eng
Выпуск #4/2013
В.Васильев, А.Мальцев, А.Винокуров
Инструментальный предел обнаружения систем ГХ/МС: практика применения для хромато-масс-спектрометров СКБ "Хроматэк"
Инструментальный предел обнаружения систем ГХ/МС: практика применения для хромато-масс-спектрометров СКБ "Хроматэк"
Просмотры: 3550
Вопросы определения инструментального предела обнаружения хромато-масс-спектрометров (Instrument Detection Limit - IDL) и сравнения его с отношением амплитуды сигнала к шуму (Signal-to-Noise Ratio, S/N или SNR) уже достаточно хорошо освещены в литературе. В статье рассмотрены практические аспекты применения оценки чувствительности IDL при выпуске из производства хромато-масс-спектрометров в СКБ "Хроматэк", Йошкар-Ола. Обсуждены способы оценки IDL в различных режимах, а также достоинства и недостатки применения нового метода.
Теги: instrumental detection limit (idl) mass-spectrometer sensitivity evaluation signal to noise ratio (snr) инструментальный предел обнаружения определение чувствительности отношение сигнал/шум хромато-масс-спектрометр
Обоснование перехода на IDL
За последние десятилетия методы оценки чувствительности хромато-масс-спектрометров претерпели значительные изменения. Четверть века назад для регистрации сигнала использовались самописцы, а для измерения его амплитуды – линейка. Величина шума определялась как разница между максимальным и минимальным значением сигнала базовой линии в течение 60 с непосредственно перед анализируемым пиком.
По мере совершенствования техники и замены самописцев компьютерами менялся и сам подход к определению отношения сигнал/шум. Появилась возможность автоматического поиска участка масс-хроматограммы с минимальным шумом, а в качестве величины шума при вычислении отношения сигнала к шуму стали использовать стандартное отклонение (standard deviation, SD) амплитуды шума. Величину SNR стали рассчитывать как отношение разности амплитуды пика и среднего значения базовой линии к стандартному отклонению шума.
В качестве примера на рис. 2 приведена масс-хроматограмма для m/z от 271,5 до 272,5, полученная при вводе 1 мкл раствора октафторнафталина (ОФН) с концентрацией 1 пг/мкл, в режиме полного сканирования в диапазоне масс от 50 до 300 а.е.м. на масс-спектрометрическом детекторе (МСД) "Хроматэк" с хроматографом "Хроматэк-Кристалл 5000" (см. рис.1). В зависимости от выбранного участка шума (1, 2 или 3), величина SNR различается почти в 2 раза: так, для первого участка SNR1=135, для второго участка SNR2=95, для третьего участка SNR3=76. Безусловно, программными методами участок 1 с наименьшим уровнем шума всегда будет найден и, соответственно, вычислено наибольшее значение SNR1=135.
В условиях все возрастающей конкуренции на рынке хромато-масс-спектрометров в 2008-2009 годах ведущими зарубежными производителями оборудования предложен модифицированный метод вычисления SNR, который давал значительное увеличение SNR без каких-либо существенных технических усовершенствований самой ГХ/МС-системы. По этому методу для построения масс-хроматограммы вместо диапазона m/z шириной 1 а.е.м. стал использоваться диапазон шириной 0,1 а.е.м. При этом из большого числа таких диапазонов вблизи массы анализируемого иона, программными методами определялся диапазон, в котором значение SNR было бы максимальным. Таким образом, значительная часть шумов оставалась "за кадром", и величина SNR резко повышалась. Для наглядности на рис.3 приведена та же масс-хроматограмма, что и на рис.2, но построенная для диапазона m/z шириной 0,1 а.е.м. от 271,85 до 271,95 а.е.м. с наименьшим уровнем шума. Как видно из рисунка, амплитуда пика ОФН та же самая, а уровень шума резко упал. Поэтому для первого участка SNR1=1756, а для второго участка SNR2=126.
