eng
Выпуск #6/2012
А. Аболин, П.-Ф.Икар
Современная препаративная флеш-хроматография. Часть 2
Современная препаративная флеш-хроматография. Часть 2
Просмотры: 4185
Авторы предлагают методику подбора условий для препаративного выделения продуктов из сложных смесей.
Теги: analytical column dry load. flash chromatography high performance liquid chromatography (hplc) preparative chromatography purification, flash cartridge retention factor semi-preparative column separation аналитическая колонка высокоэффективная жидкостная хроматография (вэжх) коэффициент удерживания очистка полупрепаративная колонка препаративная хроматография разделение сухой ввод флеш-картридж флеш-хроматография
В первой части статьи мы рассказали о том, как появился термин "флеш-хроматография" (ФХ) и представили линейку современных приборов для препаративной флеш-хроматографии производства французской компании Interchim. Современная ФХ – удобный, быстрый и относительно недорогой метод препаративного выделения (или очистки) продуктов из сложных смесей. Однако, несмотря на современную мощную инструментальную базу, вряд ли разумно сразу приступать к процессу препаративной хроматографии. Прежде всего надо подготовить условия для ее проведения: выбрать неподвижную фазу, определить состав и градиент элюента, подобрать скорость потока элюента и допустимое количество образца, которое может быть введено в препаративную колонку.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) – самый простой и удобный способ подбора оптимальных условий разделения для низкомолекулярных органических соединений. На рис.1 приведены три хроматограммы изомеров А и В, полученные при элюировании исходной смеси продуктов с разным соотношением полярного (этилацетат, EtAc) и неполярного (циклогептан, С7) растворителей.
Если для ТСХ одна из наиболее важных характеристик – коэффициент удерживания Rf, то для колоночной хроматографии – это показатель CV (Column Volume). Коэффициенты Rf и CV связаны простым соотношением: CV = 1/Rf, но интерес представляют не столько значения CV, сколько разница в величинах CV для соединений А и В, т.е. ΔCV. Эмпирическим путем установлено, что при ΔCV от 4 до 10 можно гарантированно разделить соединения А и В. Величина ΔCV от 1,5 до 4 обеспечивает стандартное, т.е. достаточно уверенное разделение компонентов А и В. Наконец, значения ΔCV от 1 до 1,5 – минимальные для разделения.
На рис.2 приведена полученная эмпирическим путем диаграмма соотношения между количеством смеси веществ (в логарифмическом масштабе), подлежащих хроматографическому разделению, размерами колонки (в граммах силикагеля) и величинами ΔCV. Желтым цветом выделены области для значений ΔCV от 1 до 1,5, где разделение затруднено, зеленым – области так называемого "стандартного" разделения (ΔCV от 1,5 до 4) и, наконец, синим цветом закрашены области легкого (гарантированного) разделения компонентов А и В. Теперь можно перейти от ТСХ (см. рис.1) к препаративному разделению соединений А и В. Предположим, что мы хотим запустить на колонку 200 мг исходной смеси, содержащей нужные для выделения изомеры А и В, имеющие значение ΔCV, равное единице. Красной стрелкой (см. рис.2) показано, что наименьший размер колонки для разделения такого количества исходной смеси с составом элюента, предварительно подобранным по ТСХ (см. рис.1), – 40 г 50-мкм силикагеля марки IR-50. При выборе колонки надо обратить внимание на одну особенность, присущую именно препаративной колоночной хроматографии, к которой относится и препаративная флеш-хроматография. Компания Interchim производит большой ассортимент 40-г картриджей с силикагелями разных марок, но рекомендуется использовать два последовательно соединенных 25-г картриджа. При этом увеличивается общая высота колонки в два раза (высота 25- и 40-г картриджей одинакова), а эффективность хроматографического разделения возрастает примерно в 1,4 раза. Очень важно, что мы получаем в двух колонках два верхних начальных слоя неподвижной фазы, которые в случае пластиковых картриджей для ФХ упакованы более равномерно и плотно, чем остальной объем.
