eng
Выпуск #6/2012
И.Прасолов, М.Дикунец, И.Суханова, Т.Соболевский,Г.Родченков
Изучение метаболизма новых допинговых препаратов методом in vitro для их последующего определения в биожидкости человека. Часть 2. Синтетические каннабиноиды
Изучение метаболизма новых допинговых препаратов методом in vitro для их последующего определения в биожидкости человека. Часть 2. Синтетические каннабиноиды
Просмотры: 4600
Вниманию читателей предлагается методика определения in vitro и in vivo метаболитов соединений класса синтетических каннабиноидов.
Теги: biotransformation doping control synthetic cannabinoids допинг-контроль интетические каннабиноиды метаболизм
Сегодня на рынке многих стран широко известны так называемые ароматические курительные смеси (Spice, Jah Rush и др.), содержащие синтетические каннабиноиды. Их химическая структура отличается от Δ9-тетрагидроканнабинола, основного психоактивного компонента конопли. Курительные смеси успели приобрести статус легальной альтернативы продуктам на основе марихуаны и открыто продавались в Российской Федерации до официального запрета на оборот ряда каннабимиметиков в январе 2010 года [1]. Список запрещенных к обороту на территории РФ веществ ежегодно обновляется, поэтому происходят изменения и в составе поступающих в продажу каннабиноидсодержащих продуктов. Курительные смеси "первого поколения" содержали преимущественно каннабимиметики класса нафтоилиндола – JWH-018 и его аналоги. После их внесения в указанный список на смену пришли каннабиноиды класса тетраметилциклопропилиндола и адамантилкарбоксамида (рис.1). Стоит отметить, что даже несмотря на запрет оборота некоторых агонистов каннабиноидных рецепторов, эти соединения по-прежнему встречаются в составе курительных смесей.
Всемирное антидопинговое агентство (ВАДА) внесло синтетические каннабиноиды в запрещенный список с 2010 года. При ингаляционном способе употребления соединения этого класса оказывают психоактивный эффект и могут использоваться для устранения психологического напряжения. Перед антидопинговыми лабораториями стоит задача выявления случаев употребления спортсменами соединений этого класса. Большинство допинговых препаратов при попадании в человеческий организм подвергаются биотрансформации и выводятся с мочой в виде метаболитов, поэтому разработка эффективной скрининговой процедуры в допинг-контроле подразумевает предварительное исследование путей биотрансформации целевых соединений.
Установлено, что биотрансформация чужеродных организму соединений протекает в две фазы. В ходе фазы I к молекуле соединения присоединяется функциональная группа (–ОН, –NH2, –SH и др.), либо эта группа становится доступной в результате химических превращений. Основные процессы этой стадии метаболизма – реакции окисления и гидроксилирования. В ходе фазы II образуется ковалентная связь между функциональной группой препарата или его метаболита и эндогенными веществами – глюкуроновой, серной, уксусной кислотами, глутатионом. Формирование конъюгатов с глюкуроновой кислотой – это преобладающий путь биотрансформации экзогенных соединений у большинства видов млекопитающих.
В подавляющем большинстве случаев изучение метаболизма препаратов в рамках клинических исследований проводят в экспериментах in vivo на лабораторных животных из-за генетического сходства млекопитающих. Это сходство предполагает идентичный с человеческим организмом физиологический отклик на введение чужеродного соединения. Вместе с тем, у животных разных видов и человека биотрансформация одних и тех же препаратов имеет свои особенности, поскольку ферменты, участвующие в превращениях экзогенных веществ, зачастую видоспецифичны.
Кроме того, клинические испытания на животных имеют ряд недостатков: они требуют внушительных финансовых и временных затрат и, откровенно говоря, неэтичны по сути. На этом фоне эксперименты в условиях in vitro составляют серьезную конкуренцию клиническим испытаниям на животных. Клеточные культуры различных типов тканей человека и животных используют для изучения механизма действия, всасываемости, метаболизма лекарств и наличия побочных эффектов на клеточном уровне. Главное преимущество исследований in vitro – возможность проведения эксперимента непосредственно на тканях человека. В перспективе подобные исследования должны привести к созданию оптимальных моделей in vitro, наиболее адекватно отражающих ситуацию in vivo.
