eng
Выпуск #6/2013
О.Мелькина, И.Манухов, С.Антонова, А.Пушков, И.Малахова, В.Красиков, А.Яненко, С.Синеокий.
Определение L-гомосерина в культуральных жидкостях: экспресс-метод на основе ВЭТСХ
Определение L-гомосерина в культуральных жидкостях: экспресс-метод на основе ВЭТСХ
Просмотры: 2945
Предложен метод количественной высокоэффективной тонкослойной хроматографии для определения содержания L-гомосерина
в культуральных жидкостях (КЖ). Для разделения в течение 20–25 минут гомосерина, треонина, глицина, валина, аланина, лизина
и глутаминовой кислоты разработана с помощью модели «Призма» высокоэффективная подвижная фаза. Разработаны условия нанесения нингидринового реактива на хроматограммы и проведения цветной реакции. Проведена валидация методики.
в культуральных жидкостях (КЖ). Для разделения в течение 20–25 минут гомосерина, треонина, глицина, валина, аланина, лизина
и глутаминовой кислоты разработана с помощью модели «Призма» высокоэффективная подвижная фаза. Разработаны условия нанесения нингидринового реактива на хроматограммы и проведения цветной реакции. Проведена валидация методики.
Теги: aminoacids high performance thin-layer chromatography homoserine scanning densitometry validation. аминокислоты валидация гомосерин количественная тонкослойная хроматография нингидриновый реактив
Конструирование штаммов продуцентов треонина, как и других аминокислот, сводится к оптимизации биосинтеза, в частности через поиск лимитирующих стадий. Затем проводят их усиление путем повышения экспрессии одних и инактивации других генов, контрселекции побочных продуктов [1–4]. Треонин относится к аспарагиновому семейству протеиногенных аминокислот, которое помимо него включает аспартат, аспарагин, лизин, метионин и изолейцин. Кроме этих аминокислот в пути биосинтеза треонина образуется промежуточный метаболит гомосерин, непротеиногенная аминокислота. Основные примеси при синтезе треонина: гомосерин, изолейцин, лизин, а также аминокислоты из других классов: глицин, аланин, глутамин и валин. Количественное определение накапливающихся пробочных продуктов необходимо для выбора стратегии при конструировании суперпродуцентов треонина [5].
Гомосерин – это изомер и ближайший предшественник треонина. В процессе биосинтеза происходит конверсия гомосерина в треонин, благодаря действию изомеразного ферментного комплекса [6]. Для успешного проведения биосинтеза треонина необходимо иметь данные о текущей концентрации гомосерина на всех стадиях процесса культивирования.
Анализ культуральных жидкостей штамма-продуцента треонина из различных партий, выполненный ранее с помощью аминокислотного анализатора, показал, что ферментационные растворы, помимо целевого продукта треонина, содержат лизин, глутаминовую кислоту, глицин и гомосерин (в редких случаях аланин, валин и изолейцин). По данным Camag bibliography service, условия для разделения этих шести аминокислот на сегодняшний день не разработаны [7].
В работе предложен экспресс-метод на основе высокоэффективной тонкослойной хроматографии для определения гомосерина и других нецелевых метаболитов, накапливающихся в среде при ферментации конструируемых штаммов продуцентов треонина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали отечественные реактивы, квалификации "ЧДА" и "ХЧ". Органические растворители очищали согласно методикам [8]. Воду получали на установке Super Q (Millipore, США), удельное сопротивление 18 МОм/см.
Использовали стандарты гомосерина, валина, лизина, глицина, глутаминовой кислоты, треонина и аланина фирмы Sigma (США). Стандартные растворы в концентрациях 0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 мг/мл готовили в воде и хранили при температуре 4°С. Срок хранения растворов – две недели.
Пробы КЖ тщательно перемешивали, отбирали аликвоты по 1,0 мл, центрифугировали на центрифуге MiniSpin фирмы Eppendorf, (Германия) при 16100 g в течение 15–20 мин, надосадочную жидкость разбавляли водой таким образом, чтобы содержание аминокислот в подготовленных пробах находилось в пределах от 0,1 до 0,4 мг/мл.
Анализ проб проводили в день приготовления.
Для ТСХ использовали стандартные пластинки "Сорбфил" ПТСХ-АФ-В размером 10×15 см, ТУ 26-11-17-89, АО "Сорбполимер" (Краснодар), изготовленные по технологии, разработанной в НТЦ "Ленхром" (Санкт-Петербург). ТСХ-пластинки промывали смесью хлороформ – метанол (1:1 по объему) и активировали в течение 30 мин при
110–115°С в сушильном шкафу.
