Протеомный анализ направлен на количественную оценку белков в пределах клетки, ткани или организма в целом в определенные моменты времени и при определенных обстоятельствах. В отличие от генома, протеом очень динамичен: характер экспрессии белков клеток в организме изменяется в зависимости от физиологических функций, степени дифференцировки клеток и воздействия факторов окружающей среды. В последнее десятилетие в протеомном анализе широко применяются высокотехнологичные методы, обладающие высокой эффективностью, информативностью и чувствительностью, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, а также использование белковых чипов с различными типами детекции. В работе для количественной протеомики индуцированной дифференцировки раковых клеток линии HL-60 применяли методы ВЭЖХ-МС/МС.

sitemap
Наш сайт использует cookies. Продолжая просмотр, вы даёте согласие на обработку персональных данных и соглашаетесь с нашей Политикой Конфиденциальности
Согласен
Поиск:

Вход
Архив журнала
Журналы
Медиаданные
Редакционная политика
Реклама
Авторам
Контакты
TS_pub
technospheramag
technospheramag
ТЕХНОСФЕРА_РИЦ
© 2001-2025
РИЦ Техносфера
Все права защищены
Тел. +7 (495) 234-0110
Оферта

Яндекс.Метрика
R&W
 
 
Вход:

Ваш e-mail:
Пароль:
 
Регистрация
Забыли пароль?
Книги по аналитике
Магеррамов А.М., Мамедов И.Г., Байрамов М.Р. / Maharramov A.M., Mamedov I.G., Bayramov M.R.
Другие серии книг:
Мир химии
Библиотека Института стратегий развития
Мир квантовых технологий
Мир математики
Мир физики и техники
Мир биологии и медицины
Мир наук о Земле
Мир материалов и технологий
Мир электроники
Мир программирования
Мир связи
Мир строительства
Мир цифровой обработки
Мир экономики
Мир дизайна
Мир увлечений
Мир робототехники и мехатроники
Для кофейников
Мир радиоэлектроники
Библиотечка «КВАНТ»
Умный дом
Мировые бренды
Вне серий
Библиотека климатехника
Мир транспорта
Мир фотоники
Мир станкостроения
Мир метрологии
Мир энергетики
Книги, изданные при поддержке РФФИ
Выпуск #3/2013
М.Родченкова, С.Новикова
Оптимизация условий хромато-масс-спектрометрического метода для качественного и полуколичественного протеомного анализа
Просмотры: 4313
Протеомный анализ направлен на количественную оценку белков в пределах клетки, ткани или организма в целом в определенные моменты времени и при определенных обстоятельствах. В отличие от генома, протеом очень динамичен: характер экспрессии белков клеток в организме изменяется в зависимости от физиологических функций, степени дифференцировки клеток и воздействия факторов окружающей среды. В последнее десятилетие в протеомном анализе широко применяются высокотехнологичные методы, обладающие высокой эффективностью, информативностью и чувствительностью, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, а также использование белковых чипов с различными типами детекции. В работе для количественной протеомики индуцированной дифференцировки раковых клеток линии HL-60 применяли методы ВЭЖХ-МС/МС.
Одна из задач протеомного анализа – регистрация и каталогизация белков и для ее решения необходимо обеспечить достаточную глубину протеомного анализа. На полноту протеомного масс-спектрометрического анализа оказывают существенное влияние как чувствительность, быстродействие и разрешающая способность прибора, так и процесс пробоподготовки. Часто используемый для масс-спектрометрического анализа белков подход "по восходящей" подразумевает идентификацию белков на основании спектров фрагментации их пептидов и, следовательно, требует наиболее полного ферментативного гидролиза белков, а также регистрации информативных масс-спектров. Кроме того, при исследовании протеома клеточных линий бактерий и млекопитающих, а также образцов тканей пробоподготовка начинается с экстракции белков, которая должна обеспечивать растворение максимальной доли белков, содержащихся в клетке.
Для экстракции основную сложность представляют мембранные белки, составляющие около 30% от всех белков клетки [1]. Для перевода мембранных белков в раствор хорошо подходит использование детергентов: додецил сульфата натрия (SDS) и дезоксихолата натрия (DOC) [2]. Однако применение детергентов, в особенности ионных, сильно интерферирует с масс-спектрометрическим анализом, поэтому их надо удалить из реакционной смеси. При этом небольшие концентрации дезоксихолата натрия повышают денатурацию белковых молекул и не влияют на активность трипсина. DOC можно удалить из реакционной смеси путем приципитации в кислых условиях при -20⁰С[3].

