eng
Выпуск #3/2013
М.Родченкова, С.Новикова
Оптимизация условий хромато-масс-спектрометрического метода для качественного и полуколичественного протеомного анализа
Оптимизация условий хромато-масс-спектрометрического метода для качественного и полуколичественного протеомного анализа
Просмотры: 4048
Протеомный анализ направлен на количественную оценку белков в пределах клетки, ткани или организма в целом в определенные моменты времени и при определенных обстоятельствах. В отличие от генома, протеом очень динамичен: характер экспрессии белков клеток в организме изменяется в зависимости от физиологических функций, степени дифференцировки клеток и воздействия факторов окружающей среды. В последнее десятилетие в протеомном анализе широко применяются высокотехнологичные методы, обладающие высокой эффективностью, информативностью и чувствительностью, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, а также использование белковых чипов с различными типами детекции. В работе для количественной протеомики индуцированной дифференцировки раковых клеток линии HL-60 применяли методы ВЭЖХ-МС/МС.
Теги: high performance liquid chromatography and mass spectrometry quantification of proteins the proteome analysis количественная оценка белков протеомный анализ хромато-масс-спектрометрический метод
Одна из задач протеомного анализа – регистрация и каталогизация белков и для ее решения необходимо обеспечить достаточную глубину протеомного анализа. На полноту протеомного масс-спектрометрического анализа оказывают существенное влияние как чувствительность, быстродействие и разрешающая способность прибора, так и процесс пробоподготовки. Часто используемый для масс-спектрометрического анализа белков подход "по восходящей" подразумевает идентификацию белков на основании спектров фрагментации их пептидов и, следовательно, требует наиболее полного ферментативного гидролиза белков, а также регистрации информативных масс-спектров. Кроме того, при исследовании протеома клеточных линий бактерий и млекопитающих, а также образцов тканей пробоподготовка начинается с экстракции белков, которая должна обеспечивать растворение максимальной доли белков, содержащихся в клетке.
Для экстракции основную сложность представляют мембранные белки, составляющие около 30% от всех белков клетки [1]. Для перевода мембранных белков в раствор хорошо подходит использование детергентов: додецил сульфата натрия (SDS) и дезоксихолата натрия (DOC) [2]. Однако применение детергентов, в особенности ионных, сильно интерферирует с масс-спектрометрическим анализом, поэтому их надо удалить из реакционной смеси. При этом небольшие концентрации дезоксихолата натрия повышают денатурацию белковых молекул и не влияют на активность трипсина. DOC можно удалить из реакционной смеси путем приципитации в кислых условиях при -20⁰С[3].
Использование SDS при экстракции белков для последующего масс-спектрометрического анализа стало возможным после разработки протокола гидролиза с использованием концентрирующих фильтров (FASP-протокол) [4]. Благодаря проведению многократных промывок раствором мочевины SDS удаляется из пробы. FASP-протокол позволил экстрагировать белки для масс-спектрометрического анализа из таких образцов, как парафинизированные препараты опухолевых тканей [5].
Ферментативное расщепление белков можно проводить в растворе или с использованием твердой фазы, например, в полиакриламидном геле или, как уже упоминалось, с использованием концентрирующих фильтров [6, 7]. При проведении гидролиза в растворе пробоподготовка проходит от начала до конца в одной пробирке, что уменьшает потери, возможные при переносе биологического материала. В твердой фазе денатурация белков максимальна, и для экстракции белков можно также применять SDS. В процессе гидролиза очень важно денатурировать белковые молекулы, чтобы сделать сайты узнавания фермента максимально доступными. Для этого широко применяют хаотропы (мочевину, тиомочевину, гуанидина хлорид), но пробы с мочевиной нельзя сильно нагревать из-за риска модификации лизина, приводящей к появлению пропущенных сайтов гидролиза в пептидах. Однако повышенные температуры важны для восстановления дисульфидных связей с использованием дитиотреэтола (ДТТ) и/или трис-(2 карбоксиэтил) фосфина (TCEP) [8]. К тому же сериновая протеаза трипсин – наиболее часто используемый фермент для гидролитического расщепления белков – может снижать свою активность в присутствии высоких концентраций хаотропов, в частности, мочевины. Поэтому необходимо либо снижать концентрацию хаотропа, либо удалять его из реакционной смеси. Тандемное использование нескольких ферментов, например, комбинации лизина С и трипсина, увеличивает эффективность гидролиза [9].
Успешная идентификация пептидов и белков во многом зависит от качества получаемого спектра фрагментации пептида. Вид спектра и тип преобладающих фрагментарных ионов может различаться в зависимости от применяемого типа фрагментации. Наиболее часто используются для тандемного масс-спектрометрического анализа два типа фрагментации: фрагментация, индуцированная столкновением (CID), и высокоэнергетическая фрагментация, индуцированная столкновением (HCD). При этом выявлено, что HCD-тип фрагментации наиболее эффективен для двух- и трехзарядных пептидных ионов, представляющих собой наиболее информативный спектр пептидов, содержащихся в гидролизате [10, 11].
Оптимальная пробоподготовка и хромато-масс-спектрометрический метод, позволяющий получить наиболее полное представление о качественном составе протеома, необходимы при оценке количественных изменений белков. В случае исследования состояния нормы и патологии у пациентов установление большого количества белков с измененной экспрессией позволяет в дальнейшем проводить биоинформационную обработку данных, чтобы определить сигнальные пути, вероятно, вовлеченные в развитие заболевания.