Растворы стандартных образцов и проб КЖ наносили на пластинки с помощью автоматического аппликатора ATS-4 фирмы Camag (Швейцария) или микрошприца "Газохром 101" вместимостью 1,0 мкл фирмы "НПО Хроматограф" (Россия). Объем наносимых проб – 0,5 мкл.
Хроматографию проводили восходящим методом в стеклянной камере (22,5×29,0×16,0 см) производства НТЦ "Ленхром". Подвижная фаза состояла из пропанола-2, ацетона, воды и 25%-го водного раствора аммиака (20:20:7:6 по объему). Насыщение камеры – 1,0 ч. Время разделения составило 25–30 мин. После элюирования хроматограмму выдерживали в течение 10 мин при 20°С, затем в течение 20 мин в сушильном шкафу при 110°С. Для визуализации пятен аминокислот на хроматограмме использовали 0,3%-й раствор нингидрина (перекристаллизованного с углем [9]) в ацетоне, содержащем 1,0% ледяной уксусной кислоты. Пластинку погружали в кювету с раствором обнаруживающего реагента на 20 с, 10 мин выдерживали при комнатной температуре, затем 2 мин в сушильном шкафу при температуре 75°С. На хроматограмме наблюдали малиновые пятна на белом фоне.
Количественно аминокислоты определяли на денситометрах CS-920 фирмы Shimadzu (Япония) и TLC scanner 3 фирмы Camag при длине волны 500 нм.
Статистическую обработку полученных результатов проводили согласно методике [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор подвижной фазы для отделения
гомосерина от сопутствующих ему в КЖ
аминокислот
С помощью модели "Призма", которая широко используется для конструирования подвижных фаз в ТСХ и ВЭЖХ [11], мы разработали подвижную фазу с компонентным составом: пропанол-2 – ацетон – вода – 25%-й водный раствор аммиака (20:20:7:6 по объему), при этом время разделения составило 25–30 мин (l = 70 мм), t = 20°С. Пятно гомосерина имело компактную форму, однако оно частично перекрывало пятно аланина, образуя "восьмерку".
Учитывая, что в зоне локализации пятен гомосерина система не давала "второго фронта", для получения округлой формы целевого продукта мы использовали метод бинарного элюирования [12]. Суть его состоит в следующем: перед повторным элюированием после разделения в используемой системе (l1 = 70 мм), высушенную хроматограмму выдерживали 30 мин при 80°С для удаления остатков компонентов подвижной фазы с поверхности хроматограммы. Затем проводили повторное элюирование в той же системе (l2 = 73 мм). Когда подвижная фаза при повторном элюировании доходит до участка сорбента, содержащего пробу, пятно сжимается в направлении движения элюента. Это происходит вследствие вхождения подвижной фазы сначала в контакт с нижним краем пятна; молекулы вещества, содержащиеся в этой части пятна, начинают двигаться раньше тех молекул, до которых еще не дошел фронт элюента. Однако, как только пятно остается за фронтом растворителя, оно снова начинает размываться, главным образом за счет диффузии (рис.1).
Таким образом, используя бинарное элюирование (l1 = 70 мм, l2 = 73 мм), удалось добиться не только получения округлой формы пятна гомосерина, но и его равномерной окраски после обработки раствором нингидрина (рис.2).
Бинарное и многократное элюирование ши-
роко применяется для анализа сложных смесей. Созданы приборы для автоматического многократного хроматографического элюирования [13–14],
которые в настоящее время используют для разделения алкалоидов, пестицидов и продуктов, выделенных из растительного сырья [15]. Принцип действия такого прибора показан на рис.3. В нем происходит ступенчатое изократическое разделение сложных смесей, благодаря чему возрастает разрешение. Так, при проведении пяти циклов элюирования смесь разделили на пять компонентов, а в случае проведения n циклов элюирования аналит разделен на семь компонентов. При каждом цикле элюирования фронт элюента поднимается на определенную фиксированную высоту.
Количественное определение гомосерина
и сопутствующих ему в КЖ аминокислот
Раствор нингидрированного реактива на хроматограмму наносили методом погружения (dipping, immersion), поскольку при денситометрии таких хроматограмм получаются результаты с лучшими метрологическими характеристиками по сравнению с использованием опрыскивания (при сохранении выборки и доверительной вероятности) [16–17]. Установлено, что оптимальные условия визуализации пятен на хроматограмме следующие: экспозиция хроматограммы в кювете с раствором нингидринового реактива – 17–20°C; время, необходимое для проведения цветной реакции, – 2 мин; температура проведения цветной реакции – 70–75°С.
