курительных смесей. До января 2010 года курительные смеси открыто продавались в РФ через Интернет и успели приобрести статус легальной альтернативы продуктам на основе марихуаны. Активность этих соединений на каннабиноидные рецепторы человека выше, чем у продуктов, выделенных из конопли. Запрет на оборот синтетических каннабиноидов в РФ последовал после ряда тяжелых отравлений в 2009 году, связанных с употреблением курительных смесей. В 2010 году ВАДА ввело каннабимиметики в Запрещенный список препаратов и методов.
Разработка эффективной скрининговой процедуры для допинг-контроля невозможна без изучения путей биотрансформации соединений, внесенных в Запрещенный список веществ и методов ВАДА, поскольку многие вещества, попав в организм человека, подвергаются изменению и выделяются в виде метаболитов. Данные по систематическому изучению метаболизма в организме человека новых допинговых препаратов и их выведения из организма ограничены, поскольку СМАРы проходят различные стадии клинических исследований. В настоящее время стали коммерчески доступными предполагаемые метаболиты некоторых наиболее часто встречающихся каннабимиметиков, однако рынок наркотических веществ постоянно пополняется новыми модифицированными аналогами известных синтетических каннабиноидов, информация о метаболизме которых в организме человека отсутствует.
В основе биотрансформации по большей части лежат ферментативные реакции преобразования молекул. Биологический смысл метаболизма – превращение химического вещества в форму, удобную для выведения из организма и, тем самым, сокращение времени его действия. Выделяют две фазы метаболизма препаратов. В ходе фазы I метаболизма (несинтетические реакции) к молекуле соединения присоединяется функциональная группа, например, –ОН, –NH2, –SH, либо эта группа становится доступной в результате химических превращений. Основные реакции фазы I – реакции окисления, из которых наиболее распространены реакции гидроксилирования. К менее частым реакциям фазы I относят процессы восстановления и гидролиза. В ходе фазы II (синтетические реакции) образуется ковалентная связь между функциональной группой препарата или его метаболита и эндогенными соединениями: глюкуроновой кислотой, сульфатом, ацетатом, глутатионом, аминокислотами. Глюкуронидация является основным путем биотрансформации препаратов у многих видов млекопитающих за исключением семейства кошачьих.
Традиционно процессы абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции, характеризующие фармакокинетический профиль вещества, изучаются в экспериментах in vivo на лабораторных животных. Основанием для данного подхода служит генетическое сходство млекопитающих и вытекающая отсюда схожая физиологическая реакция человеческого организма на введение соединения. Вместе с тем у животных разных видов и человека биотрансформации одних и тех же препаратов обладают своей спецификой, поскольку ферменты, участвующие в превращениях чужеродных веществ, часто видоспецифичны. Так, например, метаболический профиль бикалютамида – антиандрогена, используемого при лечении рака простаты [2], отличается у разных видов (рис.1) [3]. G.W.Boyle показал, что от 20 до 30% дозы бикалютамида, полученной мышами и крысами, выводилось после гидролиза в виде метаболитов 1 и 2, однако у собак и кроликов этих метаболитов практически не наблюдалось. Бикалютамид и его метаболиты склонны к образованию глюкуронидов. У мышей и крыс этот метаболит выводится с фекалиями, у людей и собак – с мочой. Таким образом, из-за межвидовых различий для изучения метаболизма необходимо использовать несколько видов животных, при этом для достижения статистической достоверности количество особей должно составлять значительное число.
В список ограничений использования лабораторных животных для изучения метаболизма допинговых соединений входят этические проблемы, но не менее важны экономические и временные затраты. Стоит отметить, что исследования в условиях in vitro позволяют практически полностью заменить экспериментальные исследования на животных и частично – клинические испытания. Клеточные культуры различных типов тканей человека и животных используют для изучения механизма действия, всасываемости, метаболизма лекарств и наличия побочных эффектов на клеточном уровне. Главное преимущество исследований in vitro – возможность проведения эксперимента непосредственно на тканях человека. В перспективе подобные исследования должны привести к созданию оптимальных моделей in vitro, наиболее адекватно отражающих ситуацию in vivo.