Использование SDS при экстракции белков для последующего масс-спектрометрического анализа стало возможным после разработки протокола гидролиза с использованием концентрирующих фильтров (FASP-протокол) [4]. Благодаря проведению многократных промывок раствором мочевины SDS удаляется из пробы. FASP-протокол позволил экстрагировать белки для масс-спектрометрического анализа из таких образцов, как парафинизированные препараты опухолевых тканей [5].
Ферментативное расщепление белков можно проводить в растворе или с использованием твердой фазы, например, в полиакриламидном геле или, как уже упоминалось, с использованием концентрирующих фильтров [6, 7]. При проведении гидролиза в растворе пробоподготовка проходит от начала до конца в одной пробирке, что уменьшает потери, возможные при переносе биологического материала. В твердой фазе денатурация белков максимальна, и для экстракции белков можно также применять SDS. В процессе гидролиза очень важно денатурировать белковые молекулы, чтобы сделать сайты узнавания фермента максимально доступными. Для этого широко применяют хаотропы (мочевину, тиомочевину, гуанидина хлорид), но пробы с мочевиной нельзя сильно нагревать из-за риска модификации лизина, приводящей к появлению пропущенных сайтов гидролиза в пептидах. Однако повышенные температуры важны для восстановления дисульфидных связей с использованием дитиотреэтола (ДТТ) и/или трис-(2 карбоксиэтил) фосфина (TCEP) [8]. К тому же сериновая протеаза трипсин – наиболее часто используемый фермент для гидролитического расщепления белков – может снижать свою активность в присутствии высоких концентраций хаотропов, в частности, мочевины. Поэтому необходимо либо снижать концентрацию хаотропа, либо удалять его из реакционной смеси. Тандемное использование нескольких ферментов, например, комбинации лизина С и трипсина, увеличивает эффективность гидролиза [9].
Успешная идентификация пептидов и белков во многом зависит от качества получаемого спектра фрагментации пептида. Вид спектра и тип преобладающих фрагментарных ионов может различаться в зависимости от применяемого типа фрагментации. Наиболее часто используются для тандемного масс-спектрометрического анализа два типа фрагментации: фрагментация, индуцированная столкновением (CID), и высокоэнергетическая фрагментация, индуцированная столкновением (HCD). При этом выявлено, что HCD-тип фрагментации наиболее эффективен для двух- и трехзарядных пептидных ионов, представляющих собой наиболее информативный спектр пептидов, содержащихся в гидролизате [10, 11].
Оптимальная пробоподготовка и хромато-масс-спектрометрический метод, позволяющий получить наиболее полное представление о качественном составе протеома, необходимы при оценке количественных изменений белков. В случае исследования состояния нормы и патологии у пациентов установление большого количества белков с измененной экспрессией позволяет в дальнейшем проводить биоинформационную обработку данных, чтобы определить сигнальные пути, вероятно, вовлеченные в развитие заболевания.
Количественный масс-спектрометрический анализ проводят либо с применением стабильных изотопных меток, либо используют безметковый подход. Абсолютный количественный анализ, использующий стабильные изотопные метки, позволяет с высокой точностью определить концентрацию белков в биологическом образце, однако применение меченых стандартов – дорогостоящий метод. Безметковый количественный анализ основан на сравнении площади под пиками зарегистрированных пептидных ионов или на подсчете числа снятых спектров для пептида. Для безметкового подхода требуется высокопроизводительный ЖХ/МС анализ и тщательное выравнивание хроматографических пиков. Этот подход обеспечивает быстрый и дешевый количественный анализ.
Цель работы – подбор условий для пробоподготовки, включая экстракцию белков и их ферментативный гидролиз, а также подбор хромато-масс-спектрометрических условий для получения наибольшего количества идентификаций белков клеток линии HL60 (клетки острого промиелоцитарного лейкоза). Подобранные условия использовались для масс-спектрометрического анализа белков клеток линии HL60 в разных временных точках после добавления индуктора дифференцировки – трансретиноевой кислоты с последующим относительным количественным анализом полученных данных с помощью программного обеспечения Progenesis LC/MS.