Количественный масс-спектрометрический анализ проводят либо с применением стабильных изотопных меток, либо используют безметковый подход. Абсолютный количественный анализ, использующий стабильные изотопные метки, позволяет с высокой точностью определить концентрацию белков в биологическом образце, однако применение меченых стандартов – дорогостоящий метод. Безметковый количественный анализ основан на сравнении площади под пиками зарегистрированных пептидных ионов или на подсчете числа снятых спектров для пептида. Для безметкового подхода требуется высокопроизводительный ЖХ/МС анализ и тщательное выравнивание хроматографических пиков. Этот подход обеспечивает быстрый и дешевый количественный анализ.
Цель работы – подбор условий для пробоподготовки, включая экстракцию белков и их ферментативный гидролиз, а также подбор хромато-масс-спектрометрических условий для получения наибольшего количества идентификаций белков клеток линии HL60 (клетки острого промиелоцитарного лейкоза). Подобранные условия использовались для масс-спектрометрического анализа белков клеток линии HL60 в разных временных точках после добавления индуктора дифференцировки – трансретиноевой кислоты с последующим относительным количественным анализом полученных данных с помощью программного обеспечения Progenesis LC/MS.
Экспериментальные методы
Экстракция белка c использованием дезоксихолата натрия. К осадку клеток HL60, содержащему 109 клеток, добавляли по 150 мкл лизирующего буфера, содержащего 3% дезоксихолата натрия (DOC), 75 мМ TrisHCl, pH=7,6. Затем пробы инкубировали во льду в течение 20 мин, после чего подвергали обработке ультразвуком, шесть циклов с интенсивностью 30%. Далее пробы центрифугировали 20 мин со скоростью 7000 об./мин, супернатант отбирали, а к осадку добавляли еще по 100 мкл лизирующего буфера и повторяли процедуры сонификации и центрифугирования. Конечный объем полученного раствора белка составлял 250 мкл. Затем измеряли концентрацию белка в каждой пробе с использованием бицинхониновой кислоты (BCA).
Экстракция белка c использованием додецилсульфата натрия. К осадку клеток HL60, содержащему 109 клеток, добавляли по 250 мкл лизирующего буфера, содержащего 4% додецилсульфат натрия (SDS), 75 мМ TrisHCl, pH=7,6, инкубировали в течение 1 ч при температуре 96°С и встряхивании 600 об./мин, затем измеряли концентрацию белка в каждой пробе с помощью BCA.
Измерение концентрации белков с использованием BCA. Для построения калибровочной кривой выбирали следующие точки, соответствующие количеству белка-стандарта бычьего сывороточного альбумина (BSA), разведенному в 30 мкл ddH2O: 2 мкг, 5 мкг, 10 мкг, 25 мкг, 50 мкг. Каждую измеряемую пробу белка объемом 2 мкл разводили в 28 мкл деионизированной воды (ddH2O). К каждой пробе стандарта, измеряемым пробам и контрольной пробе (30 мкл ddH2O) добавляли по 1 мл реагента A и 20 мкл реагента B, перемешивали и инкубировали в течение 20 мин при температуре 56°С со скоростью перемешивания 300 об./мин в термомиксере ThermomixerComfort (Eppendorf). Затем пробы остужали до комнатной температуры и проводили измерение оптической плотности при длине волны 562 нм с помощью спектрофотометра NanoDrop-1000 (Thermo Fisher Scientific) с программным обеспечением ND-1000 v.3.5.1.
Гидролитическое расщепление белков в растворе. Для восстановления дисульфидных связей в белковых молекулах к пробам белков, полученных в результате экстракции с использованием дезоксихолиевой кислоты, содержащих 100 мкг белка, добавляли денатурирующий буфер, содержащий 12 мМ натриевой соли дезоксихолиевой кислоты, 2 M тиомочевины, 2,5 мМ ЭДТА, 75 мМ Tris-HCl, 87 мМ ДТТ и 6,7 мМ ТСЕР, pH=8,5 в соотношении 1:1 (об/об), тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 42⁰С в течение 60 мин. По окончании процедуры восстановления дисульфидов к каждой пробе добавляли алкилирующий раствор, содержащий 12 мМ натриевой соли дезоксихолиевой кислоты, 2 M тиомочевины, 2,5 мМ ЭДТА, 75 мМ Tris-HCl, 450 мМ 4-винилпиридин, pH=8,5 в соотношении: объем алкилирующего раствора/объем пробы 1/12 и тщательно перемешивали. Реакционную смесь инкубировали в течение 45–60 мин при комнатной температуре в недоступном для дневного света месте.
После восстановления и алкилирования дисульфидов каждую пробу доводили до объема 100 мкл буфером для трипсинолиза, содержащим 42 мМ триэтиламмония бикарбонат, pH=8,5 с последующим ферментативным расщеплением в следующих условиях: добавляли трипсин в соотношении массы трипсина к массе тотального белка 1/100 и затем инкубировали в течение 2 ч при температуре 44°C, через 2 ч повторно добавляли аликвоту трипсина в соотношении массы трипсина к массе белка 1/100 и затем инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°C. Трипсинолиз останавливали добавлением 100% муравьиной кислоты в каждую пробу до конечной концентрации 5%. Инкубировали при температуре -20°C 30 мин, затем центрифугировали при 10000 об./мин – 15 мин. Супернатант отбирали и подвергали дальнейшему масс-спектрометрическому анализу.