На рис.3 приведена реальная хроматограмма разделения той же многокомпонентной смеси, что и на рис.1. Числа от 001 до 048 в верхней части рисунка соответствуют виалам, в которые автоматически собираются отдельные порции выходящего из колонки раствора. Из рисунка видно, что несмотря на низкое значение ΔCV (1,0) соединения А и В могут быть выделены в чистом виде (соединение А: сегменты 018–020; соединение В: сегменты 021–024). Причем при перемене знака первой производной к кривой хроматограммы раствор, поступающий в коллектор фракций, автоматически перенаправляется в новую виалу.
Подбор оптимальных условий методом ТСХ подходит не для всех соединений. Более типична проблема перехода от аналитической ВЭЖХ к препаративной хроматографии. На рис.5 приведена хроматограмма смеси продуктов, полученная на аналитическом ВЭЖХ-хроматографе.
Для того чтобы подобрать картридж для ФХ, максимально близкий по результатам разделения к аналитической колонке, надо провести ряд расчетов. При переходе от аналитической колонки к препаративной, чтобы рассчитать скорость потока элюента в препаративном режиме, а также оптимальный объем вводимой пробы, воспользуемся формулами, обычно применяемыми в высокоэффективной хроматографии. Как показывает практика, эти соотношения дают отличные результаты и для ФХ:
ECV = π × D2 ×L/4;
UФЛЕШ = πr2ФЛЕШ / πr2ВЭЖХ × UВЭЖХ;
МФЛЕШ = ECVФЛЕШ / ECVВЭЖХ × МВЭЖХ,
где ECV – эффективный объем колонки; L – длина; D – диаметр; М – объем вводимой пробы; U – скорость потока; rФЛЕШ – радиус флеш-картриджа; rВЭЖХ – радиус ВЭЖХ-колонки.
Объединим исходные и расчетные величины (см. таблицу). Результаты расчетов применили на препаративном хроматографе pF-450 (рис.6). Из рисунка видно, что правильный перенос аналитических условий на препаративную флеш-хроматографию дает результат, не уступающий по качеству, полученному в аналитическом режиме.
UPFP-хроматографы (pF-430, pF-450, pF-4100) и флеш-кроссоверы серии pF-4250 способны работать не только с флеш-картриджами, но и с металлическими полупрепаративными колонками для ВЭЖХ. Приведенные выше формулы можно применять для расчета условий разделения на полупрепаративных колонках. В качестве примера выбрана аналитическая колонка Uptisphere Strategy C18-2, 10 мкм, 250×4,6 мм. На рис.7 показана зависимость давления от скорости подачи элюента.
Полученные на аналитической колонке результаты можно перенести на полупрепаративные ВЭЖХ-колонки с большим диаметром (от 20 мм и больше). После того, как выбрана модель хроматографа puriFlash, определяют оптимальное рабочее давление ниже максимально возможного. Например, у хроматографа pF-430 максимальное рабочее давление 30 бар. Выберем для эксперимента оптимальное давление в 20 бар. Из рис.7 видно, что это давление для колонки Uptisphere Strategy C18-2 достигается при скорости подачи элюента 0,75 мл/мин. Определим по известной формуле расчетные скорости потока элюента при установке на хроматограф pF-430 полупрепаративных ВЭЖХ-колонок диаметром 21,2; 28 и 50 мм, наполненных неподвижной фазой С18 с диаметром частиц 10 мкм:
диаметр 21,2 мм: оптимальная скорость [(21,2)3/(4,6)2]×0,75 = 16 мл/мин, давление 20 бар;
диаметр 28 мм: оптимальная скорость [(28)2/(4,6)2]×0,75 = 28 мл/мин, давление 20 бар;
диаметр 50 мм: оптимальная скорость [(50)2/(4,6)2]×0,75 = 89 мл/мин, давление 20 бар.
Кстати, легко подсчитать, что поставить препаративную колонку диаметром 80 мм (и больше) на модель pF-430 нельзя, так как при давлении в 20 бар оптимальная скорость потока элюента составит 226 мл/мин, а максимальная скорость подачи элюента у этой модели pF-430 равна 200 мл/мин. Для хроматографа pF-450 значение рабочего давления составит 35 бар (т.е. 70% от максимального значения 50 бар). Такое давление достигается в аналитической колонке Uptisphere Strategy C18-2, 10 мкм, 250×4,6 мм при скорости потока элюента 1,5 мл/мин. Несложно подсчитать, что при установке ВЭЖХ препаративных колонок на хроматограф pF-450 и рабочем давлении в 35 бар скорость потока элюента для колонки диаметром 21,2 мм равна 32 мл/мин, для колонки диаметром 28 мм – 56 мл/мин, для колонки диаметром 50 мм – 177 мл/мин.