В качестве примера возможных путей биотрансформации синтетических каннабиноидов в человеческом организме на рис.2 представлена предполагаемая структура 22 in vivo-метаболитов JWH-250 [2]. Продукты биотрансформации каннабимиметика можно разбить на шесть групп в соответствии с типом ферментативных реакций, приводящих к их образованию: моногидроксилирование (М1-М5), дигидроксилирование (М6-М11), тригидроксилирование и дегидратация (М12,М13), тригидроксилирование (М14-М18), N-деалкилирование (М19) и N-деалкилирование с последующим моногидроксилированием (М20-М22). Ни в сыворотке крови, ни в моче O-деметилированных производных не обнаружено. Важно отметить, что метаболизм JWH-250 в организмах человека и крысы имеет ряд отличий: моногидроксиметаболиты в большей концентрации синтезируются в человеческом организме, тогда как для крыс в большей степени характерно образование N-деалкилгидроксипроизводных.
В человеческом организме основная масса лекарственных препаратов метаболизирует преимущественно в печени под действием суперсемейства цитохромов P450 (изоформы 3A4, 2C9, 2C19, 2D6 и 1A2) [3]. Перечисленные ферментативные системы отвечают за ароматическое и алифатическое гидроксилирование, N-деалкилирование, окисление по атому углерода с образованием кетонов, альдегидов, карбоновых кислот, O-деалкилирование, дегалогенирование и разрыв сложноэфирной связи [4]. Под воздействием одного и того же цитохрома субстраты могут подвергаться одной или более реакциям; в то же время некоторые из реакций биотрансформации осуществляются более чем одним цитохромом либо, напротив, являются уникальными для конкретной изоформы. По этой причине фазу I биотрансформации синтетических агонистов каннабиноидных рецепторов в условиях in vitro осуществляли с применением микросом CYP3A4 и CYP2В6 с ДНК экспрессированной редуктазой, микросом Р450 с оксиредуктазой из клеток насекомых и микросом печени человека HLM-150.
В качестве объектов исследования выбраны запрещенные ВАДА синтетические каннабиноиды – AM-2201 (фторированный аналог JWH-018) и UR-144. Поскольку сведения о метаболизме указанных соединений в организме человека ограничены, цель данной работы – изучение путей биотрансформации веществ в условиях in vitro для идентификации метаболитов, а также сравнение полученных данных с результатами эксперимента in vivo.
Образцы для исследования метаболизма фазы I синтетических каннабиноидов в условиях in vitro готовили согласно стандартным процедурам, описанным на сайте производителя [5, 6]. В каждой серии реакций инкубирования дополнительно анализировали два холостых образца. Первый содержал все компоненты реакционной смеси за исключением субстрата для обнаружения примесей, интерферирующих с метаболитами целевых соединений, второй – все компоненты пробы фракции микросом печени человека для обнаружения реакционной активности неферментативного характера в процессе инкубации.
Пробоподготовку образцов мочи проводили согласно разработанным нашей лабораторией методикам определения нелетучих соединений, находящихся в моче в конъюгированном и/или неконъюгированном ("свободном") виде. К образцу мочи (3 мл) добавляли 1,0 мл фосфатного буферного раствора (0,8 М, рН 6,5), содержащего 30 мкл β-глюкуронидазы и 0,3 мкг метилтестостерона. После инкубации в течение 1 ч при температуре 57°С образец подщелачивали 1 мл карбонатного буферного раствора (3 М, рН 10), проводили жидкостно-жидкостную экстракцию 5 мл диэтилового эфира в течение 10 мин в присутствии сульфата аммония, центрифугировали при 3000 об./мин в течение 4 мин, после чего органический растворитель отделяли и упаривали досуха при температуре 70°C. Сухой остаток перерастворяли в 100 мкл смеси метанол/вода (1:1), полученный экстракт переносили в виалу. В случае анализа неконъюгированной фракции стадию инкубирования с β-глюкуронидазой опускали.