Экспериментальные методы
Экстракция белка c использованием дезоксихолата натрия. К осадку клеток HL60, содержащему 109 клеток, добавляли по 150 мкл лизирующего буфера, содержащего 3% дезоксихолата натрия (DOC), 75 мМ TrisHCl, pH=7,6. Затем пробы инкубировали во льду в течение 20 мин, после чего подвергали обработке ультразвуком, шесть циклов с интенсивностью 30%. Далее пробы центрифугировали 20 мин со скоростью 7000 об./мин, супернатант отбирали, а к осадку добавляли еще по 100 мкл лизирующего буфера и повторяли процедуры сонификации и центрифугирования. Конечный объем полученного раствора белка составлял 250 мкл. Затем измеряли концентрацию белка в каждой пробе с использованием бицинхониновой кислоты (BCA).
Экстракция белка c использованием додецилсульфата натрия. К осадку клеток HL60, содержащему 109 клеток, добавляли по 250 мкл лизирующего буфера, содержащего 4% додецилсульфат натрия (SDS), 75 мМ TrisHCl, pH=7,6, инкубировали в течение 1 ч при температуре 96°С и встряхивании 600 об./мин, затем измеряли концентрацию белка в каждой пробе с помощью BCA.
Измерение концентрации белков с использованием BCA. Для построения калибровочной кривой выбирали следующие точки, соответствующие количеству белка-стандарта бычьего сывороточного альбумина (BSA), разведенному в 30 мкл ddH2O: 2 мкг, 5 мкг, 10 мкг, 25 мкг, 50 мкг. Каждую измеряемую пробу белка объемом 2 мкл разводили в 28 мкл деионизированной воды (ddH2O). К каждой пробе стандарта, измеряемым пробам и контрольной пробе (30 мкл ddH2O) добавляли по 1 мл реагента A и 20 мкл реагента B, перемешивали и инкубировали в течение 20 мин при температуре 56°С со скоростью перемешивания 300 об./мин в термомиксере ThermomixerComfort (Eppendorf). Затем пробы остужали до комнатной температуры и проводили измерение оптической плотности при длине волны 562 нм с помощью спектрофотометра NanoDrop-1000 (Thermo Fisher Scientific) с программным обеспечением ND-1000 v.3.5.1.
Гидролитическое расщепление белков в растворе. Для восстановления дисульфидных связей в белковых молекулах к пробам белков, полученных в результате экстракции с использованием дезоксихолиевой кислоты, содержащих 100 мкг белка, добавляли денатурирующий буфер, содержащий 12 мМ натриевой соли дезоксихолиевой кислоты, 2 M тиомочевины, 2,5 мМ ЭДТА, 75 мМ Tris-HCl, 87 мМ ДТТ и 6,7 мМ ТСЕР, pH=8,5 в соотношении 1:1 (об/об), тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 42⁰С в течение 60 мин. По окончании процедуры восстановления дисульфидов к каждой пробе добавляли алкилирующий раствор, содержащий 12 мМ натриевой соли дезоксихолиевой кислоты, 2 M тиомочевины, 2,5 мМ ЭДТА, 75 мМ Tris-HCl, 450 мМ 4-винилпиридин, pH=8,5 в соотношении: объем алкилирующего раствора/объем пробы 1/12 и тщательно перемешивали. Реакционную смесь инкубировали в течение 45–60 мин при комнатной температуре в недоступном для дневного света месте.
После восстановления и алкилирования дисульфидов каждую пробу доводили до объема 100 мкл буфером для трипсинолиза, содержащим 42 мМ триэтиламмония бикарбонат, pH=8,5 с последующим ферментативным расщеплением в следующих условиях: добавляли трипсин в соотношении массы трипсина к массе тотального белка 1/100 и затем инкубировали в течение 2 ч при температуре 44°C, через 2 ч повторно добавляли аликвоту трипсина в соотношении массы трипсина к массе белка 1/100 и затем инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°C. Трипсинолиз останавливали добавлением 100% муравьиной кислоты в каждую пробу до конечной концентрации 5%. Инкубировали при температуре -20°C 30 мин, затем центрифугировали при 10000 об./мин – 15 мин. Супернатант отбирали и подвергали дальнейшему масс-спектрометрическому анализу.