Получение максимального SNR путем снижения шума стало целью производителей квадрупольных и других масс-спектрометров. Кроме того, за последнее десятилетие значительно выросло количество масс-спектрометров с тройным квадруполем и высокого разрешения, по принципу своей работы практически не дающих шума базовой линии. Однако уменьшение шума почти до нулевого уровня привело к сложностям в оценке чувствительности прибора.
Из приведенных выше масс-хроматограмм видно, что с уменьшением шума базовой линии увеличивается разброс величины стандартного отклонения шума SD (зависящей от выбранного участка масс-хроматограммы) и, следовательно, разброс SNR. При практически нулевом шуме базовой линии значение SNR для одного и того же прибора, в одних и тех же условиях может отличаться в сотни раз. Это справедливо как для отдельно взятой масс-хроматограммы, так и для нескольких масс-хроматограмм, снятых на одном приборе: чем меньше шум, тем больше разброс значений SNR между анализами. Очевидно, что в этом случае аналитик не имеет практического представления о чувствительности прибора.
Таким образом, возникла необходимость в применении универсального критерия для оценки чувствительности всех типов и режимов работы ГХ/МС, в качестве которого компания Agilent предложила статистический параметр – инструментальный предел обнаружения [1], а остальные производители его поддержали. И теперь уже ни одна спецификация квадрупольного хромато-масс-спектрометра не обходится без указания этой характеристики.
Вполне естественно, что мы, ориентируясь на лучшие зарубежные достижения, при разработке и производстве своего масс-спектрометрического (или по терминологии компании Agilent – масс-селективного детектора - МСД), прошли все исторические шаги по определению SNR, сделанные мировыми производителями. Поэтому каждая новая методика оценки чувствительности проверялась нами на МСД нашего производства.
В настоящий момент мы обязательно контролируем SNR как в диапазоне 1 а.е.м. (не менее 100:1), так и в диапазоне 0,1 а.е.м. (не менее 1000:1) без применения какой бы то ни было аппаратной и программной фильтрации. По нашему опыту соответствие последнему критерию не всегда дает гарантию хорошей чувствительности и отсутствия загрязнений МСД, а вот предыдущий, многократно проверенный, критерий (диапазон 1 а.е.м., SNR не менее 100:1) практически всегда работает, так как по своей сути - это интегральный критерий. Кроме того, мы постоянно сравниваем полученные результаты с результатами обсчета наших данных в программах Xcalibur и ChemStation.
После появления в начале 2013 года информации о применении статистического IDL в качестве универсального критерия оценки чувствительности квадрупольных хромато-масс-спектрометров, в СКБ "Хроматэк" была проведена серия испытаний своих ГХ/МС с целью определения IDL. В результате получены значения IDL от 5,5 до 8,7 фг, что соответствует чувствительности лучших зарубежных хромато-масс-спектрометров.
Остановимся подробнее на методике измерения и полученных результатах.
Методика измерения
За основу оценки IDL взят метод, изложенный в [2] со следующими параметрами и уточнениями:
число анализов (измерений) в серии n=8;
способ ввода тестового вещества - с помощью автосамплера;
тестовое вещество – октафторнафталин (ОФН) с концентрацией 100 фг/мкл;
объем вводимой пробы тестового вещества - 1 мкл (режим ввода – "сэндвич");
инструментальный предел обнаружения IDLS в единицах площади пика рассчитывается по формуле:
IDLS= tα,n-1 · σ,
где: tα,n-1 = 2,998 – коэффициент Стьюдента для 99% (α=0,99) доверительного интервала и n-1=7 степеней свободы; σ – стандартное отклонение значений площади пика ОФН для серии анализов;
инструментальный предел обнаружения IDLM в единицах массы вещества рассчитывается по формуле:
IDLM = IDLS · m/S = tα,n-1 · σ · m/S,
где: m – масса введенного тестового вещества (100 фг), S – среднее значение площади пика по 8 анализам.
