eng
Выпуск #1/2013
П.Горелов, А.Балацкий
Количественное определение фетальной ДНК в кровотоке матери на амплификаторе qTOWER 2.2
Количественное определение фетальной ДНК в кровотоке матери на амплификаторе qTOWER 2.2
Просмотры: 2997
Концентрацию фетальной внеклеточной ДНК
определяли с использованием метода ПЦР в режиме
реального времени на амплификаторе qTOWER 2.2
(Analytik Jena, Германия).
определяли с использованием метода ПЦР в режиме
реального времени на амплификаторе qTOWER 2.2
(Analytik Jena, Германия).
Теги: fetal cell-free dna noninvasive prenatal diagnosis rassf1a gene real time qtower 2.2 ген rassf1a неинвазивная пренатальная диагностика реал-тайм qtower 2.2 фетальная внднк эпигенетический подход
Первые работы по изучению фетальной внеклеточной ДНК (внДНК) в крови матери как маркера для неинвазивной пренатальной диагностики были направлены на обнаружение последовательностей Y-хромосомы в крови беременных женщин для идентификации плода мужского пола с целью дородовой диагностики заболеваний, сцепленных с полом [2]. Известно, что до седьмой недели беременности чувствительность определения локусов Y-хромосомы методом обычной ПЦР составляет 95%, а при использовании ПЦР в реальном времени пол эмбриона с точностью 100% можно определить уже на пятой неделе развития.
Важнейшая функция пренатальной диагностики – своевременное определение у плода хромосомных заболеваний [3]. Известно, что уровень фетальной ДНК в плазме и сыворотке матери при вынашивании плода с синдромом Дауна повышается в среднем в два раза. В 1999 году обнаружено почти пятикратное повышение внДНК плода в кровотоке матери при преэклампсии (паталогия при беременности) по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью [4]. Увеличение концентрации фетальной ДНК в крови матери описаны и при других нарушениях течения беременности, таких как начавшийся самопроизвольный выкидыш в первом триместре, преждевременные роды [5], истинное приращение плаценты, гестоз, многоводие, гиперемезис [6]. В ряде работ [7, 8] отмечено, что повышение концентраций фетальной внДНК на ранних сроках беременности может служить маркером ранней диагностики осложнений беременности. Выявлено большое количество сайтов, различным образом метилированных у матери и плода. В 2009 году обнаружена чувствительность к метилированию рестриктазы BstU I для селективного разрушения гиперметилированного у матери гена RASSF1A. Таким способом фетальная внДНК в кровотоке матери может определяться количественно, что важно для ранней доклинической диагностики осложнений беременности [9–12].
Перспективный способ оценки количества фетальной внДНК заключается в эпигенетическом подходе, который не затрагивает первичную структуру ДНК, а изменяет активность определенных генов. В эпигенетических исследованиях используется широкий спектр методов молекулярной биологии, в том числе – чувствительные к метилированию рестриктазы. Этот метод мы реализовали в режиме реального времени на амплификаторе qTOWER 2.2 (рис.1).
Для оценки количества фетальной внДНК при помощи эпигенетического метода использовали чувствительную к метилированию рестриктазу Bsh1236I фирмы Fermentas (Латвия). ДНК выделяли из цельной венозной крови с помощью центрифужных фильтров, используя набор innuPure Blood DNA Midi Kit, AnalytikJena. К 1 мкл раствора ДНК добавляли 1,5 мкл буфера для рестрикции, 10 единиц активности указанной рестриктазы и деионизованную воду до объема 15 мкл. Рестрикцию проводили в термошейкере (BioSchake iQ) при 37°С в течение 16 ч. Далее с целью количественного определения гена RASFF1A проводилась ПЦР в реальном времени на qTOWER 2.2 с использованием праймеров RSF-F (5'-AGC CTG AGC TCA TTG AGC TG-3') и RSF-R (5'-ACC AGC TGC CGT GTG G-3'), а также зонда RSF-probe (FAM-5'-CCA ACG CGC TGC GCA T -3'-RTQ1). В качестве внутреннего контроля использовалось определение гена "домашнего хозяйства" (актина) при помощи праймеров Actin-F (5'-GCG CCG TTC CGA AAG TT-3') и Actin-R (5'-CGG CGG ATC GGC AAA-3'), а также зонда Actin-probe (R6G-5'-ACC GCC GAG ACC GCG TC -3'-RTQ1). Применялась реакционная смесь Maxima Probe qPCR Master Mix (Fermentas, Латвия). После денатурации (95°С, 3 мин) проводили амплификацию из 45 циклов, каждый из которых включал денатурацию (95°С, 10 с) и отжиг-элонгацию (60°С, 40 с). Количество фетальной внДНК измерялось в геном-эквивалентах, в качестве стандартов использовалась геномная ДНК человека. Концентрация геномной ДНК измерялась на спектрофотометре ScanDrop 250, за 1 геном-эквивалент принималось 6,6 пг ДНК.