Таким образом, пользуясь описанными выше приемами, можно переходить от тонкослойной и аналитической ВЭЖ-хроматографии к ФХ и применять флеш-хроматографы для работы с полупрепаративными ВЭЖХ-колонками.
В заключительной части статьи мы расскажем о том, какие неподвижные фазы предлагает компания Interchim для очистки (разделения) различных классов соединений.
Продолжение следует.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) – самый простой и удобный способ подбора оптимальных условий разделения для низкомолекулярных органических соединений. На рис.1 приведены три хроматограммы изомеров А и В, полученные при элюировании исходной смеси продуктов с разным соотношением полярного (этилацетат, EtAc) и неполярного (циклогептан, С7) растворителей.
Если для ТСХ одна из наиболее важных характеристик – коэффициент удерживания Rf, то для колоночной хроматографии – это показатель CV (Column Volume). Коэффициенты Rf и CV связаны простым соотношением: CV = 1/Rf, но интерес представляют не столько значения CV, сколько разница в величинах CV для соединений А и В, т.е. ΔCV. Эмпирическим путем установлено, что при ΔCV от 4 до 10 можно гарантированно разделить соединения А и В. Величина ΔCV от 1,5 до 4 обеспечивает стандартное, т.е. достаточно уверенное разделение компонентов А и В. Наконец, значения ΔCV от 1 до 1,5 – минимальные для разделения.
На рис.2 приведена полученная эмпирическим путем диаграмма соотношения между количеством смеси веществ (в логарифмическом масштабе), подлежащих хроматографическому разделению, размерами колонки (в граммах силикагеля) и величинами ΔCV. Желтым цветом выделены области для значений ΔCV от 1 до 1,5, где разделение затруднено, зеленым – области так называемого "стандартного" разделения (ΔCV от 1,5 до 4) и, наконец, синим цветом закрашены области легкого (гарантированного) разделения компонентов А и В. Теперь можно перейти от ТСХ (см. рис.1) к препаративному разделению соединений А и В. Предположим, что мы хотим запустить на колонку 200 мг исходной смеси, содержащей нужные для выделения изомеры А и В, имеющие значение ΔCV, равное единице. Красной стрелкой (см. рис.2) показано, что наименьший размер колонки для разделения такого количества исходной смеси с составом элюента, предварительно подобранным по ТСХ (см. рис.1), – 40 г 50-мкм силикагеля марки IR-50. При выборе колонки надо обратить внимание на одну особенность, присущую именно препаративной колоночной хроматографии, к которой относится и препаративная флеш-хроматография. Компания Interchim производит большой ассортимент 40-г картриджей с силикагелями разных марок, но рекомендуется использовать два последовательно соединенных 25-г картриджа. При этом увеличивается общая высота колонки в два раза (высота 25- и 40-г картриджей одинакова), а эффективность хроматографического разделения возрастает примерно в 1,4 раза. Очень важно, что мы получаем в двух колонках два верхних начальных слоя неподвижной фазы, которые в случае пластиковых картриджей для ФХ упакованы более равномерно и плотно, чем остальной объем.
На рис.3 приведена реальная хроматограмма разделения той же многокомпонентной смеси, что и на рис.1. Числа от 001 до 048 в верхней части рисунка соответствуют виалам, в которые автоматически собираются отдельные порции выходящего из колонки раствора. Из рисунка видно, что несмотря на низкое значение ΔCV (1,0) соединения А и В могут быть выделены в чистом виде (соединение А: сегменты 018–020; соединение В: сегменты 021–024). Причем при перемене знака первой производной к кривой хроматограммы раствор, поступающий в коллектор фракций, автоматически перенаправляется в новую виалу.
Подбор оптимальных условий методом ТСХ подходит не для всех соединений. Более типична проблема перехода от аналитической ВЭЖХ к препаративной хроматографии. На рис.5 приведена хроматограмма смеси продуктов, полученная на аналитическом ВЭЖХ-хроматографе.