Зная, что относительное стандартное отклонение RSD=σ/S·100%,
можно записать: IDLM = tα,n-1·RSD·m/100.
Серии анализов проводились в режиме сканирования отдельного иона (SIM) и при условиях, аналогичных приведенным в спецификациях хромато-масс-спектрометров Agilent 5977A и Thermo ISQ.
Почему в SIM? Потому что при полном сканировании статистические колебания амплитуды малого сигнала квадрупольного масс-спектрометра настолько велики, что не дают возможности получить стабильный отклик при вводе 100 фг ОФН. Однако, работа в режиме SIM хоть и является типичной для тройных квадрупольных МСД, не является таковой для МСД с одним квадруполем. Потребителя в этом случае в первую очередь интересует чувствительность в режиме полного сканирования. Следовательно, было бы нежелательно отказываться от оценки SNR в диапазоне m/z=1 а.е.м. в режиме полного сканирования. Поэтому данный метод оценки постоянно применяется в СКБ "Хроматэк".
Конкретные значения параметров режима измерения следующие:
Колонка CR-5ms 15м × 0,25мм × 0,25мкм
Длительность анализа 12 мин
Температура
колонки 40°С (1 мин) – 30°С/мин – 250°С
Поток через колонку 1 мл/мин
Деление потока в испарителе 0 мл/мин
(1 мин) – 30 мл/мин
(2 мин) – 10 мл/мин
Температура испарителя 250°С
Температура переходной линии 250°С
Температура источника ионов 200°С
Ток эмиссии 100 мкА
(задержка включения 2,5 мин)
Коэффициент усиления детектора 3·105
Диапазон сканирования 272 (SIM)
Ширина окна SIM 1 а.е.м.
Длительность скана 0,2 с
Результаты
Оценки IDL проведены на пяти экземплярах ГХ/МС производства СКБ "Хроматэк", в состав каждого из которых входили: хроматограф "Хроматэк-Кристалл 5000" и одноименный масс-спектрометрический детектор собственного производства, автоматический дозатор ДАЖ-2М.
Результаты измерений и вычислений для всех пяти экземпляров ГХ/МС приведены в табл.1.
Для примера, в табл.2 более подробно приведены результаты измерений и вычисления IDLM для МСД №5, а на рис.4 – хроматограммы данной серии анализов.
Низкий разброс площадей говорит о высокой чувствительности МСД "Хроматэк".
Среднее значение площади пика ОФН составляет, как видно из табл.2, S=3458, а стандартное отклонение σ=92,9. Тогда:
RSD=92,9/3458·100%=2,69%,
IDLM = 2,998·2,69%·100фг/100%=8,1 фг.
Заключение
На основе практического опыта определения чувствительности при производстве квадрупольных хромато-масс-спектрометров ЗАО СКБ "Хроматэк" можно сделать следующие выводы:
Определение IDL в режиме SIM можно применять для оценки чувствительности квадрупольных ГХ/МС, с его помощью можно получить представление о стабильности всей системы, включая автоматический дозатор, систему ввода и газового питания, колонку хроматографа, а также собственно масс-спектрометрический детектор.
Определение IDL в режиме SIM не позволяет "увидеть" и качественно оценить реальный уровень шумов ГХ/МС, а также определить загрязнения системы и их источники.
Для комплексной оценки чувствительности квадрупольных ГХ/МС необходимо ввести оценку IDL в режиме полного сканирования.
Расчет IDL в любом режиме (SIM и полного сканирования) не применим для ГХ/МС, поставляемых без автоматического дозатора, поскольку в этом случае в оценку вмешивается человеческий фактор. Поэтому данный метод требует обязательного наличия автоматического дозатора, что фактически ограничивает применение данного метода.
Мы предлагаем для проверки чувствительности систем ГХ/МС не отказываться от проверенного практикой метода оценки SNR в диапазоне m/z=1 а.е.м. и использовать новый метод оценки IDL наряду с хорошо себя зарекомендовавшим старым.