В результате мы определили количество фетальной внДНК, содержащейся в кровотоке матери. Для этого ген RASSF материнской ДНК селективно расщепили, а аналогичный ген плодной ДНК количественно определили при помощи амплификатора qTOWER 2.2 в режиме реального времени с использованием программного обеспечения qPCRsoft1.1. На рис.2 представлены кривые плавления амплификации гена RASSF и окна количественного анализа. Эффективность реакции ПЦР составила 0,91. Амплификатор qTOWER 2.2 отлично справился с поставленной задачей в режиме реального времени.
Для построения калибровочной кривой использовали четыре разведения геномной ДНК (2500, 500, 100 и 20 геном-эквивалентов). Полученные концентрации фетальной внДНК переводили в геном-эквиваленты на 1 мл крови и сопоставляли с клиническими данными. Проведено исследование крови 10 пациенток на количественное содержание фетальной внДНК (см. таблицу). Из таблицы видно, что в кровотоке матерей под номерами 1 и 7 почти пятикратное повышение фетальной внДНК плода по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью (2–6, 8–10). Именно у пациенток под номерами 1 и 7 развилось осложнение беременности в виде гестоза.
Таким образом, выявлено и подтверждено клинически, что при увеличении концентрации фетальной внДНК в кровотоке матери возникает риск развития осложнений беременности. Поэтому реал-тайм амплификатор qTOWER 2.2 рекомендуется для измерения концентрации фетальной внДНК в кровотоке матери по гену RASSF1A, который служит маркером ранней диагностики осложнений беременности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lo Y.M.D., Corbetta N., Chamberlain P.F. et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. – Lancet 1997, v.350, №9076, p.485–487.
2. Farina A., Caramelli E., Concu M. et al. Testing normality of fetal DNA concentration in maternal plasma at 10-12 completed weeks gestation: a preliminary approach to a new marker for genetic screening.– Prenatal Diagnosis, 2002, v.22, №3, p.148–152.
3. Gahan P., Swaminathan R. et al. Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum V. – Annals of the New York Academy of sciences, 2008, v.1137, p.1–6.
4. Lo Y.M.D., Leung T.N., Tein M.S.C. et al. Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in preeclampsia. – Clinical Chemistry, 1999, v.45, p.184–188.
5. Farina A., Leshane E. S., Romero R. et al. High levels of fetal cell-free DNA in maternal serum: a risk factor for spontaneous preterm delivery. – American Journalof Obstetrics and Gynecology, 2005, v.193, №2, p.421–425.
6. Sekizawa A., Jimbo M., Saito H. et al. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta. – Clinical Chemistry, 2002, v.48, №2, p.353–354.
7. Zhong X.Y., Holzgreve W., Hahn S. Risk free simultaneous prenatal identification of fetal Rhesus D status and sex by multiplex real-time PCR using cell free fetal DNA in maternal plasma. – Swiss Medical Weekly, 2001, v.131, № 5–6, p.70–74.
8. Zhong X.Y., Bürk M.R., Troeger C., Jackson L.R., Holzgreve W., Hahn S. Fetal DNA in maternal plasma is elevated in pregnancies with aneuploid fetuses. – Prenatal Diagnosis, 2000, v.20, №10, p.795–798.
9. Richter A.M., Pfeifer G., Dammann R. The RASSF proteins in cancer; from epigenetic silencing to functional characterization. – Biochimica et Biophysica Acta, 2009, v.1796, №2, p.114–128.