Гидролитическое расщепление белков с помощью концентрирующих фильтров. Полученные в результате экстракции с использованием додецилсульфата натрия пробы белков, содержащих 100 мкг общего белка, помещали в концентрирующие фильтры Microcondevices YM-30. Пробы промывали путем добавления 200 мкл буфера, содержащего 8 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, pH =8,5 с последующим центрифугированием при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. Процедуру промывки повторяли три раза. К пробам в концентрирующих фильтрах добавляли 100 мкл алкилирующего раствора, инкубировали при температуре 25°C в течение 30 мин и встряхиванием 600 об./мин, после чего центрифугировали при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. После алкилирования пробы дважды промывали 200 мкл буфера, содержащего 8 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, pH =8,5 с помощью центрифугирования при 2,5 Kg в течение 40 мин при температуре 20°C. К пробам в концентрирующих фильтрах добавляли по 40 мкл буфера для трипсинолиза, затем к каждой пробе добавляли раствор трипсина в соотношении: общая масса фермента/общая масса белка 1/100 и инкубировали в течение ночи при температуре 37°C. Затем добавляли трипсин в соотношении: общая масса фермента/общая масса белка 1/100 и инкубировали 2 ч при температуре 37°C. Для получения раствора пептидов пробы центрифугировали при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. Фильтры промывали раствором 30%-ной муравьиной кислоты c помощью центрифугирования при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. Полученную смесь пептидов высушивали на центрифужном концентраторе, перерастворяли в 100 мкл 5%-ной муравьиной кислоты и подвергали дальнейшему масс-спектрометрическому анализу.
Хроматографическое разделение. Пептиды загружали на обогащающую колонку Zorbax 300SB-C18, диаметр частиц 5 мкм, 5 мм×0,3мм (Agilent Technologies), и промывали подвижной фазой для загрузки и промывки обогащающей колонки (5%-ный раствор ацетонитрила в 0,1%-ной муравьиной кислоте и 0,05%-ной трифторуксусной кислоте) при скорости потока 3 мкл/мин в течение 5 мин. Пептиды разделяли на аналитической колонке Zorbax 300SB-C18, диаметр частиц 3,5 мкм, 150 мм×75 мкм, в градиенте подвижной фазы В (80%-ный раствор ацетонитрила в 0,1%-ной муравьиной кислоте) при скорости потока 0,3 мкл/мин. Использовали в зависимости от эксперимента следующие градиенты ацетонитрила:
аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В в течение 5 мин, после чего линейно увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 60% в течение 80 мин, в течение 5 мин увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 100%, в течение 10 мин промывали аналитическую колонку 100%-ной подвижной фазой В, в течение 5 мин уменьшали концентрацию подвижной фазы B до 5%, в течение 15 мин аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В;
аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В в течение 10 мин, после чего линейно увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 60% в течение 190 мин, в течение 5 мин увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 100%, в течение 10 мин промывали аналитическую колонку 100%-ной подвижной фазой В, в течение 5 мин уменьшали концентрацию подвижной фазы B до 5%, в течение 20 мин аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В.
Масс-спектрометрическая регистрация. Для получения MC-скана с разрешением 30000 (для m/z=400), в диапазоне величин m/z=300–2000, в режиме положительной ионизации, использовали масс-анализатор типа Орбитреп (OrbitrapVelos ThermoFisherScientific, Bremen). Пять наиболее интенсивных ионов, зарегистрированных в МС-скане, выбирали для последующей фрагментации, если их абсолютная интенсивность превышала 5000 единиц. В зависимости от метода использовали либо HCD-тип фрагментации с нормализованной энергией соударения 35%, либо CID-тип фрагментации с нормализованной энергией соударения 35%. Применяли динамическое исключение: длительность исключения составляла 60 с после того, как ион хотя бы один раз был фрагментирован с получением MC/MC-спектра. Размер списка исключения составлял 500 ионов. Для получения МС/МС-скана с разрешением 7500 (для m/z=400) в диапазоне величин m/z=300–2000, в режиме положительной ионизации, использовали масс-анализатор типа Орбитрэп или линейную ионную ловушку.
Поиск в программе Mascot. Экспериментальные файлы конвертировали в формат Mascotgeneric, поиск проводили относительно базы данных SwissProt таксономическим ограничением для вида Homo Sapiens, толерантность для пептидных ионов составила 20 ppm, для фрагментарных ионов – 0,1 Da, в качестве фиксированной модификации выбрано карбамидометилирование цистеина, в качестве вариабельной модификации – окисленный метионин. Параллельный поиск проводили по базе данных инвертированных и рандомных последовательностей аминокислот (decoy).
Относительный количественный анализ в программном обеспечении Progenesis LC/MS. Экспериментальные файлы загружали в программное обеспечение Progenesis LC/MS, относительно выбранного референсного файла проводили выравнивание, детекцию и фильтрацию MС-пиков. Получали список пиков (features) с определенной величиной m/z, интенсивностью и площадью под пиком. Создавали дизайн эксперимента, объединяли данные, соответствующие временным точкам 0 ч, 3 ч, 24 ч и 96 ч. МС/МС-спектры, соответствующие детектированным пикам, загружали в программу Mascot и проводили поиск идентификаций белков. Результат поиска загружали в программу Progenesis LC/MS, в конечном итоге получали список белков с измененной экспрессией.
Результаты и обсуждение
Экстракцию белков из образцов клеток линии HL60, соответствующих временным точкам 0 ч, 3 ч, 24 ч и 96 ч, провели для последующего трипсинолиза в растворе с использованием дезоксихолата натрия (DOC) и для последующего трипсинолиза на мембранных фильтрах с использованием додецилсульфата натрия (SDS). После экстракции белков из каждой пробы клеток линии HL60 определили их концентрацию спектрофотометрическим методом с использованием BCA (табл.1). В таблице указаны средние значения с доверительным интервалом (доверительная вероятность 95%), рассчитанные по результатам трех независимых измерений для каждой временной точки.