В организме человека лекарственные средства метаболизируются несколькими ферментными системами, основной из которых является суперсемейство цитохромов P450 [4]. Около 75% препаратов метаболизируется цитохромами P450, в основном 3A4, 2C9, 2C19, 2D6 и 1A2. Эти ферменты осуществляют ароматическое и алифатическое гидроксилирование, N-деалкилирование, C-окисление с образованием кетонов, альдегидов, карбоновых кислот, O-деалкилирование, разрыв сложноэфирной связи, дегалогенирование [5]. Под воздействием одного и того же цитохрома субстраты могут подвергаться одной или более реакциям, в то же время некоторые из реакций биотрансформации осуществляются более чем одним цитохромом и, напротив, некоторые реакции являются уникальными для конкретной изоформы. В связи с этим, для изучения фазы I метаболизма новых допинговых препаратов выбраны микросомы человека CYP3A4 с ДНК-экспрессированной редуктазой, микросомы CYP2В6 с ДНК-экспрессированной редуктазой, микросомы Р450 с оксиредуктазой из клеток насекомых и микросомы печени человека HLM 150, отвечающие за разные пути биотрансформации препарата в организме человека. Для изучения фазы II биотрансформации соединений использовали ДНК-экспрессированные УДФ-глюкуронозилтрансферазы человека, относящиеся к разным семействам, – УГТ1А9, УГТ1А8 и УГТ2В7, контрольные микросомы УГТ человека и микросомы печени человека HLM 150.
В качестве объектов исследования выбраны новые допинговые препараты, появившиеся на рынке спортивной фармакологии – СМАРы (остарин, андарин), а также синтетические каннабиноиды – фторированный аналог JWH-018 (AM-2201) и UR-144. Поскольку информация о метаболизме этих соединений в организме человека ограничена, целью данной работы было изучение путей биотрансформации веществ в условиях in vitro для идентификации метаболитов, а также сравнение полученных данных с полученными в эксперименте in vivo.
Образцы для исследования фазы I и II метаболизма допинговых препаратов в условиях in vitro готовили согласно стандартным процедурам, приведенными на сайте производителя [6, 7]. Дополнительно анализировали два холостых образца в каждой партии инкубационных реакций: одна проба содержала все компоненты реакционной смеси за исключением субстрата для проверки наличия потенциальных загрязняющих компонентов, имитирующих метаболиты, другая проба содержала все компоненты пробы фракции микросом печени человека для проверки возможности неферментативных реакций во время инкубации.
Пробоподготовку образцов мочи проводили согласно разработанным нашей лабораторией методикам определения нелетучих соединений, находящихся в моче в коньюгированном и/или неконьюгированном ("свободном") виде – прямой анализ мочи, анализ свободной и гидролизной фракций.
Пробоподготовка мочи для прямого анализа: в центрифужную микропробирку объемом 1,7 мл помещали 200 мкл образца мочи, добавляли 800 мкл раствора-разбавителя (раствор мефрузида 30 нг/мл в смеси вода/метанол/муравьиная кислота (97/2,9/0,1 об.%), центрифугировали при 14000 об./мин в течение 10 мин, супернатант переносили в виалу.
Пробоподготовка мочи для получения гидролизной фракции: к образцу мочи (3 мл) добавляли 1,0 мл фосфатного буферного раствора (0,8 М; рН 6,5), содержащего 30 мкл β-глюкуронидазы и 0,3 мкг метилтестостерона. После инкубации в течение часа при температуре 57°С образец подщелачивали 1 мл карбонатного буферного раствора (3 М, рН 10), проводили жидкостно-жидкостную экстракцию в течение 10 мин 5 мл диэтилового эфира в присутствии сульфата аммония, центрифугировали при 3000 об./мин в течение 4 мин и органический растворитель упаривали досуха при температуре 70°C. Сухой остаток перерастворяли в 50 мкл метанола, затем добавляли 50 мкл воды, полученный экстракт переносили в виалу. В случае анализа неконъюгированной фракции стадию инкубирования с β-глюкуронидазой опускали.