10. Sekizawa A., Sugito Y. Detection and Quantification of Fetal DNA in Maternal Plasma by Using LightCycler. – Technology Prenatal Diagnosis Methods in Molecular Biology, 2003, v.444, p.231–238.
11. Leung T.N., Zhang J., Lau T.K. et.al. Maternal plasma fetal DNA as a marker for pretern labour. – Lancer, 1998, v.352, p.1904–1905.
12. Самоходская Л.М., Балацкий А.В., Садекова О.Н., Татарина О.В. и др. Молекулярно-генетический анализ предрасположенности человека к мультифакторным заболеваниям. Монография./Под ред. акад. РАН и РАМН В.А.Ткачука – М.: Изд-во Московского университета, 2011.
Важнейшая функция пренатальной диагностики – своевременное определение у плода хромосомных заболеваний [3]. Известно, что уровень фетальной ДНК в плазме и сыворотке матери при вынашивании плода с синдромом Дауна повышается в среднем в два раза. В 1999 году обнаружено почти пятикратное повышение внДНК плода в кровотоке матери при преэклампсии (паталогия при беременности) по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью [4]. Увеличение концентрации фетальной ДНК в крови матери описаны и при других нарушениях течения беременности, таких как начавшийся самопроизвольный выкидыш в первом триместре, преждевременные роды [5], истинное приращение плаценты, гестоз, многоводие, гиперемезис [6]. В ряде работ [7, 8] отмечено, что повышение концентраций фетальной внДНК на ранних сроках беременности может служить маркером ранней диагностики осложнений беременности. Выявлено большое количество сайтов, различным образом метилированных у матери и плода. В 2009 году обнаружена чувствительность к метилированию рестриктазы BstU I для селективного разрушения гиперметилированного у матери гена RASSF1A. Таким способом фетальная внДНК в кровотоке матери может определяться количественно, что важно для ранней доклинической диагностики осложнений беременности [9–12].
Перспективный способ оценки количества фетальной внДНК заключается в эпигенетическом подходе, который не затрагивает первичную структуру ДНК, а изменяет активность определенных генов. В эпигенетических исследованиях используется широкий спектр методов молекулярной биологии, в том числе – чувствительные к метилированию рестриктазы. Этот метод мы реализовали в режиме реального времени на амплификаторе qTOWER 2.2 (рис.1).
Для оценки количества фетальной внДНК при помощи эпигенетического метода использовали чувствительную к метилированию рестриктазу Bsh1236I фирмы Fermentas (Латвия). ДНК выделяли из цельной венозной крови с помощью центрифужных фильтров, используя набор innuPure Blood DNA Midi Kit, AnalytikJena. К 1 мкл раствора ДНК добавляли 1,5 мкл буфера для рестрикции, 10 единиц активности указанной рестриктазы и деионизованную воду до объема 15 мкл. Рестрикцию проводили в термошейкере (BioSchake iQ) при 37°С в течение 16 ч. Далее с целью количественного определения гена RASFF1A проводилась ПЦР в реальном времени на qTOWER 2.2 с использованием праймеров RSF-F (5'-AGC CTG AGC TCA TTG AGC TG-3') и RSF-R (5'-ACC AGC TGC CGT GTG G-3'), а также зонда RSF-probe (FAM-5'-CCA ACG CGC TGC GCA T -3'-RTQ1). В качестве внутреннего контроля использовалось определение гена "домашнего хозяйства" (актина) при помощи праймеров Actin-F (5'-GCG CCG TTC CGA AAG TT-3') и Actin-R (5'-CGG CGG ATC GGC AAA-3'), а также зонда Actin-probe (R6G-5'-ACC GCC GAG ACC GCG TC -3'-RTQ1). Применялась реакционная смесь Maxima Probe qPCR Master Mix (Fermentas, Латвия). После денатурации (95°С, 3 мин) проводили амплификацию из 45 циклов, каждый из которых включал денатурацию (95°С, 10 с) и отжиг-элонгацию (60°С, 40 с). Количество фетальной внДНК измерялось в геном-эквивалентах, в качестве стандартов использовалась геномная ДНК человека. Концентрация геномной ДНК измерялась на спектрофотометре ScanDrop 250, за 1 геном-эквивалент принималось 6,6 пг ДНК.