Гидролитическое расщепление белков с помощью концентрирующих фильтров. Полученные в результате экстракции с использованием додецилсульфата натрия пробы белков, содержащих 100 мкг общего белка, помещали в концентрирующие фильтры Microcondevices YM-30. Пробы промывали путем добавления 200 мкл буфера, содержащего 8 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, pH =8,5 с последующим центрифугированием при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. Процедуру промывки повторяли три раза. К пробам в концентрирующих фильтрах добавляли 100 мкл алкилирующего раствора, инкубировали при температуре 25°C в течение 30 мин и встряхиванием 600 об./мин, после чего центрифугировали при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. После алкилирования пробы дважды промывали 200 мкл буфера, содержащего 8 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, pH =8,5 с помощью центрифугирования при 2,5 Kg в течение 40 мин при температуре 20°C. К пробам в концентрирующих фильтрах добавляли по 40 мкл буфера для трипсинолиза, затем к каждой пробе добавляли раствор трипсина в соотношении: общая масса фермента/общая масса белка 1/100 и инкубировали в течение ночи при температуре 37°C. Затем добавляли трипсин в соотношении: общая масса фермента/общая масса белка 1/100 и инкубировали 2 ч при температуре 37°C. Для получения раствора пептидов пробы центрифугировали при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. Фильтры промывали раствором 30%-ной муравьиной кислоты c помощью центрифугирования при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. Полученную смесь пептидов высушивали на центрифужном концентраторе, перерастворяли в 100 мкл 5%-ной муравьиной кислоты и подвергали дальнейшему масс-спектрометрическому анализу.
Хроматографическое разделение. Пептиды загружали на обогащающую колонку Zorbax 300SB-C18, диаметр частиц 5 мкм, 5 мм×0,3мм (Agilent Technologies), и промывали подвижной фазой для загрузки и промывки обогащающей колонки (5%-ный раствор ацетонитрила в 0,1%-ной муравьиной кислоте и 0,05%-ной трифторуксусной кислоте) при скорости потока 3 мкл/мин в течение 5 мин. Пептиды разделяли на аналитической колонке Zorbax 300SB-C18, диаметр частиц 3,5 мкм, 150 мм×75 мкм, в градиенте подвижной фазы В (80%-ный раствор ацетонитрила в 0,1%-ной муравьиной кислоте) при скорости потока 0,3 мкл/мин. Использовали в зависимости от эксперимента следующие градиенты ацетонитрила:
аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В в течение 5 мин, после чего линейно увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 60% в течение 80 мин, в течение 5 мин увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 100%, в течение 10 мин промывали аналитическую колонку 100%-ной подвижной фазой В, в течение 5 мин уменьшали концентрацию подвижной фазы B до 5%, в течение 15 мин аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В;
аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В в течение 10 мин, после чего линейно увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 60% в течение 190 мин, в течение 5 мин увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 100%, в течение 10 мин промывали аналитическую колонку 100%-ной подвижной фазой В, в течение 5 мин уменьшали концентрацию подвижной фазы B до 5%, в течение 20 мин аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В.
Масс-спектрометрическая регистрация. Для получения MC-скана с разрешением 30000 (для m/z=400), в диапазоне величин m/z=300–2000, в режиме положительной ионизации, использовали масс-анализатор типа Орбитреп (OrbitrapVelos ThermoFisherScientific, Bremen). Пять наиболее интенсивных ионов, зарегистрированных в МС-скане, выбирали для последующей фрагментации, если их абсолютная интенсивность превышала 5000 единиц. В зависимости от метода использовали либо HCD-тип фрагментации с нормализованной энергией соударения 35%, либо CID-тип фрагментации с нормализованной энергией соударения 35%. Применяли динамическое исключение: длительность исключения составляла 60 с после того, как ион хотя бы один раз был фрагментирован с получением MC/MC-спектра. Размер списка исключения составлял 500 ионов. Для получения МС/МС-скана с разрешением 7500 (для m/z=400) в диапазоне величин m/z=300–2000, в режиме положительной ионизации, использовали масс-анализатор типа Орбитрэп или линейную ионную ловушку.