Литература
1. Герасимов Р. Инструментальный предел обнаружения вместо отношения сигнала к шуму: новый подход компании Agilent к оценке чувствительности метода ГХ/МС. – Аналитика, 2013, №2, с.56-58.
2. Signal, Noise, and Detection Limits in Mass Spectrometry. Agilent Technologies Technical Note, publication 5990-7651EN, 3, 2011.
3. Why Use Signal-To-Noise as a Measure of MS Performance When it is Often Meaningless. Agilent Technologies Technical Note, publication 5990-8341EN, 7, 2011.
За последние десятилетия методы оценки чувствительности хромато-масс-спектрометров претерпели значительные изменения. Четверть века назад для регистрации сигнала использовались самописцы, а для измерения его амплитуды – линейка. Величина шума определялась как разница между максимальным и минимальным значением сигнала базовой линии в течение 60 с непосредственно перед анализируемым пиком.
По мере совершенствования техники и замены самописцев компьютерами менялся и сам подход к определению отношения сигнал/шум. Появилась возможность автоматического поиска участка масс-хроматограммы с минимальным шумом, а в качестве величины шума при вычислении отношения сигнала к шуму стали использовать стандартное отклонение (standard deviation, SD) амплитуды шума. Величину SNR стали рассчитывать как отношение разности амплитуды пика и среднего значения базовой линии к стандартному отклонению шума.
В качестве примера на рис. 2 приведена масс-хроматограмма для m/z от 271,5 до 272,5, полученная при вводе 1 мкл раствора октафторнафталина (ОФН) с концентрацией 1 пг/мкл, в режиме полного сканирования в диапазоне масс от 50 до 300 а.е.м. на масс-спектрометрическом детекторе (МСД) "Хроматэк" с хроматографом "Хроматэк-Кристалл 5000" (см. рис.1). В зависимости от выбранного участка шума (1, 2 или 3), величина SNR различается почти в 2 раза: так, для первого участка SNR1=135, для второго участка SNR2=95, для третьего участка SNR3=76. Безусловно, программными методами участок 1 с наименьшим уровнем шума всегда будет найден и, соответственно, вычислено наибольшее значение SNR1=135.
В условиях все возрастающей конкуренции на рынке хромато-масс-спектрометров в 2008-2009 годах ведущими зарубежными производителями оборудования предложен модифицированный метод вычисления SNR, который давал значительное увеличение SNR без каких-либо существенных технических усовершенствований самой ГХ/МС-системы. По этому методу для построения масс-хроматограммы вместо диапазона m/z шириной 1 а.е.м. стал использоваться диапазон шириной 0,1 а.е.м. При этом из большого числа таких диапазонов вблизи массы анализируемого иона, программными методами определялся диапазон, в котором значение SNR было бы максимальным. Таким образом, значительная часть шумов оставалась "за кадром", и величина SNR резко повышалась. Для наглядности на рис.3 приведена та же масс-хроматограмма, что и на рис.2, но построенная для диапазона m/z шириной 0,1 а.е.м. от 271,85 до 271,95 а.е.м. с наименьшим уровнем шума. Как видно из рисунка, амплитуда пика ОФН та же самая, а уровень шума резко упал. Поэтому для первого участка SNR1=1756, а для второго участка SNR2=126.
Получение максимального SNR путем снижения шума стало целью производителей квадрупольных и других масс-спектрометров. Кроме того, за последнее десятилетие значительно выросло количество масс-спектрометров с тройным квадруполем и высокого разрешения, по принципу своей работы практически не дающих шума базовой линии. Однако уменьшение шума почти до нулевого уровня привело к сложностям в оценке чувствительности прибора.