Анализ методом сверхпроизводительной высокоэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ) проводили на хроматографе модели Acquity UPLC (Waters, Милфорд, США) с системой автоматического ввода образцов (автосамплер), автоматическим податчиком образцов, термостатом колонки и дегазатором. Хроматограф подключали к тандемному масс-спектрометру TSQ Quantum Access Max (Thermo Scientific, США) с электрораспылительной ионизацией с нагреваемым потоком (ЭРИ). Сбор и обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Xcalibur, версия 2.1.
Для разделения соединений использовали колонку Acquity UPLC BEH C18 2,1×100, размер частиц 1,7 мкм (Waters, Ирландия). Скорость потока подвижной фазы 350 мкл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в воде (А) и метаноле (В). Начальный состав подвижной фазы: 95% А и 5% В, изменяемый в течение 5 мин до 95% В. После 2,5 мин при 95% В осуществляли возврат состава подвижной фазы к исходным параметрам. Общее время анализа – 10 мин. Для понижения общего рабочего давления системы колонку термостатировали при 60°С. Объем вводимой пробы составлял 5 мкл.
Для поиска продуктов биотрансформации синтетических каннабиноидов, образующихся в результате метаболических процессов в условиях in vitro и in vivo, использовали режимы регистрации полного ионного тока и сканирования ионов-предшественников. Детальный анализ масс-спектров, полученных в результате столкновительной диссоциации в камере соударений исходных ионов, позволил сделать предположение об основных путях биотрансформации изучаемых соединений.
Поскольку UR-144 и AM-2201 – компоненты двух различных курительных смесей, содержащих и другие каннабимиметики, возникла необходимость предварительной очистки и выделения интересующих нас соединений из растительного субстрата методом полупрепаративной ВЭЖХ. Непосредственно перед дальнейшими in vitro исследованиями состав полученных фракций подтвержден методом СВЭЖХ/МС [7].
После инкубирования синтетического каннабиноида UR-144 c микросомами печени человека и изоферментами 3A4 и 2B6 в реакционной смеси идентифицированы следующие продукты биотрансформации: N-дезпентил- (m/z 242), гидрокси- (m/z 328), дигидрокси- (m/z 344) и N-дезпентилгидроксипроизводное (m/z 258) (рис.3). Зная пути метаболизма каннабимиметиков схожей структуры, мы ожидали обнаружить также и метаболит с карбоксильной группой у концевого атома углерода N-пентилрадикала (m/z 342), однако соответствующий пик на масс-хроматограмме отсутствовал. Стоит отметить, что на фоне концентрационных профилей синтезированных в условиях in vitro метаболитов заметно выделяется группа моногидроксипродуктов. На рис.4 представлены масс-хроматограммы гидроксипроизводных каннабиноида UR-144. Исходя из экспериментальных данных, мы предположили, что моногидроксиметаболиты, имеющие близкие времена удерживания, наиболее перспективны для их использования в качестве маркеров употребления UR-144 при анализе реальных образцов мочи.
После инкубирования в аналогичных условиях синтетического каннабимиметика AM-2201 получены гидрокси- (m/z 376), дигидрокси- (m/z 392), дигидродиол- (m/z 394) и N-дезпентил- (m/z 272) производные (рис.5). Кроме того, в случае альтернативного пути метаболизма потеря молекулой AM-2201 атома фтора приводит к образованию неспецифических продуктов, аналогичных детектируемым при употреблении каннабиноида JWH-018: N-(5-гидроксипентил)-JWH-018 (m/z 358) и N-пентановая кислота (m/z 372) [8].
Синтезированы in vitro метаболиты UR-144 и AM-2201, получены их масс-спектры и выбраны характеристичные ионы для селективного определения этих соединений методом СВЭЖХ/МС/МС в наиболее чувствительном режиме регистрации выбранных реакций.