Поиск в программе Mascot. Экспериментальные файлы конвертировали в формат Mascotgeneric, поиск проводили относительно базы данных SwissProt таксономическим ограничением для вида Homo Sapiens, толерантность для пептидных ионов составила 20 ppm, для фрагментарных ионов – 0,1 Da, в качестве фиксированной модификации выбрано карбамидометилирование цистеина, в качестве вариабельной модификации – окисленный метионин. Параллельный поиск проводили по базе данных инвертированных и рандомных последовательностей аминокислот (decoy).
Относительный количественный анализ в программном обеспечении Progenesis LC/MS. Экспериментальные файлы загружали в программное обеспечение Progenesis LC/MS, относительно выбранного референсного файла проводили выравнивание, детекцию и фильтрацию MС-пиков. Получали список пиков (features) с определенной величиной m/z, интенсивностью и площадью под пиком. Создавали дизайн эксперимента, объединяли данные, соответствующие временным точкам 0 ч, 3 ч, 24 ч и 96 ч. МС/МС-спектры, соответствующие детектированным пикам, загружали в программу Mascot и проводили поиск идентификаций белков. Результат поиска загружали в программу Progenesis LC/MS, в конечном итоге получали список белков с измененной экспрессией.
Результаты и обсуждение
Экстракцию белков из образцов клеток линии HL60, соответствующих временным точкам 0 ч, 3 ч, 24 ч и 96 ч, провели для последующего трипсинолиза в растворе с использованием дезоксихолата натрия (DOC) и для последующего трипсинолиза на мембранных фильтрах с использованием додецилсульфата натрия (SDS). После экстракции белков из каждой пробы клеток линии HL60 определили их концентрацию спектрофотометрическим методом с использованием BCA (табл.1). В таблице указаны средние значения с доверительным интервалом (доверительная вероятность 95%), рассчитанные по результатам трех независимых измерений для каждой временной точки.
Как видно из табл.1, наибольшая концентрация общего белка получена после экстракции с использованием SDS. Для пробы белка после экстрации с DOC, соответствующей временной точке 96 ч, проведен гидролиз в растворе. Для пробы белка после экстрации с SDS, соответствующей временной точке 96 ч, проведен гидролиз с использованием мембранных фильтров, пропускающих массы меньше 30 кДа. В результате получены две смеси пептидов, для каждой из них провели четыре хромато-масс-спектрометрических эксперимента (по пять технических повторов в каждом) на приборе Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific, Bremen), соединенном с хроматографической системой Agilent 1200 HPLC, в нанопотоковом режиме с различными условиями градиента, энергией фрагментации и типом масс-спектрометрического детектора. Условия проведенных экспериментов приведены в табл.2.
В результате проведенных экспериментов получили 40 файлов в формате .raw, которые конвертировали в формат .mgf, и выполнили поиск для идентификации белков по экспериментальным MS2 спектрам с помощью программного обеспечения Mascot, по базе данных SwissProt для биологического вида HomoSapiens.
Для определения оптимального хромато-масс-спектрометрического метода оценивали такие параметры, как количество обработанных MS2 спектров, идентифицированных пептидов, идентифицированных белков, процент ложноположительных результатов (false discovery rate). В табл.3 приведены результаты идентификаций по Mascot MS2-спектров, полученных в результате экспериментов, проведенных с продуктами гидролиза в растворе и с продуктами гидролиза на фильтрах. Указаны средние значения для оцениваемых параметров поиска по Mascot, рассчитанные по результатам пяти независимых технических повторов.
Как видно из табл.3, наибольшие показатели для количества обработанных MS2-спектров, идентифицированных пептидов и белков, а также приемлемое значение для процента ложноположительных результатов (< 2%) соответствуют комбинации следующих условий эксперимента: лизис клеток и экстракция белков с использованием SDS, ферментативный гидролиз на фильтрах, градиент ацетонитрила в течение 240 мин, HCD-тип энергии фрагментации, тип анализатора – орбитальная ионная ловушка.