Из приведенных выше масс-хроматограмм видно, что с уменьшением шума базовой линии увеличивается разброс величины стандартного отклонения шума SD (зависящей от выбранного участка масс-хроматограммы) и, следовательно, разброс SNR. При практически нулевом шуме базовой линии значение SNR для одного и того же прибора, в одних и тех же условиях может отличаться в сотни раз. Это справедливо как для отдельно взятой масс-хроматограммы, так и для нескольких масс-хроматограмм, снятых на одном приборе: чем меньше шум, тем больше разброс значений SNR между анализами. Очевидно, что в этом случае аналитик не имеет практического представления о чувствительности прибора.
Таким образом, возникла необходимость в применении универсального критерия для оценки чувствительности всех типов и режимов работы ГХ/МС, в качестве которого компания Agilent предложила статистический параметр – инструментальный предел обнаружения [1], а остальные производители его поддержали. И теперь уже ни одна спецификация квадрупольного хромато-масс-спектрометра не обходится без указания этой характеристики.
Вполне естественно, что мы, ориентируясь на лучшие зарубежные достижения, при разработке и производстве своего масс-спектрометрического (или по терминологии компании Agilent – масс-селективного детектора - МСД), прошли все исторические шаги по определению SNR, сделанные мировыми производителями. Поэтому каждая новая методика оценки чувствительности проверялась нами на МСД нашего производства.
В настоящий момент мы обязательно контролируем SNR как в диапазоне 1 а.е.м. (не менее 100:1), так и в диапазоне 0,1 а.е.м. (не менее 1000:1) без применения какой бы то ни было аппаратной и программной фильтрации. По нашему опыту соответствие последнему критерию не всегда дает гарантию хорошей чувствительности и отсутствия загрязнений МСД, а вот предыдущий, многократно проверенный, критерий (диапазон 1 а.е.м., SNR не менее 100:1) практически всегда работает, так как по своей сути - это интегральный критерий. Кроме того, мы постоянно сравниваем полученные результаты с результатами обсчета наших данных в программах Xcalibur и ChemStation.
После появления в начале 2013 года информации о применении статистического IDL в качестве универсального критерия оценки чувствительности квадрупольных хромато-масс-спектрометров, в СКБ "Хроматэк" была проведена серия испытаний своих ГХ/МС с целью определения IDL. В результате получены значения IDL от 5,5 до 8,7 фг, что соответствует чувствительности лучших зарубежных хромато-масс-спектрометров.
Остановимся подробнее на методике измерения и полученных результатах.
Методика измерения
За основу оценки IDL взят метод, изложенный в [2] со следующими параметрами и уточнениями:
число анализов (измерений) в серии n=8;
способ ввода тестового вещества - с помощью автосамплера;
тестовое вещество – октафторнафталин (ОФН) с концентрацией 100 фг/мкл;
объем вводимой пробы тестового вещества - 1 мкл (режим ввода – "сэндвич");
инструментальный предел обнаружения IDLS в единицах площади пика рассчитывается по формуле:
IDLS= tα,n-1 · σ,
где: tα,n-1 = 2,998 – коэффициент Стьюдента для 99% (α=0,99) доверительного интервала и n-1=7 степеней свободы; σ – стандартное отклонение значений площади пика ОФН для серии анализов;
инструментальный предел обнаружения IDLM в единицах массы вещества рассчитывается по формуле:
IDLM = IDLS · m/S = tα,n-1 · σ · m/S,
где: m – масса введенного тестового вещества (100 фг), S – среднее значение площади пика по 8 анализам.
Зная, что относительное стандартное отклонение RSD=σ/S·100%,
можно записать: IDLM = tα,n-1·RSD·m/100.
Серии анализов проводились в режиме сканирования отдельного иона (SIM) и при условиях, аналогичных приведенным в спецификациях хромато-масс-спектрометров Agilent 5977A и Thermo ISQ.