Для того чтобы подобрать картридж для ФХ, максимально близкий по результатам разделения к аналитической колонке, надо провести ряд расчетов. При переходе от аналитической колонки к препаративной, чтобы рассчитать скорость потока элюента в препаративном режиме, а также оптимальный объем вводимой пробы, воспользуемся формулами, обычно применяемыми в высокоэффективной хроматографии. Как показывает практика, эти соотношения дают отличные результаты и для ФХ:
ECV = π × D2 ×L/4;
UФЛЕШ = πr2ФЛЕШ / πr2ВЭЖХ × UВЭЖХ;
МФЛЕШ = ECVФЛЕШ / ECVВЭЖХ × МВЭЖХ,
где ECV – эффективный объем колонки; L – длина; D – диаметр; М – объем вводимой пробы; U – скорость потока; rФЛЕШ – радиус флеш-картриджа; rВЭЖХ – радиус ВЭЖХ-колонки.
Объединим исходные и расчетные величины (см. таблицу). Результаты расчетов применили на препаративном хроматографе pF-450 (рис.6). Из рисунка видно, что правильный перенос аналитических условий на препаративную флеш-хроматографию дает результат, не уступающий по качеству, полученному в аналитическом режиме.
UPFP-хроматографы (pF-430, pF-450, pF-4100) и флеш-кроссоверы серии pF-4250 способны работать не только с флеш-картриджами, но и с металлическими полупрепаративными колонками для ВЭЖХ. Приведенные выше формулы можно применять для расчета условий разделения на полупрепаративных колонках. В качестве примера выбрана аналитическая колонка Uptisphere Strategy C18-2, 10 мкм, 250×4,6 мм. На рис.7 показана зависимость давления от скорости подачи элюента.
Полученные на аналитической колонке результаты можно перенести на полупрепаративные ВЭЖХ-колонки с большим диаметром (от 20 мм и больше). После того, как выбрана модель хроматографа puriFlash, определяют оптимальное рабочее давление ниже максимально возможного. Например, у хроматографа pF-430 максимальное рабочее давление 30 бар. Выберем для эксперимента оптимальное давление в 20 бар. Из рис.7 видно, что это давление для колонки Uptisphere Strategy C18-2 достигается при скорости подачи элюента 0,75 мл/мин. Определим по известной формуле расчетные скорости потока элюента при установке на хроматограф pF-430 полупрепаративных ВЭЖХ-колонок диаметром 21,2; 28 и 50 мм, наполненных неподвижной фазой С18 с диаметром частиц 10 мкм:
диаметр 21,2 мм: оптимальная скорость [(21,2)3/(4,6)2]×0,75 = 16 мл/мин, давление 20 бар;
диаметр 28 мм: оптимальная скорость [(28)2/(4,6)2]×0,75 = 28 мл/мин, давление 20 бар;
диаметр 50 мм: оптимальная скорость [(50)2/(4,6)2]×0,75 = 89 мл/мин, давление 20 бар.
Кстати, легко подсчитать, что поставить препаративную колонку диаметром 80 мм (и больше) на модель pF-430 нельзя, так как при давлении в 20 бар оптимальная скорость потока элюента составит 226 мл/мин, а максимальная скорость подачи элюента у этой модели pF-430 равна 200 мл/мин. Для хроматографа pF-450 значение рабочего давления составит 35 бар (т.е. 70% от максимального значения 50 бар). Такое давление достигается в аналитической колонке Uptisphere Strategy C18-2, 10 мкм, 250×4,6 мм при скорости потока элюента 1,5 мл/мин. Несложно подсчитать, что при установке ВЭЖХ препаративных колонок на хроматограф pF-450 и рабочем давлении в 35 бар скорость потока элюента для колонки диаметром 21,2 мм равна 32 мл/мин, для колонки диаметром 28 мм – 56 мл/мин, для колонки диаметром 50 мм – 177 мл/мин.
Таким образом, пользуясь описанными выше приемами, можно переходить от тонкослойной и аналитической ВЭЖ-хроматографии к ФХ и применять флеш-хроматографы для работы с полупрепаративными ВЭЖХ-колонками.
В заключительной части статьи мы расскажем о том, какие неподвижные фазы предлагает компания Interchim для очистки (разделения) различных классов соединений.
Продолжение следует.
Отзывы читателей