Как видно из табл.1, наибольшая концентрация общего белка получена после экстракции с использованием SDS. Для пробы белка после экстрации с DOC, соответствующей временной точке 96 ч, проведен гидролиз в растворе. Для пробы белка после экстрации с SDS, соответствующей временной точке 96 ч, проведен гидролиз с использованием мембранных фильтров, пропускающих массы меньше 30 кДа. В результате получены две смеси пептидов, для каждой из них провели четыре хромато-масс-спектрометрических эксперимента (по пять технических повторов в каждом) на приборе Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific, Bremen), соединенном с хроматографической системой Agilent 1200 HPLC, в нанопотоковом режиме с различными условиями градиента, энергией фрагментации и типом масс-спектрометрического детектора. Условия проведенных экспериментов приведены в табл.2.
В результате проведенных экспериментов получили 40 файлов в формате .raw, которые конвертировали в формат .mgf, и выполнили поиск для идентификации белков по экспериментальным MS2 спектрам с помощью программного обеспечения Mascot, по базе данных SwissProt для биологического вида HomoSapiens.
Для определения оптимального хромато-масс-спектрометрического метода оценивали такие параметры, как количество обработанных MS2 спектров, идентифицированных пептидов, идентифицированных белков, процент ложноположительных результатов (false discovery rate). В табл.3 приведены результаты идентификаций по Mascot MS2-спектров, полученных в результате экспериментов, проведенных с продуктами гидролиза в растворе и с продуктами гидролиза на фильтрах. Указаны средние значения для оцениваемых параметров поиска по Mascot, рассчитанные по результатам пяти независимых технических повторов.
Как видно из табл.3, наибольшие показатели для количества обработанных MS2-спектров, идентифицированных пептидов и белков, а также приемлемое значение для процента ложноположительных результатов (< 2%) соответствуют комбинации следующих условий эксперимента: лизис клеток и экстракция белков с использованием SDS, ферментативный гидролиз на фильтрах, градиент ацетонитрила в течение 240 мин, HCD-тип энергии фрагментации, тип анализатора – орбитальная ионная ловушка.
Для проб белка после лизиса и экстрации белков с SDS, соответствующих временным точкам 0 ч, 3 ч, 24 ч и 96 ч, провели ферментативный гидролиз с использованием мембранных фильтров, пропускающих массы меньше 30 кДа. Для полученных гидролизатов провели хромато-масс-спектрометрический эксперимент на приборе Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific, Bremen), сопряженном с хроматографической системой Agilent 1200 HPLC, в нанопотоковом режиме, используя градиент ацетонитрила в течение 240 мин, HCD-тип энергии фрагментации, тип анализатора – орбитальная ионная ловушка в пяти технических повторах. В результате получили 20 файлов в формате .raw, которые обработали с помощью программного обеспечения Progenesis. Относительный количественный анализ позволил выявить 111663 пептидных иона, для которых получили 386460 MS2-спектров. По результатам поиска с использованием Mascot по данным спектрам идентифицировали 2512 белков. Среди них оказалось 11, 95, 560 белков, для которых наблюдалось стати.стически значимое изменение содержания в пробе более чем в два раза (p-value < 0,01) во временных точках 3 ч, 24 ч, 96 ч, соответственно по сравнению с контролем (временная точка 0 ч) после добавления индуктора дифференцировки.
Заключение
Практический выход протеомики для медицины – использование белков для диагностики заболеваний. Изучение структуры и функций белка позволит диагностировать и искать подходы для борьбы с социально значимыми заболеваниями. Две основные задачи, поставленные перед протеомным анализом, – это каталогизация всех белков, синтезируемых различными типами клеток, и составление схем связей между повышением или понижением уровня синтеза белков и происходящими в организме процессами. Для решения этих задач необходима разработка и применение эффективных методов пробоподготовки к протеомному анализу, а также поиск подходов к количественному измерению белков. По итогам проделанной работы выбраны условия для пробоподготовки и хромато-масс-спектрометрического анализа с целью получения наибольшего количества идентификаций белков, что обеспечивает большую глубину качественного протеомного анализа.
Относительный количественный анализ идентифицированных белков без использования изотопных меток позволяет легко и быстро проводить сравнение содержания белков, соответствующих биологическим образцам в различных состояниях: норма/патология, различные стадии дифференцировки, до/после введения лекарственного вещества.
Литература
1. Fischer F., Wolters D., Ro¨gner M.and Poetsch A. Toward the complete membrane proteome: high coverage of integral membrane proteins through transmembrane peptide detection. – Molecular & Cellular Proteomics, 2006, Mar, v.5(3), р.444–453.
2. From Cells to Peptides:“One-Stop”Integrated Proteomic Processing Using AmphipolsZhibinNing, DeepteeSeebun, Brett Hawley, Cheng-Kang Chiang, and Daniel Figeys dx.doi.org/10.1021/pr301064z|. – Journalof Proteome Research, 2013, v.12, p.1512−1519.
3. Proc L.J. A quantitative studyof the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. – J. Proteome Research, 2010, v.9(10),p.5422–5437.
4. Wisniewski J.R. et al. Universal sample preparation method for proteome analysis. – Nature Methods, 2009, v.6(5), р.359–62.
5. Jacek R. Wis´niewski, Pawel Ostasiewicz, Kamila Dus´, Dorota F. Zielin´ska, Florian Gnad and Matthias Mann. Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma. – Molecular Systems Biology, 2012, v.8, p.611.
6. Granvogl B., Plöscher M., Eichacker L.A. Sample preparation by in-gel digestion for mass spectrometry-based proteomics. – Analytics andBioanalyticsChemistry, 2007, Oct, v.389(4), p.991–1002.