Для проб белка после лизиса и экстрации белков с SDS, соответствующих временным точкам 0 ч, 3 ч, 24 ч и 96 ч, провели ферментативный гидролиз с использованием мембранных фильтров, пропускающих массы меньше 30 кДа. Для полученных гидролизатов провели хромато-масс-спектрометрический эксперимент на приборе Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific, Bremen), сопряженном с хроматографической системой Agilent 1200 HPLC, в нанопотоковом режиме, используя градиент ацетонитрила в течение 240 мин, HCD-тип энергии фрагментации, тип анализатора – орбитальная ионная ловушка в пяти технических повторах. В результате получили 20 файлов в формате .raw, которые обработали с помощью программного обеспечения Progenesis. Относительный количественный анализ позволил выявить 111663 пептидных иона, для которых получили 386460 MS2-спектров. По результатам поиска с использованием Mascot по данным спектрам идентифицировали 2512 белков. Среди них оказалось 11, 95, 560 белков, для которых наблюдалось стати.стически значимое изменение содержания в пробе более чем в два раза (p-value < 0,01) во временных точках 3 ч, 24 ч, 96 ч, соответственно по сравнению с контролем (временная точка 0 ч) после добавления индуктора дифференцировки.
Заключение
Практический выход протеомики для медицины – использование белков для диагностики заболеваний. Изучение структуры и функций белка позволит диагностировать и искать подходы для борьбы с социально значимыми заболеваниями. Две основные задачи, поставленные перед протеомным анализом, – это каталогизация всех белков, синтезируемых различными типами клеток, и составление схем связей между повышением или понижением уровня синтеза белков и происходящими в организме процессами. Для решения этих задач необходима разработка и применение эффективных методов пробоподготовки к протеомному анализу, а также поиск подходов к количественному измерению белков. По итогам проделанной работы выбраны условия для пробоподготовки и хромато-масс-спектрометрического анализа с целью получения наибольшего количества идентификаций белков, что обеспечивает большую глубину качественного протеомного анализа.
Относительный количественный анализ идентифицированных белков без использования изотопных меток позволяет легко и быстро проводить сравнение содержания белков, соответствующих биологическим образцам в различных состояниях: норма/патология, различные стадии дифференцировки, до/после введения лекарственного вещества.

Литература
1. Fischer F., Wolters D., Ro¨gner M.and Poetsch A. Toward the complete membrane proteome: high coverage of integral membrane proteins through transmembrane peptide detection. – Molecular & Cellular Proteomics, 2006, Mar, v.5(3), р.444–453.
2. From Cells to Peptides:“One-Stop”Integrated Proteomic Processing Using AmphipolsZhibinNing, DeepteeSeebun, Brett Hawley, Cheng-Kang Chiang, and Daniel Figeys dx.doi.org/10.1021/pr301064z|. – Journalof Proteome Research, 2013, v.12, p.1512−1519.
3. Proc L.J. A quantitative studyof the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. – J. Proteome Research, 2010, v.9(10),p.5422–5437.
4. Wisniewski J.R. et al. Universal sample preparation method for proteome analysis. – Nature Methods, 2009, v.6(5), р.359–62.
5. Jacek R. Wis´niewski, Pawel Ostasiewicz, Kamila Dus´, Dorota F. Zielin´ska, Florian Gnad and Matthias Mann. Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma. – Molecular Systems Biology, 2012, v.8, p.611.
6. Granvogl B., Plöscher M., Eichacker L.A. Sample preparation by in-gel digestion for mass spectrometry-based proteomics. – Analytics andBioanalyticsChemistry, 2007, Oct, v.389(4), p.991–1002.
7. Medzhradszky K.F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. – Methods in Enzymology, 2005, v.405, p.50–65.
8. Hun J.C., Hun G.Y. A procedure for quantitative determination of tris(2-carboxyethyl)phosphine, an odorless reducing agent more stable and effective than dithiothreitol. – Analytical Biochemistry, 1994, Jul, v.220(1), p.5–10.
9. Glatter T. et al. Large-scale quantitative assessment of different in-solution protein digestion protocols reveals superior cleavage efficiency of tandem Lys-C/Trypsin proteolysis over trypsin digestion. – Journal of Proteome Research, 2012, v.11(11), p.5145–5156.
10. Frese C.K. et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD, ETD on an LTQ-OrbitrapVelos. – Journal of Proteome Research, 2011, v.10, p.2377–2388.
11. Michalski A., Neuhauser N., Cox J., Mann M. A systematic investigation into the nature of tryptic HCD spectra. – Journal of Proteome Research, 2012 v.11(11), p.5479–5491.
 
 Отзывы читателей
Разработка: студия Green Art