Почему в SIM? Потому что при полном сканировании статистические колебания амплитуды малого сигнала квадрупольного масс-спектрометра настолько велики, что не дают возможности получить стабильный отклик при вводе 100 фг ОФН. Однако, работа в режиме SIM хоть и является типичной для тройных квадрупольных МСД, не является таковой для МСД с одним квадруполем. Потребителя в этом случае в первую очередь интересует чувствительность в режиме полного сканирования. Следовательно, было бы нежелательно отказываться от оценки SNR в диапазоне m/z=1 а.е.м. в режиме полного сканирования. Поэтому данный метод оценки постоянно применяется в СКБ "Хроматэк".
Конкретные значения параметров режима измерения следующие:
Колонка CR-5ms 15м × 0,25мм × 0,25мкм
Длительность анализа 12 мин
Температура
колонки 40°С (1 мин) – 30°С/мин – 250°С
Поток через колонку 1 мл/мин
Деление потока в испарителе 0 мл/мин
(1 мин) – 30 мл/мин
(2 мин) – 10 мл/мин
Температура испарителя 250°С
Температура переходной линии 250°С
Температура источника ионов 200°С
Ток эмиссии 100 мкА
(задержка включения 2,5 мин)
Коэффициент усиления детектора 3·105
Диапазон сканирования 272 (SIM)
Ширина окна SIM 1 а.е.м.
Длительность скана 0,2 с
Результаты
Оценки IDL проведены на пяти экземплярах ГХ/МС производства СКБ "Хроматэк", в состав каждого из которых входили: хроматограф "Хроматэк-Кристалл 5000" и одноименный масс-спектрометрический детектор собственного производства, автоматический дозатор ДАЖ-2М.
Результаты измерений и вычислений для всех пяти экземпляров ГХ/МС приведены в табл.1.
Для примера, в табл.2 более подробно приведены результаты измерений и вычисления IDLM для МСД №5, а на рис.4 – хроматограммы данной серии анализов.
Низкий разброс площадей говорит о высокой чувствительности МСД "Хроматэк".
Среднее значение площади пика ОФН составляет, как видно из табл.2, S=3458, а стандартное отклонение σ=92,9. Тогда:
RSD=92,9/3458·100%=2,69%,
IDLM = 2,998·2,69%·100фг/100%=8,1 фг.
Заключение
На основе практического опыта определения чувствительности при производстве квадрупольных хромато-масс-спектрометров ЗАО СКБ "Хроматэк" можно сделать следующие выводы:
Определение IDL в режиме SIM можно применять для оценки чувствительности квадрупольных ГХ/МС, с его помощью можно получить представление о стабильности всей системы, включая автоматический дозатор, систему ввода и газового питания, колонку хроматографа, а также собственно масс-спектрометрический детектор.
Определение IDL в режиме SIM не позволяет "увидеть" и качественно оценить реальный уровень шумов ГХ/МС, а также определить загрязнения системы и их источники.
Для комплексной оценки чувствительности квадрупольных ГХ/МС необходимо ввести оценку IDL в режиме полного сканирования.
Расчет IDL в любом режиме (SIM и полного сканирования) не применим для ГХ/МС, поставляемых без автоматического дозатора, поскольку в этом случае в оценку вмешивается человеческий фактор. Поэтому данный метод требует обязательного наличия автоматического дозатора, что фактически ограничивает применение данного метода.
Мы предлагаем для проверки чувствительности систем ГХ/МС не отказываться от проверенного практикой метода оценки SNR в диапазоне m/z=1 а.е.м. и использовать новый метод оценки IDL наряду с хорошо себя зарекомендовавшим старым.
Литература
1. Герасимов Р. Инструментальный предел обнаружения вместо отношения сигнала к шуму: новый подход компании Agilent к оценке чувствительности метода ГХ/МС. – Аналитика, 2013, №2, с.56-58.
2. Signal, Noise, and Detection Limits in Mass Spectrometry. Agilent Technologies Technical Note, publication 5990-7651EN, 3, 2011.
3. Why Use Signal-To-Noise as a Measure of MS Performance When it is Often Meaningless. Agilent Technologies Technical Note, publication 5990-8341EN, 7, 2011.
Отзывы читателей