Для каннабиноида UR-144 в дальнейшем найдено, что набор метаболитов, синтезируемых в условиях in vitro и in vivo, в большинстве случаев совпадает. Однако при анализе реальных образцов мочи не обнаружены N-дезпентилгидрокси- (m/z 242) и дегидромоногидроксипроизводное (m/z 326). Исходное соединение в биожидкости не детектируется, и все продукты биотрансформации выводятся преимущественно в форме глюкуронидов (и ~10% – в неконъюгированном виде). После проведения экспериментов in vitro, как и следовало ожидать, для идентификации в рамках скринингового анализа больше подходит группа моногидроксиметаболитов. На рис.6 приведены масс-хроматограммы образцов мочи, содержащего (Б) и не содержащего (А) синтетический каннабимиметик, а также масс-спектры наиболее информативных гидроксиметаболитов (В).
Для каннабимиметика AM-2201 данные исследований in vitro и in vivo также хорошо согласуются. В положительных на содержание AM-2201 пробах идентифицирован ряд моногидроксиметаболитов, восстановленные дигидроксипроизводные ("дигидродиолы"), а также дигидроксипродукты, но в заметно меньшей, чем в условиях in vitro концентрации. На рис. 7 приведены масс-хроматограммы в режиме регистрации выбранных реакций для дигидродиол- и моногидроксиметаболитов, полученные при анализе отрицательной (А) и положительной (Б) на содержание AM-2201 проб. Из-за высокой скорости выведения дигидродиолпроизводных AM-2201 в качестве "маркеров" его употребления в моче целесообразно использовать группу моногидроксипродуктов.
Экспериментально установлено, что данные исследований in vitro хорошо согласуются с результатами, полученными в условиях in vivo. При выведении из организма UR-144 и AM-2201 активно метаболизируют. Основной путь биотрансформации этих соединений – моно- и полигидроксилирование с последующим формированием конъюгатов с глюкуроновой кислотой. Наиболее подходящими для установления факта приема UR-144 и AM-2201 оказались моногидроксиметаболиты. Установить факт употребления курительной смеси, содержащей UR-144, можно в интервале от одной до трех недель с момента приема, а в случае AM-2201 – в течение двух недель.
На основании полученных данных показана возможность применения микросом печени человека и изоферментов 3A4 и 2B6 для моделирования метаболических процессов, протекающих в организме человека. Полученные метаболиты необходимы для разработки методик определения новых лекарственных, наркотических или допинговых препаратов. Однако пути биотрансформации соединений в условиях in vitro не во всех случаях коррелируют с процессами метаболизма, протекающими in vivo. Тем не менее, поиск долгоживущих метаболитов в допинговом контроле возможен только при анализе реальных образцов биожидкостей. По этим причинам, несмотря на все достоинства исследований in vitro, необходимо дополнительно исследовать метаболизм целевых соединений в условиях in vivo.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства спорта Российской Федерации в рамках Государственного контракта №221 от 16 ноября 2012 г. "Разработка новой методологии обнаружения допинговых препаратов на основе выявления и целевого детектирования новых долгоживущих метаболитов".
ЛИТЕРАТУРА
1. Постановление Правительства Российской Федерации от 31 декабря 2009 г. №1186 "О внесении изменений в некоторые постановления Правительства Российской Федерации по вопросам, связанным с оборотом наркотических средств", 2010. URL: http://www.rg.ru/2010/01/14/narko-dok.html (дата обращения: 26.10.2012)
2. Grigoryev A., Melnik A., Savchuk S., Simonov A., Rozhanets V. Gas and liquid chromatography–mass spectrometry studies on the metabolism of the synthetic phenylacetylindole cannabimimetic JWH-250, the psychoactive component of smoking mixtures. – Journal of Chromatography B, 2011, v.879, p.2519–2526.
3. Archakov A., Degtyarenko K. Structural classification of the P450 superfamily based on consensus sequence comparison. – Biochemistry and Molecular Biology International (JournalSeek), 1993, v.31, №6, p.1071–1080.