В результате мы определили количество фетальной внДНК, содержащейся в кровотоке матери. Для этого ген RASSF материнской ДНК селективно расщепили, а аналогичный ген плодной ДНК количественно определили при помощи амплификатора qTOWER 2.2 в режиме реального времени с использованием программного обеспечения qPCRsoft1.1. На рис.2 представлены кривые плавления амплификации гена RASSF и окна количественного анализа. Эффективность реакции ПЦР составила 0,91. Амплификатор qTOWER 2.2 отлично справился с поставленной задачей в режиме реального времени.
Для построения калибровочной кривой использовали четыре разведения геномной ДНК (2500, 500, 100 и 20 геном-эквивалентов). Полученные концентрации фетальной внДНК переводили в геном-эквиваленты на 1 мл крови и сопоставляли с клиническими данными. Проведено исследование крови 10 пациенток на количественное содержание фетальной внДНК (см. таблицу). Из таблицы видно, что в кровотоке матерей под номерами 1 и 7 почти пятикратное повышение фетальной внДНК плода по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью (2–6, 8–10). Именно у пациенток под номерами 1 и 7 развилось осложнение беременности в виде гестоза.
Таким образом, выявлено и подтверждено клинически, что при увеличении концентрации фетальной внДНК в кровотоке матери возникает риск развития осложнений беременности. Поэтому реал-тайм амплификатор qTOWER 2.2 рекомендуется для измерения концентрации фетальной внДНК в кровотоке матери по гену RASSF1A, который служит маркером ранней диагностики осложнений беременности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lo Y.M.D., Corbetta N., Chamberlain P.F. et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. – Lancet 1997, v.350, №9076, p.485–487.
2. Farina A., Caramelli E., Concu M. et al. Testing normality of fetal DNA concentration in maternal plasma at 10-12 completed weeks gestation: a preliminary approach to a new marker for genetic screening.– Prenatal Diagnosis, 2002, v.22, №3, p.148–152.
3. Gahan P., Swaminathan R. et al. Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum V. – Annals of the New York Academy of sciences, 2008, v.1137, p.1–6.
4. Lo Y.M.D., Leung T.N., Tein M.S.C. et al. Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in preeclampsia. – Clinical Chemistry, 1999, v.45, p.184–188.
5. Farina A., Leshane E. S., Romero R. et al. High levels of fetal cell-free DNA in maternal serum: a risk factor for spontaneous preterm delivery. – American Journalof Obstetrics and Gynecology, 2005, v.193, №2, p.421–425.
6. Sekizawa A., Jimbo M., Saito H. et al. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta. – Clinical Chemistry, 2002, v.48, №2, p.353–354.
7. Zhong X.Y., Holzgreve W., Hahn S. Risk free simultaneous prenatal identification of fetal Rhesus D status and sex by multiplex real-time PCR using cell free fetal DNA in maternal plasma. – Swiss Medical Weekly, 2001, v.131, № 5–6, p.70–74.
8. Zhong X.Y., Bürk M.R., Troeger C., Jackson L.R., Holzgreve W., Hahn S. Fetal DNA in maternal plasma is elevated in pregnancies with aneuploid fetuses. – Prenatal Diagnosis, 2000, v.20, №10, p.795–798.
9. Richter A.M., Pfeifer G., Dammann R. The RASSF proteins in cancer; from epigenetic silencing to functional characterization. – Biochimica et Biophysica Acta, 2009, v.1796, №2, p.114–128.
10. Sekizawa A., Sugito Y. Detection and Quantification of Fetal DNA in Maternal Plasma by Using LightCycler. – Technology Prenatal Diagnosis Methods in Molecular Biology, 2003, v.444, p.231–238.
11. Leung T.N., Zhang J., Lau T.K. et.al. Maternal plasma fetal DNA as a marker for pretern labour. – Lancer, 1998, v.352, p.1904–1905.
12. Самоходская Л.М., Балацкий А.В., Садекова О.Н., Татарина О.В. и др. Молекулярно-генетический анализ предрасположенности человека к мультифакторным заболеваниям. Монография./Под ред. акад. РАН и РАМН В.А.Ткачука – М.: Изд-во Московского университета, 2011.
Отзывы читателей