7. Medzhradszky K.F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. – Methods in Enzymology, 2005, v.405, p.50–65.
8. Hun J.C., Hun G.Y. A procedure for quantitative determination of tris(2-carboxyethyl)phosphine, an odorless reducing agent more stable and effective than dithiothreitol. – Analytical Biochemistry, 1994, Jul, v.220(1), p.5–10.
9. Glatter T. et al. Large-scale quantitative assessment of different in-solution protein digestion protocols reveals superior cleavage efficiency of tandem Lys-C/Trypsin proteolysis over trypsin digestion. – Journal of Proteome Research, 2012, v.11(11), p.5145–5156.
10. Frese C.K. et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD, ETD on an LTQ-OrbitrapVelos. – Journal of Proteome Research, 2011, v.10, p.2377–2388.
11. Michalski A., Neuhauser N., Cox J., Mann M. A systematic investigation into the nature of tryptic HCD spectra. – Journal of Proteome Research, 2012 v.11(11), p.5479–5491.
Для экстракции основную сложность представляют мембранные белки, составляющие около 30% от всех белков клетки [1]. Для перевода мембранных белков в раствор хорошо подходит использование детергентов: додецил сульфата натрия (SDS) и дезоксихолата натрия (DOC) [2]. Однако применение детергентов, в особенности ионных, сильно интерферирует с масс-спектрометрическим анализом, поэтому их надо удалить из реакционной смеси. При этом небольшие концентрации дезоксихолата натрия повышают денатурацию белковых молекул и не влияют на активность трипсина. DOC можно удалить из реакционной смеси путем приципитации в кислых условиях при -20⁰С[3].
Использование SDS при экстракции белков для последующего масс-спектрометрического анализа стало возможным после разработки протокола гидролиза с использованием концентрирующих фильтров (FASP-протокол) [4]. Благодаря проведению многократных промывок раствором мочевины SDS удаляется из пробы. FASP-протокол позволил экстрагировать белки для масс-спектрометрического анализа из таких образцов, как парафинизированные препараты опухолевых тканей [5].
Ферментативное расщепление белков можно проводить в растворе или с использованием твердой фазы, например, в полиакриламидном геле или, как уже упоминалось, с использованием концентрирующих фильтров [6, 7]. При проведении гидролиза в растворе пробоподготовка проходит от начала до конца в одной пробирке, что уменьшает потери, возможные при переносе биологического материала. В твердой фазе денатурация белков максимальна, и для экстракции белков можно также применять SDS. В процессе гидролиза очень важно денатурировать белковые молекулы, чтобы сделать сайты узнавания фермента максимально доступными. Для этого широко применяют хаотропы (мочевину, тиомочевину, гуанидина хлорид), но пробы с мочевиной нельзя сильно нагревать из-за риска модификации лизина, приводящей к появлению пропущенных сайтов гидролиза в пептидах. Однако повышенные температуры важны для восстановления дисульфидных связей с использованием дитиотреэтола (ДТТ) и/или трис-(2 карбоксиэтил) фосфина (TCEP) [8]. К тому же сериновая протеаза трипсин – наиболее часто используемый фермент для гидролитического расщепления белков – может снижать свою активность в присутствии высоких концентраций хаотропов, в частности, мочевины. Поэтому необходимо либо снижать концентрацию хаотропа, либо удалять его из реакционной смеси. Тандемное использование нескольких ферментов, например, комбинации лизина С и трипсина, увеличивает эффективность гидролиза [9].
Успешная идентификация пептидов и белков во многом зависит от качества получаемого спектра фрагментации пептида. Вид спектра и тип преобладающих фрагментарных ионов может различаться в зависимости от применяемого типа фрагментации. Наиболее часто используются для тандемного масс-спектрометрического анализа два типа фрагментации: фрагментация, индуцированная столкновением (CID), и высокоэнергетическая фрагментация, индуцированная столкновением (HCD). При этом выявлено, что HCD-тип фрагментации наиболее эффективен для двух- и трехзарядных пептидных ионов, представляющих собой наиболее информативный спектр пептидов, содержащихся в гидролизате [10, 11].
Оптимальная пробоподготовка и хромато-масс-спектрометрический метод, позволяющий получить наиболее полное представление о качественном составе протеома, необходимы при оценке количественных изменений белков. В случае исследования состояния нормы и патологии у пациентов установление большого количества белков с измененной экспрессией позволяет в дальнейшем проводить биоинформационную обработку данных, чтобы определить сигнальные пути, вероятно, вовлеченные в развитие заболевания.
Количественный масс-спектрометрический анализ проводят либо с применением стабильных изотопных меток, либо используют безметковый подход. Абсолютный количественный анализ, использующий стабильные изотопные метки, позволяет с высокой точностью определить концентрацию белков в биологическом образце, однако применение меченых стандартов – дорогостоящий метод. Безметковый количественный анализ основан на сравнении площади под пиками зарегистрированных пептидных ионов или на подсчете числа снятых спектров для пептида. Для безметкового подхода требуется высокопроизводительный ЖХ/МС анализ и тщательное выравнивание хроматографических пиков. Этот подход обеспечивает быстрый и дешевый количественный анализ.
Цель работы – подбор условий для пробоподготовки, включая экстракцию белков и их ферментативный гидролиз, а также подбор хромато-масс-спектрометрических условий для получения наибольшего количества идентификаций белков клеток линии HL60 (клетки острого промиелоцитарного лейкоза). Подобранные условия использовались для масс-спектрометрического анализа белков клеток линии HL60 в разных временных точках после добавления индуктора дифференцировки – трансретиноевой кислоты с последующим относительным количественным анализом полученных данных с помощью программного обеспечения Progenesis LC/MS.