4. Guengerich F. Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. – The AAPS Journal, 2006, v.8, №1, p.E101–E111.
5. CYP BD-SupersomesTM Guidelines for use. BD-Supersomes, cDNA-Expressed Cytochrome P450 Enzymes. — URL: http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/adme_supersomes_ cytochrome_p450_enzymes.pdf
6. CYP BD-SupersomesTM Guidelines for use. BD-Supersomes, cDNA-Expressed UDP-glucuronosyl transferase enzymes. — URL: http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/adme_ supersomes_udp_enzymes.pdf
7. Sobolevsky T., Prasolov I., Rodchenkov G. Detection of urinary metabolites of AM-2201 and UR-144, two novel synthetic cannabinoids. – Drug Test Anal 2012 doi: 10.1002/dta.1418 (Article in Press).
8. Sobolevsky T., Prasolov I., Rodchenkov G. Detection of JWH-018 metabolites in smoking mixture post-administration urine. – Forensic Science International, 2010, v.200, №1, p.141–147.
Всемирное антидопинговое агентство (ВАДА) внесло синтетические каннабиноиды в запрещенный список с 2010 года. При ингаляционном способе употребления соединения этого класса оказывают психоактивный эффект и могут использоваться для устранения психологического напряжения. Перед антидопинговыми лабораториями стоит задача выявления случаев употребления спортсменами соединений этого класса. Большинство допинговых препаратов при попадании в человеческий организм подвергаются биотрансформации и выводятся с мочой в виде метаболитов, поэтому разработка эффективной скрининговой процедуры в допинг-контроле подразумевает предварительное исследование путей биотрансформации целевых соединений.
Установлено, что биотрансформация чужеродных организму соединений протекает в две фазы. В ходе фазы I к молекуле соединения присоединяется функциональная группа (–ОН, –NH2, –SH и др.), либо эта группа становится доступной в результате химических превращений. Основные процессы этой стадии метаболизма – реакции окисления и гидроксилирования. В ходе фазы II образуется ковалентная связь между функциональной группой препарата или его метаболита и эндогенными веществами – глюкуроновой, серной, уксусной кислотами, глутатионом. Формирование конъюгатов с глюкуроновой кислотой – это преобладающий путь биотрансформации экзогенных соединений у большинства видов млекопитающих.
В подавляющем большинстве случаев изучение метаболизма препаратов в рамках клинических исследований проводят в экспериментах in vivo на лабораторных животных из-за генетического сходства млекопитающих. Это сходство предполагает идентичный с человеческим организмом физиологический отклик на введение чужеродного соединения. Вместе с тем, у животных разных видов и человека биотрансформация одних и тех же препаратов имеет свои особенности, поскольку ферменты, участвующие в превращениях экзогенных веществ, зачастую видоспецифичны.
Кроме того, клинические испытания на животных имеют ряд недостатков: они требуют внушительных финансовых и временных затрат и, откровенно говоря, неэтичны по сути. На этом фоне эксперименты в условиях in vitro составляют серьезную конкуренцию клиническим испытаниям на животных. Клеточные культуры различных типов тканей человека и животных используют для изучения механизма действия, всасываемости, метаболизма лекарств и наличия побочных эффектов на клеточном уровне. Главное преимущество исследований in vitro – возможность проведения эксперимента непосредственно на тканях человека. В перспективе подобные исследования должны привести к созданию оптимальных моделей in vitro, наиболее адекватно отражающих ситуацию in vivo.
В качестве примера возможных путей биотрансформации синтетических каннабиноидов в человеческом организме на рис.2 представлена предполагаемая структура 22 in vivo-метаболитов JWH-250 [2]. Продукты биотрансформации каннабимиметика можно разбить на шесть групп в соответствии с типом ферментативных реакций, приводящих к их образованию: моногидроксилирование (М1-М5), дигидроксилирование (М6-М11), тригидроксилирование и дегидратация (М12,М13), тригидроксилирование (М14-М18), N-деалкилирование (М19) и N-деалкилирование с последующим моногидроксилированием (М20-М22). Ни в сыворотке крови, ни в моче O-деметилированных производных не обнаружено. Важно отметить, что метаболизм JWH-250 в организмах человека и крысы имеет ряд отличий: моногидроксиметаболиты в большей концентрации синтезируются в человеческом организме, тогда как для крыс в большей степени характерно образование N-деалкилгидроксипроизводных.