Анализ методом сверхпроизводительной высокоэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ) проводили на хроматографе модели Acquity UPLC (Waters, США) с системой автоматического ввода образцов (автосамплер), автоматическим податчиком образцов, термостатом колонки и дегазатором. Хроматограф подключали к тандемному масс-спектрометрометру TSQ Quantum Access Max (Thermo Scientific, США) с электрораспылительной ионизацией с нагреваемым потоком (ЭРИ). Сбор и обработка данных осуществлялись с применением программного обеспечения Xcalibur, версия 2.1.
Для разделения соединений использовали колонку Acquity UPLC BEH C18 2,1×100, размер частиц 1,7 мкм (Waters, Ирландия). Скорость потока подвижной фазы 350 мкл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в воде (А) и метаноле (В). Начальный состав подвижной фазы: 95% А и 5% В, изменяемый в течение 5 мин до 95% В. После 2,5 мин при 95% В осуществляли возврат состава подвижной фазы к исходным параметрам. Общее время анализа – 10 мин. Для понижения общего рабочего давления системы использовали термостатирование колонки при 60°С. Объем вводимой пробы составлял 5 мкл.
Для поиска метаболитов соединений, образующихся в результате реакций фазы I и II метаболизма в эксперименте in vitro, а также в условиях in vivo, использовали режимы регистрации полного ионного тока и сканирования ионов-предшественников. Детальный анализ масс-спектров, полученных в результате столкновительной диссоциации в камере соударений ионов-предшественников, позволил сделать предположение о возможных путях биотрансформации изучаемых соединений.
Анализ образцов до и после проведения реакции фазы I метаболизма остарина показал, что в условиях in vitro основные процессы биотрансформации СМАРа – гидроксилирование, дезфенилирование и декарбоксилирование. На рис.2 представлена масс-хроматограмма различных метаболитов остарина, полученная при инкубации вещества с микросомами 3А4. Предложенные на основе масс-спектров, полученных в условиях диссоциации, индуцированной соударениями, структуры метаболитов представлены на рис.3.
При изучении активности различных изоферментов в процессе биотрансформации остарина в условиях in vitro обнаружили, что микросомы CYP2В6 и Р450 в реакциях фазы I метаболизма СМАР активности не проявляют, в то время как под воздействием микросом печени человека HLM150 и изофермента CYP3А4 субстрат подвергается реакции гидроксилирования, дезфенилирования и последующего декарбоксилирования (рис.4). Данные виды изофермента цитохрома (HLM150, CYP3А4) обладают высокой активностью, но имеют низкую специфичность. Наибольшую концентрацию метаболитов остарина наблюдали при использовании изофермента CYP3А4.
В реакции фазы II метаболизма остарин, содержащий гидроксильную группу, взаимодействует с глюкуроновой кислотой с образованием О-глюкуронового эфира. Сравнительный анализ данных по активности различных изоферментов в реакции фазы II метаболизма СМАР в условиях in vitro показал, что микросомы УГТ1А8 и контрольные микросомы человека не участвуют в конъюгации субстрата. Образование глюкуронида остарина в присутствии ферментов УГТ2В7 и УГТ1А9 происходит лишь в незначительной степени. Наибольшую активность в реакции фазы II метаболизма данного СМАРа проявил изофермент HLM150 (рис.5).
Основные стадии биотрансформации остарина в организме человека – окисление/гидроксилирование, дезфенилирование и/или реакция конъюгации с глюкуроновой и серной кислотами. В отличие от эксперимента in vitro, в котором наблюдали только гидроксилирование кольца В (метаболит 1а), в условиях in vivo наряду с этим процессом протекает гидроксилирование по алифатическому углероду (метаболит 1б) (см. рис.3). В организме человека метаболита 1а образуется в 50 раз больше, чем метаболита 1б. Кроме этого, в моче после приема остарина обнаружен его дигидроксиметаболит (метаболит 5). Локализацию ОН-групп доказал детальный анализ масс-спектров, полученных в условиях диссоциации, индуцированной соударениями, при этом оказалось, что одна гидроксильная группа находится в кольце В, а вторая – в 20-м положении (см. рис.3). Как и в эксперименте in vitro, в организме человека после приема остарина образуются метаболиты 2 и 3, однако они не представляют диагностической ценности, так как являются минорными. Метаболит 4 – дезфенилированное и карбоксилированное производное остарина, обнаружен только в моче после приема СМАР.