Экспериментальные методы
Экстракция белка c использованием дезоксихолата натрия. К осадку клеток HL60, содержащему 109 клеток, добавляли по 150 мкл лизирующего буфера, содержащего 3% дезоксихолата натрия (DOC), 75 мМ TrisHCl, pH=7,6. Затем пробы инкубировали во льду в течение 20 мин, после чего подвергали обработке ультразвуком, шесть циклов с интенсивностью 30%. Далее пробы центрифугировали 20 мин со скоростью 7000 об./мин, супернатант отбирали, а к осадку добавляли еще по 100 мкл лизирующего буфера и повторяли процедуры сонификации и центрифугирования. Конечный объем полученного раствора белка составлял 250 мкл. Затем измеряли концентрацию белка в каждой пробе с использованием бицинхониновой кислоты (BCA).
Экстракция белка c использованием додецилсульфата натрия. К осадку клеток HL60, содержащему 109 клеток, добавляли по 250 мкл лизирующего буфера, содержащего 4% додецилсульфат натрия (SDS), 75 мМ TrisHCl, pH=7,6, инкубировали в течение 1 ч при температуре 96°С и встряхивании 600 об./мин, затем измеряли концентрацию белка в каждой пробе с помощью BCA.
Измерение концентрации белков с использованием BCA. Для построения калибровочной кривой выбирали следующие точки, соответствующие количеству белка-стандарта бычьего сывороточного альбумина (BSA), разведенному в 30 мкл ddH2O: 2 мкг, 5 мкг, 10 мкг, 25 мкг, 50 мкг. Каждую измеряемую пробу белка объемом 2 мкл разводили в 28 мкл деионизированной воды (ddH2O). К каждой пробе стандарта, измеряемым пробам и контрольной пробе (30 мкл ddH2O) добавляли по 1 мл реагента A и 20 мкл реагента B, перемешивали и инкубировали в течение 20 мин при температуре 56°С со скоростью перемешивания 300 об./мин в термомиксере ThermomixerComfort (Eppendorf). Затем пробы остужали до комнатной температуры и проводили измерение оптической плотности при длине волны 562 нм с помощью спектрофотометра NanoDrop-1000 (Thermo Fisher Scientific) с программным обеспечением ND-1000 v.3.5.1.
Гидролитическое расщепление белков в растворе. Для восстановления дисульфидных связей в белковых молекулах к пробам белков, полученных в результате экстракции с использованием дезоксихолиевой кислоты, содержащих 100 мкг белка, добавляли денатурирующий буфер, содержащий 12 мМ натриевой соли дезоксихолиевой кислоты, 2 M тиомочевины, 2,5 мМ ЭДТА, 75 мМ Tris-HCl, 87 мМ ДТТ и 6,7 мМ ТСЕР, pH=8,5 в соотношении 1:1 (об/об), тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 42⁰С в течение 60 мин. По окончании процедуры восстановления дисульфидов к каждой пробе добавляли алкилирующий раствор, содержащий 12 мМ натриевой соли дезоксихолиевой кислоты, 2 M тиомочевины, 2,5 мМ ЭДТА, 75 мМ Tris-HCl, 450 мМ 4-винилпиридин, pH=8,5 в соотношении: объем алкилирующего раствора/объем пробы 1/12 и тщательно перемешивали. Реакционную смесь инкубировали в течение 45–60 мин при комнатной температуре в недоступном для дневного света месте.
После восстановления и алкилирования дисульфидов каждую пробу доводили до объема 100 мкл буфером для трипсинолиза, содержащим 42 мМ триэтиламмония бикарбонат, pH=8,5 с последующим ферментативным расщеплением в следующих условиях: добавляли трипсин в соотношении массы трипсина к массе тотального белка 1/100 и затем инкубировали в течение 2 ч при температуре 44°C, через 2 ч повторно добавляли аликвоту трипсина в соотношении массы трипсина к массе белка 1/100 и затем инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°C. Трипсинолиз останавливали добавлением 100% муравьиной кислоты в каждую пробу до конечной концентрации 5%. Инкубировали при температуре -20°C 30 мин, затем центрифугировали при 10000 об./мин – 15 мин. Супернатант отбирали и подвергали дальнейшему масс-спектрометрическому анализу.
Гидролитическое расщепление белков с помощью концентрирующих фильтров. Полученные в результате экстракции с использованием додецилсульфата натрия пробы белков, содержащих 100 мкг общего белка, помещали в концентрирующие фильтры Microcondevices YM-30. Пробы промывали путем добавления 200 мкл буфера, содержащего 8 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, pH =8,5 с последующим центрифугированием при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. Процедуру промывки повторяли три раза. К пробам в концентрирующих фильтрах добавляли 100 мкл алкилирующего раствора, инкубировали при температуре 25°C в течение 30 мин и встряхиванием 600 об./мин, после чего центрифугировали при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. После алкилирования пробы дважды промывали 200 мкл буфера, содержащего 8 М мочевины, 100 мМ Tris-HCl, pH =8,5 с помощью центрифугирования при 2,5 Kg в течение 40 мин при температуре 20°C. К пробам в концентрирующих фильтрах добавляли по 40 мкл буфера для трипсинолиза, затем к каждой пробе добавляли раствор трипсина в соотношении: общая масса фермента/общая масса белка 1/100 и инкубировали в течение ночи при температуре 37°C. Затем добавляли трипсин в соотношении: общая масса фермента/общая масса белка 1/100 и инкубировали 2 ч при температуре 37°C. Для получения раствора пептидов пробы центрифугировали при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. Фильтры промывали раствором 30%-ной муравьиной кислоты c помощью центрифугирования при 5 Kg в течение 15 мин в термостатируемой центрифуге при температуре 20°C. Полученную смесь пептидов высушивали на центрифужном концентраторе, перерастворяли в 100 мкл 5%-ной муравьиной кислоты и подвергали дальнейшему масс-спектрометрическому анализу.