В человеческом организме основная масса лекарственных препаратов метаболизирует преимущественно в печени под действием суперсемейства цитохромов P450 (изоформы 3A4, 2C9, 2C19, 2D6 и 1A2) [3]. Перечисленные ферментативные системы отвечают за ароматическое и алифатическое гидроксилирование, N-деалкилирование, окисление по атому углерода с образованием кетонов, альдегидов, карбоновых кислот, O-деалкилирование, дегалогенирование и разрыв сложноэфирной связи [4]. Под воздействием одного и того же цитохрома субстраты могут подвергаться одной или более реакциям; в то же время некоторые из реакций биотрансформации осуществляются более чем одним цитохромом либо, напротив, являются уникальными для конкретной изоформы. По этой причине фазу I биотрансформации синтетических агонистов каннабиноидных рецепторов в условиях in vitro осуществляли с применением микросом CYP3A4 и CYP2В6 с ДНК экспрессированной редуктазой, микросом Р450 с оксиредуктазой из клеток насекомых и микросом печени человека HLM-150.
В качестве объектов исследования выбраны запрещенные ВАДА синтетические каннабиноиды – AM-2201 (фторированный аналог JWH-018) и UR-144. Поскольку сведения о метаболизме указанных соединений в организме человека ограничены, цель данной работы – изучение путей биотрансформации веществ в условиях in vitro для идентификации метаболитов, а также сравнение полученных данных с результатами эксперимента in vivo.
Образцы для исследования метаболизма фазы I синтетических каннабиноидов в условиях in vitro готовили согласно стандартным процедурам, описанным на сайте производителя [5, 6]. В каждой серии реакций инкубирования дополнительно анализировали два холостых образца. Первый содержал все компоненты реакционной смеси за исключением субстрата для обнаружения примесей, интерферирующих с метаболитами целевых соединений, второй – все компоненты пробы фракции микросом печени человека для обнаружения реакционной активности неферментативного характера в процессе инкубации.
Пробоподготовку образцов мочи проводили согласно разработанным нашей лабораторией методикам определения нелетучих соединений, находящихся в моче в конъюгированном и/или неконъюгированном ("свободном") виде. К образцу мочи (3 мл) добавляли 1,0 мл фосфатного буферного раствора (0,8 М, рН 6,5), содержащего 30 мкл β-глюкуронидазы и 0,3 мкг метилтестостерона. После инкубации в течение 1 ч при температуре 57°С образец подщелачивали 1 мл карбонатного буферного раствора (3 М, рН 10), проводили жидкостно-жидкостную экстракцию 5 мл диэтилового эфира в течение 10 мин в присутствии сульфата аммония, центрифугировали при 3000 об./мин в течение 4 мин, после чего органический растворитель отделяли и упаривали досуха при температуре 70°C. Сухой остаток перерастворяли в 100 мкл смеси метанол/вода (1:1), полученный экстракт переносили в виалу. В случае анализа неконъюгированной фракции стадию инкубирования с β-глюкуронидазой опускали.
Анализ методом сверхпроизводительной высокоэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ) проводили на хроматографе модели Acquity UPLC (Waters, Милфорд, США) с системой автоматического ввода образцов (автосамплер), автоматическим податчиком образцов, термостатом колонки и дегазатором. Хроматограф подключали к тандемному масс-спектрометру TSQ Quantum Access Max (Thermo Scientific, США) с электрораспылительной ионизацией с нагреваемым потоком (ЭРИ). Сбор и обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Xcalibur, версия 2.1.
Для разделения соединений использовали колонку Acquity UPLC BEH C18 2,1×100, размер частиц 1,7 мкм (Waters, Ирландия). Скорость потока подвижной фазы 350 мкл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в воде (А) и метаноле (В). Начальный состав подвижной фазы: 95% А и 5% В, изменяемый в течение 5 мин до 95% В. После 2,5 мин при 95% В осуществляли возврат состава подвижной фазы к исходным параметрам. Общее время анализа – 10 мин. Для понижения общего рабочего давления системы колонку термостатировали при 60°С. Объем вводимой пробы составлял 5 мкл.