Рассмотрим подробнее возможные структуры глюкуронидов гидроксиметаболитов, образующиеся в организме человека в результате протекания реакции фазы II (см. рис.3). Первая комбинация – глюкуроновая кислота присоединяется к гидроксигруппе кольца В; вторая – глюкуроновый остаток находится у хирального атома углерода (С-2), а гидроксильная группа кольца В остается интактной; третья – гидроксигруппа находится у 20-го атома углерода (С-20), остаток глюкуроновой кислоты присоединяется к гидроксигруппе, находящейся при С-2 (структура не приведена на рис.3). Все вышеперечисленные глюкурониды гидроксиметаболитов образуют депротонированную молекулу с m/z 580, однако из-за различного местоположения как гидроксигруппы, так и остатка глюкуроновой кислоты пути фрагментации будут разными. При прямом анализе мочи с пятикратным разбавлением после разового приема остарина идентифицировали только один глюкуронид метаболита 1а.
Для определения наиболее долгоживущих метаболитов в работе изучена фармакокинетика остарина и его основных метаболитов. Для построения кривых выведения СМАР и метаболитов проанализированы образцы мочи добровольца после разбавления и экстракты свободной и гидролизной фракций. Остарин выводится из организма человека в нативном виде, а также в виде метаболитов, максимальные концентрации которых наблюдаются через 18–24 ч после приема препарата, при этом только 10–15% препарата и образующихся метаболитов находятся в свободном виде, а 85–90% – в виде глюкуроноконъюгатов. Основной процесс выведения происходит в течение 5 суток. Период полувыведения препарата (Т1/2) – время для снижения максимальной концентрации наполовину составляет 48 ч. Основными метаболитами остарина являются гидроксиметаболит (метаболит 1а, рис.3) и дезфенилметаболит (метаболит 2, рис.3).
Наибольшую диагностическую ценность при прямом анализе мочи после пятикратного разбавления представляют глюкурониды остарина и его метаболита 1а, позволяющие идентифицировать прием препарата спустя 8 дней. Поскольку остарин и его метаболиты элиминируются в виде конъюгатов, анализ свободной фракции мочи методом СВЭЖХ–МС/МС позволяет определять СМАР в течение 6 суток после приема, в то время как анализ гидролизной фракции – более 10 суток.
Основными направлениями метаболизма другого СМАР, имеющего арилпропионамидную структуру, – андарина при проведении реакции фазы I метаболизма в условиях in vitro являются гидроксилирование (метаболит 1), деацетилирование (метаболит 2) и гидролиз по связи кислород–углерод (метаболит 3). Дальнейшее гидроксилирование кольца А или В метаболита 2 может приводить к образованию метаболита 4, однако эти возможные метаболиты андарина в in vitro эксперименте не обнаружены. В ходе проведения фазы II глюкуроновая кислота взаимодействует с гидроксильной группой андарина с образованием О-глюкуронового эфира. Возможные структуры идентифицированных метаболитов фазы I и II андарина представлены на рис.6.
Прямой анализ мочи до и после однократного приема андарина показал, что СМАР из организма выводится как в нативном виде, так и в виде свободных и конъюгированных метаболитов. На рис.7 показаны масс-хроматограммы образцов мочи (пятикратное разбавление и экстракт гидролизной фракции) после однократного приема андарина.