Хроматографическое разделение. Пептиды загружали на обогащающую колонку Zorbax 300SB-C18, диаметр частиц 5 мкм, 5 мм×0,3мм (Agilent Technologies), и промывали подвижной фазой для загрузки и промывки обогащающей колонки (5%-ный раствор ацетонитрила в 0,1%-ной муравьиной кислоте и 0,05%-ной трифторуксусной кислоте) при скорости потока 3 мкл/мин в течение 5 мин. Пептиды разделяли на аналитической колонке Zorbax 300SB-C18, диаметр частиц 3,5 мкм, 150 мм×75 мкм, в градиенте подвижной фазы В (80%-ный раствор ацетонитрила в 0,1%-ной муравьиной кислоте) при скорости потока 0,3 мкл/мин. Использовали в зависимости от эксперимента следующие градиенты ацетонитрила:
аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В в течение 5 мин, после чего линейно увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 60% в течение 80 мин, в течение 5 мин увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 100%, в течение 10 мин промывали аналитическую колонку 100%-ной подвижной фазой В, в течение 5 мин уменьшали концентрацию подвижной фазы B до 5%, в течение 15 мин аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В;
аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В в течение 10 мин, после чего линейно увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 60% в течение 190 мин, в течение 5 мин увеличивали концентрацию подвижной фазы B до 100%, в течение 10 мин промывали аналитическую колонку 100%-ной подвижной фазой В, в течение 5 мин уменьшали концентрацию подвижной фазы B до 5%, в течение 20 мин аналитическую колонку промывали подвижной 5%-ной фазой В.
Масс-спектрометрическая регистрация. Для получения MC-скана с разрешением 30000 (для m/z=400), в диапазоне величин m/z=300–2000, в режиме положительной ионизации, использовали масс-анализатор типа Орбитреп (OrbitrapVelos ThermoFisherScientific, Bremen). Пять наиболее интенсивных ионов, зарегистрированных в МС-скане, выбирали для последующей фрагментации, если их абсолютная интенсивность превышала 5000 единиц. В зависимости от метода использовали либо HCD-тип фрагментации с нормализованной энергией соударения 35%, либо CID-тип фрагментации с нормализованной энергией соударения 35%. Применяли динамическое исключение: длительность исключения составляла 60 с после того, как ион хотя бы один раз был фрагментирован с получением MC/MC-спектра. Размер списка исключения составлял 500 ионов. Для получения МС/МС-скана с разрешением 7500 (для m/z=400) в диапазоне величин m/z=300–2000, в режиме положительной ионизации, использовали масс-анализатор типа Орбитрэп или линейную ионную ловушку.
Поиск в программе Mascot. Экспериментальные файлы конвертировали в формат Mascotgeneric, поиск проводили относительно базы данных SwissProt таксономическим ограничением для вида Homo Sapiens, толерантность для пептидных ионов составила 20 ppm, для фрагментарных ионов – 0,1 Da, в качестве фиксированной модификации выбрано карбамидометилирование цистеина, в качестве вариабельной модификации – окисленный метионин. Параллельный поиск проводили по базе данных инвертированных и рандомных последовательностей аминокислот (decoy).
Относительный количественный анализ в программном обеспечении Progenesis LC/MS. Экспериментальные файлы загружали в программное обеспечение Progenesis LC/MS, относительно выбранного референсного файла проводили выравнивание, детекцию и фильтрацию MС-пиков. Получали список пиков (features) с определенной величиной m/z, интенсивностью и площадью под пиком. Создавали дизайн эксперимента, объединяли данные, соответствующие временным точкам 0 ч, 3 ч, 24 ч и 96 ч. МС/МС-спектры, соответствующие детектированным пикам, загружали в программу Mascot и проводили поиск идентификаций белков. Результат поиска загружали в программу Progenesis LC/MS, в конечном итоге получали список белков с измененной экспрессией.
Результаты и обсуждение
Экстракцию белков из образцов клеток линии HL60, соответствующих временным точкам 0 ч, 3 ч, 24 ч и 96 ч, провели для последующего трипсинолиза в растворе с использованием дезоксихолата натрия (DOC) и для последующего трипсинолиза на мембранных фильтрах с использованием додецилсульфата натрия (SDS). После экстракции белков из каждой пробы клеток линии HL60 определили их концентрацию спектрофотометрическим методом с использованием BCA (табл.1). В таблице указаны средние значения с доверительным интервалом (доверительная вероятность 95%), рассчитанные по результатам трех независимых измерений для каждой временной точки.
Как видно из табл.1, наибольшая концентрация общего белка получена после экстракции с использованием SDS. Для пробы белка после экстрации с DOC, соответствующей временной точке 96 ч, проведен гидролиз в растворе. Для пробы белка после экстрации с SDS, соответствующей временной точке 96 ч, проведен гидролиз с использованием мембранных фильтров, пропускающих массы меньше 30 кДа. В результате получены две смеси пептидов, для каждой из них провели четыре хромато-масс-спектрометрических эксперимента (по пять технических повторов в каждом) на приборе Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific, Bremen), соединенном с хроматографической системой Agilent 1200 HPLC, в нанопотоковом режиме с различными условиями градиента, энергией фрагментации и типом масс-спектрометрического детектора. Условия проведенных экспериментов приведены в табл.2.
В результате проведенных экспериментов получили 40 файлов в формате .raw, которые конвертировали в формат .mgf, и выполнили поиск для идентификации белков по экспериментальным MS2 спектрам с помощью программного обеспечения Mascot, по базе данных SwissProt для биологического вида HomoSapiens.