Для поиска продуктов биотрансформации синтетических каннабиноидов, образующихся в результате метаболических процессов в условиях in vitro и in vivo, использовали режимы регистрации полного ионного тока и сканирования ионов-предшественников. Детальный анализ масс-спектров, полученных в результате столкновительной диссоциации в камере соударений исходных ионов, позволил сделать предположение об основных путях биотрансформации изучаемых соединений.
Поскольку UR-144 и AM-2201 – компоненты двух различных курительных смесей, содержащих и другие каннабимиметики, возникла необходимость предварительной очистки и выделения интересующих нас соединений из растительного субстрата методом полупрепаративной ВЭЖХ. Непосредственно перед дальнейшими in vitro исследованиями состав полученных фракций подтвержден методом СВЭЖХ/МС [7].
После инкубирования синтетического каннабиноида UR-144 c микросомами печени человека и изоферментами 3A4 и 2B6 в реакционной смеси идентифицированы следующие продукты биотрансформации: N-дезпентил- (m/z 242), гидрокси- (m/z 328), дигидрокси- (m/z 344) и N-дезпентилгидроксипроизводное (m/z 258) (рис.3). Зная пути метаболизма каннабимиметиков схожей структуры, мы ожидали обнаружить также и метаболит с карбоксильной группой у концевого атома углерода N-пентилрадикала (m/z 342), однако соответствующий пик на масс-хроматограмме отсутствовал. Стоит отметить, что на фоне концентрационных профилей синтезированных в условиях in vitro метаболитов заметно выделяется группа моногидроксипродуктов. На рис.4 представлены масс-хроматограммы гидроксипроизводных каннабиноида UR-144. Исходя из экспериментальных данных, мы предположили, что моногидроксиметаболиты, имеющие близкие времена удерживания, наиболее перспективны для их использования в качестве маркеров употребления UR-144 при анализе реальных образцов мочи.
После инкубирования в аналогичных условиях синтетического каннабимиметика AM-2201 получены гидрокси- (m/z 376), дигидрокси- (m/z 392), дигидродиол- (m/z 394) и N-дезпентил- (m/z 272) производные (рис.5). Кроме того, в случае альтернативного пути метаболизма потеря молекулой AM-2201 атома фтора приводит к образованию неспецифических продуктов, аналогичных детектируемым при употреблении каннабиноида JWH-018: N-(5-гидроксипентил)-JWH-018 (m/z 358) и N-пентановая кислота (m/z 372) [8].
Синтезированы in vitro метаболиты UR-144 и AM-2201, получены их масс-спектры и выбраны характеристичные ионы для селективного определения этих соединений методом СВЭЖХ/МС/МС в наиболее чувствительном режиме регистрации выбранных реакций.
Для каннабиноида UR-144 в дальнейшем найдено, что набор метаболитов, синтезируемых в условиях in vitro и in vivo, в большинстве случаев совпадает. Однако при анализе реальных образцов мочи не обнаружены N-дезпентилгидрокси- (m/z 242) и дегидромоногидроксипроизводное (m/z 326). Исходное соединение в биожидкости не детектируется, и все продукты биотрансформации выводятся преимущественно в форме глюкуронидов (и ~10% – в неконъюгированном виде). После проведения экспериментов in vitro, как и следовало ожидать, для идентификации в рамках скринингового анализа больше подходит группа моногидроксиметаболитов. На рис.6 приведены масс-хроматограммы образцов мочи, содержащего (Б) и не содержащего (А) синтетический каннабимиметик, а также масс-спектры наиболее информативных гидроксиметаболитов (В).