Биотрансформация андарина в организме человека согласуется с данными, полученными ранее в условиях in vitro. В процессе его биотрансформации образуются гидроксиметаболит (метаболит 1), дезацетилметаболит (метаболит 2), дезфенилметаболит (метаболит 3) (см. рис.6). Образование дезацетилгидроксиметаболита (метаболит 4) наблюдали только в условиях in vivo. Процесс гидроксилирования исходного соединения и дезацетилметаболита проходит по кольцу В, а кольцо А остается интактным. В отличие от собак и крыс, у которых основным направлением биотрансформации андарина является процесс восстановления нитрогруппы кольца А [8–9], в организме человека образования данного метаболита не происходит. В моче после приема андарина также идентифицировали дигидроксилированный метаболит (метаболит 5). СМАР и все его метаболиты выводятся в мочу главным образом в виде конъюгатов с глюкуроновой кислотой, только дезацетилгидроксиметаболит (метаболит 4) образует не только глюкуронид, но и конъюгат с серной кислотой.
Для определения наиболее долгоживущих метаболитов изучена фармакокинетика андарина и его основных метаболитов. СМАР из организма человека выводится в неизменном виде и в виде метаболитов, которые практически полностью конъюгированы с глюкуроновой и серной кислотами, что делает необходимым проведение предварительного гидролиза. Около 10% от всего количества андарина присутствует в свободной фракции. Наиболее долгоживущим метаболитом является сульфоконъюгат дезацетилгидроксиметаболита, который не разрушается при проведении ферментативного гидролиза с E. Coli. Для определения андарина предпочтителен прямой анализ мочи или анализ гидролизной фракции, при этом прямым анализом с применением метода СВЭЖХ–МС/МС возможно определять СМАР и его метаболиты в течение 7 суток, а анализ гидролизной фракции позволяет детектировать андарин в течение 9 дней. Основной процесс выведения происходит в течение 24 ч. Период полувыведения препарата (Т1/2) составляет 12,5 ч. Основными метаболитами андарина являются метаболит 3 и метаболит 4.
Изучение метаболизма соединений в модели in vitro не дает целостной картины всех путей биотрансформации веществ, происходящих в организме человека. Особенно важным аспектом в допинговом контроле является поиск долгоживущих метаболитов. В связи с этим, несмотря на все достоинства исследований in vitro, необходимо дополнительно исследовать метаболизм изучаемых соединений в условиях in vivo.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства спорта Российской Федерации в рамках Государственного контракта № 91 от 10 мая 2011 г. "Научное обоснование универсальной методики определения новых классов соединений с потенциальной допинговой активностью, применяемых в видах спорта на выносливость".
Продолжение следует...
ЛИТЕРАТУРА
1. World Anti-Doping Agency. The 2012 Prohibited List. International Standard. http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-Prohibited-list/2012/WADA_Prohibited_List_2012_EN.pdf (Accessed: June 12, 2012).
2 . Cockshott I. Bicalutamide: clinical pharmacokinetics and metabolism. - Clinical Pharmacokinetics, 2004, v.43, №13, p.855–878.
3. Boyle G. et al. Metabolism of Casodex in laboratory animals. – Xenabiotica, 1993, v 23, № 7, p.781–798.
4. Archakov A., Degtyarenko K. Structural classification of the P450 superfamily based on consensus sequence comparison. – Biochemistry and molecular biology international, 1993, v.31, №6, p.1071–1080.
5. Guengerich F. Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. – The AAPS Journal, 2006, v.8, №1, p.E101–E111.
6. CYP BD-SupersomesTM Guidelines for use. BD-Supersomes cDNA-Expressed Cytochrome P450 Enzymes. – URL: http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/adme_supersomes_cytochrome_p450_enzymes.pdf.
7. CYP BD-SupersomesTM Guidelines for use. BD-Supersomes, cDNA-Expressed UDP-glucuronosyl transferase enzymes. – URL: http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/adme_ supersomes_udp_enzymes.pdf.
8. Gao W., Wu Z., Miller D., Dalton J. Phase I metabolism study of selective androgen receptor modulators (SARMs) with human liver microsomes. – AAPS Journal, 2003, v.5, №4 (special issues): AAPS Pharm. Sci., Abstract 1751.
9. Perera M., Yin D., Chung K., Chan K., Miller D., Dalton T. Metabolism of S-4, a novel selective androgen receptor modulator. – AAPS Journal, 2003, v.5, №4 (special issues): AAPS Pharm. Sci., Abstract 2540.
Отзывы читателей