Для определения оптимального хромато-масс-спектрометрического метода оценивали такие параметры, как количество обработанных MS2 спектров, идентифицированных пептидов, идентифицированных белков, процент ложноположительных результатов (false discovery rate). В табл.3 приведены результаты идентификаций по Mascot MS2-спектров, полученных в результате экспериментов, проведенных с продуктами гидролиза в растворе и с продуктами гидролиза на фильтрах. Указаны средние значения для оцениваемых параметров поиска по Mascot, рассчитанные по результатам пяти независимых технических повторов.
Как видно из табл.3, наибольшие показатели для количества обработанных MS2-спектров, идентифицированных пептидов и белков, а также приемлемое значение для процента ложноположительных результатов (< 2%) соответствуют комбинации следующих условий эксперимента: лизис клеток и экстракция белков с использованием SDS, ферментативный гидролиз на фильтрах, градиент ацетонитрила в течение 240 мин, HCD-тип энергии фрагментации, тип анализатора – орбитальная ионная ловушка.
Для проб белка после лизиса и экстрации белков с SDS, соответствующих временным точкам 0 ч, 3 ч, 24 ч и 96 ч, провели ферментативный гидролиз с использованием мембранных фильтров, пропускающих массы меньше 30 кДа. Для полученных гидролизатов провели хромато-масс-спектрометрический эксперимент на приборе Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific, Bremen), сопряженном с хроматографической системой Agilent 1200 HPLC, в нанопотоковом режиме, используя градиент ацетонитрила в течение 240 мин, HCD-тип энергии фрагментации, тип анализатора – орбитальная ионная ловушка в пяти технических повторах. В результате получили 20 файлов в формате .raw, которые обработали с помощью программного обеспечения Progenesis. Относительный количественный анализ позволил выявить 111663 пептидных иона, для которых получили 386460 MS2-спектров. По результатам поиска с использованием Mascot по данным спектрам идентифицировали 2512 белков. Среди них оказалось 11, 95, 560 белков, для которых наблюдалось стати.стически значимое изменение содержания в пробе более чем в два раза (p-value < 0,01) во временных точках 3 ч, 24 ч, 96 ч, соответственно по сравнению с контролем (временная точка 0 ч) после добавления индуктора дифференцировки.
Заключение
Практический выход протеомики для медицины – использование белков для диагностики заболеваний. Изучение структуры и функций белка позволит диагностировать и искать подходы для борьбы с социально значимыми заболеваниями. Две основные задачи, поставленные перед протеомным анализом, – это каталогизация всех белков, синтезируемых различными типами клеток, и составление схем связей между повышением или понижением уровня синтеза белков и происходящими в организме процессами. Для решения этих задач необходима разработка и применение эффективных методов пробоподготовки к протеомному анализу, а также поиск подходов к количественному измерению белков. По итогам проделанной работы выбраны условия для пробоподготовки и хромато-масс-спектрометрического анализа с целью получения наибольшего количества идентификаций белков, что обеспечивает большую глубину качественного протеомного анализа.
Относительный количественный анализ идентифицированных белков без использования изотопных меток позволяет легко и быстро проводить сравнение содержания белков, соответствующих биологическим образцам в различных состояниях: норма/патология, различные стадии дифференцировки, до/после введения лекарственного вещества.
Литература
1. Fischer F., Wolters D., Ro¨gner M.and Poetsch A. Toward the complete membrane proteome: high coverage of integral membrane proteins through transmembrane peptide detection. – Molecular & Cellular Proteomics, 2006, Mar, v.5(3), р.444–453.
2. From Cells to Peptides:“One-Stop”Integrated Proteomic Processing Using AmphipolsZhibinNing, DeepteeSeebun, Brett Hawley, Cheng-Kang Chiang, and Daniel Figeys dx.doi.org/10.1021/pr301064z|. – Journalof Proteome Research, 2013, v.12, p.1512−1519.
3. Proc L.J. A quantitative studyof the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. – J. Proteome Research, 2010, v.9(10),p.5422–5437.
4. Wisniewski J.R. et al. Universal sample preparation method for proteome analysis. – Nature Methods, 2009, v.6(5), р.359–62.
5. Jacek R. Wis´niewski, Pawel Ostasiewicz, Kamila Dus´, Dorota F. Zielin´ska, Florian Gnad and Matthias Mann. Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma. – Molecular Systems Biology, 2012, v.8, p.611.
6. Granvogl B., Plöscher M., Eichacker L.A. Sample preparation by in-gel digestion for mass spectrometry-based proteomics. – Analytics andBioanalyticsChemistry, 2007, Oct, v.389(4), p.991–1002.
7. Medzhradszky K.F. In-solution digestion of proteins for mass spectrometry. – Methods in Enzymology, 2005, v.405, p.50–65.
8. Hun J.C., Hun G.Y. A procedure for quantitative determination of tris(2-carboxyethyl)phosphine, an odorless reducing agent more stable and effective than dithiothreitol. – Analytical Biochemistry, 1994, Jul, v.220(1), p.5–10.
9. Glatter T. et al. Large-scale quantitative assessment of different in-solution protein digestion protocols reveals superior cleavage efficiency of tandem Lys-C/Trypsin proteolysis over trypsin digestion. – Journal of Proteome Research, 2012, v.11(11), p.5145–5156.
10. Frese C.K. et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD, ETD on an LTQ-OrbitrapVelos. – Journal of Proteome Research, 2011, v.10, p.2377–2388.
11. Michalski A., Neuhauser N., Cox J., Mann M. A systematic investigation into the nature of tryptic HCD spectra. – Journal of Proteome Research, 2012 v.11(11), p.5479–5491.
Отзывы читателей