Для каннабимиметика AM-2201 данные исследований in vitro и in vivo также хорошо согласуются. В положительных на содержание AM-2201 пробах идентифицирован ряд моногидроксиметаболитов, восстановленные дигидроксипроизводные ("дигидродиолы"), а также дигидроксипродукты, но в заметно меньшей, чем в условиях in vitro концентрации. На рис. 7 приведены масс-хроматограммы в режиме регистрации выбранных реакций для дигидродиол- и моногидроксиметаболитов, полученные при анализе отрицательной (А) и положительной (Б) на содержание AM-2201 проб. Из-за высокой скорости выведения дигидродиолпроизводных AM-2201 в качестве "маркеров" его употребления в моче целесообразно использовать группу моногидроксипродуктов.
Экспериментально установлено, что данные исследований in vitro хорошо согласуются с результатами, полученными в условиях in vivo. При выведении из организма UR-144 и AM-2201 активно метаболизируют. Основной путь биотрансформации этих соединений – моно- и полигидроксилирование с последующим формированием конъюгатов с глюкуроновой кислотой. Наиболее подходящими для установления факта приема UR-144 и AM-2201 оказались моногидроксиметаболиты. Установить факт употребления курительной смеси, содержащей UR-144, можно в интервале от одной до трех недель с момента приема, а в случае AM-2201 – в течение двух недель.
На основании полученных данных показана возможность применения микросом печени человека и изоферментов 3A4 и 2B6 для моделирования метаболических процессов, протекающих в организме человека. Полученные метаболиты необходимы для разработки методик определения новых лекарственных, наркотических или допинговых препаратов. Однако пути биотрансформации соединений в условиях in vitro не во всех случаях коррелируют с процессами метаболизма, протекающими in vivo. Тем не менее, поиск долгоживущих метаболитов в допинговом контроле возможен только при анализе реальных образцов биожидкостей. По этим причинам, несмотря на все достоинства исследований in vitro, необходимо дополнительно исследовать метаболизм целевых соединений в условиях in vivo.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства спорта Российской Федерации в рамках Государственного контракта №221 от 16 ноября 2012 г. "Разработка новой методологии обнаружения допинговых препаратов на основе выявления и целевого детектирования новых долгоживущих метаболитов".
ЛИТЕРАТУРА
1. Постановление Правительства Российской Федерации от 31 декабря 2009 г. №1186 "О внесении изменений в некоторые постановления Правительства Российской Федерации по вопросам, связанным с оборотом наркотических средств", 2010. URL: http://www.rg.ru/2010/01/14/narko-dok.html (дата обращения: 26.10.2012)
2. Grigoryev A., Melnik A., Savchuk S., Simonov A., Rozhanets V. Gas and liquid chromatography–mass spectrometry studies on the metabolism of the synthetic phenylacetylindole cannabimimetic JWH-250, the psychoactive component of smoking mixtures. – Journal of Chromatography B, 2011, v.879, p.2519–2526.
3. Archakov A., Degtyarenko K. Structural classification of the P450 superfamily based on consensus sequence comparison. – Biochemistry and Molecular Biology International (JournalSeek), 1993, v.31, №6, p.1071–1080.
4. Guengerich F. Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. – The AAPS Journal, 2006, v.8, №1, p.E101–E111.
5. CYP BD-SupersomesTM Guidelines for use. BD-Supersomes, cDNA-Expressed Cytochrome P450 Enzymes. — URL: http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/adme_supersomes_ cytochrome_p450_enzymes.pdf
6. CYP BD-SupersomesTM Guidelines for use. BD-Supersomes, cDNA-Expressed UDP-glucuronosyl transferase enzymes. — URL: http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/adme_ supersomes_udp_enzymes.pdf
7. Sobolevsky T., Prasolov I., Rodchenkov G. Detection of urinary metabolites of AM-2201 and UR-144, two novel synthetic cannabinoids. – Drug Test Anal 2012 doi: 10.1002/dta.1418 (Article in Press).
8. Sobolevsky T., Prasolov I., Rodchenkov G. Detection of JWH-018 metabolites in smoking mixture post-administration urine. – Forensic Science International, 2010, v.200, №1, p.141–147.
Отзывы читателей