Окраска пятен гомосерина на хроматограммах при температуре 21°С устойчива в интервале от 0,5 до 7,0 ч при хранении хроматограмм в защищенном от света месте. Следует отметить, что при хранении хроматограммы в холодильнике при 12°С (хроматограмма должна быть тщательно защищена от влаги) окраска пятен гомосерина стабильна в течение 24–30 ч. По истечении этого времени на хроматограмме появляется светло-малиновый фон, окраска которого со временем усиливается [18], что нежелательно при проведении денситометрических измерений.
Количественную обработку хроматограмм проводили с помощью денситометров сразу после проведения нингидриновой реакции. На рис.4 представлен фрагмент денситограммы модельной смеси аминокислот (0,2 мкг в пятне), содержащихся в КЖ штамма-продуцента. Видно, что в этих условиях анализируемые аминокислоты проявляются в виде четких индивидуальных пиков.
Установлено, что зависимость денситометрических сигналов гомосерина линейна в диапазоне от 0,1 до 0,4 мкг в пятне. Градуировочный график выполнен по четырем точкам веществ-стандартов, взятых в трех повторностях (0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 мкг в пятне), r = 0,9941. Предел количественного определения гомосерина – 0,1 мкг в пятне. Предел обнаружения гомосерина – 0,05 мкг в пятне.
В таблице 1 представлены результаты измерения содержания гомосерина в различных партиях слива КЖ, полученные методом ВЭТСХ. Результаты имеют хорошие метрологические характеристики, величины (n = 3, P 0,95) не превышают 5,0%.
Разработанная методика позволяет в случае необходимости проводить определение содержания не только целевого продукта – гомосерина, но и других аминокислот, присутствующих в КЖ. Для упрощения решения этой задачи мы определили величины денситометрических сигналов пятен аминокислот (содержание аминокислот в пятне составляло 0,2 мкг). Проведена регистрация спектров поглощения нингидриновых комплексов гомосерина и сопутствующих ему в КЖ аминокислот in situ (рис.5). Полученные спектры не отличаются друг от друга. Следовательно, и корректирующие нормировочные коэффициенты гомосерина и аминокислот, сопутствующих ему в КЖ, имеют одинаковую величину.
Валидация методики количественного определения гомосерина методом хроматоденситометрии
Согласно требованиям ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009, неотъемлемая часть современного количественного анализа – валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает в себя следующие характеристики: специфичность, линейную зависимость, правильность (точность), предел обнаружения, предел количественного определения, пригодность системы [19–20]. Так, согласно правилам валидации для метода ВЭТСХ [19–20], необходимо провести предварительные тесты и выяснить, насколько стабильна во времени окраска пятен нингидринового комплекса аминокислот на хроматограммах после проведения цветной реакции. Исследована зависимость денситометрических сигналов пятен гомосерина на хроматограммах от времени (содержание гомосерина в пятне 0,2 мкг). Регистрацию денситометрических сигналов пятен аминокислот на хроматограммах проводили при температуре 21°С через следующие промежутки времени: 0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 и 10,0 ч.
В перерывах между измерениями хроматограммы выдерживали в защищенном от света месте. В качестве репера использовали денситометрический сигнал пятна бихромата калия, который наносили на хроматограмму (0,03 мкг на пятно) после окончания цветной реакции. Следует отметить, что бихромат калия имеет в спектре поглощения максимум при 500 нм, и что самое главное для нас, его пятно не изменяет интенсивности своей окраски более 5 суток, будучи на поверхности активного слоя силикагеля при хранении в защищенном от света месте.
Согласно нормативам GLP (Good Laboratory Practice), неотъемлемая часть современного количественного анализа – валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает в себя следующие характеристики: специфичность, линейную зависимость, правильность (точность), предел обнаружения, предел количественного определения и пригодность системы [20–21]. Известно, что гомосерин устойчив в водных и водно-спиртовых растворах в течение нескольких суток при комнатной температуре. Для доказательства устойчивости гомосерина на слое силикагеля проведены следующие предвалидационные тесты:
•двумерная хроматография гомосерина, которая показала, что после двумерного элюирования он дает только одно пятно. Условия проведения анализа для гомосерина следующие: элюент – пропанол-2 – ацетон –
25%-й водный раствор аммиака – вода(20:20:7:6),
t = 20°С, насыщение камеры 1 ч, содержание гомосерина в пятне 0,3 мкг;
•хроматография растворов одних и тех же проб гомосерина в следующие промежутки времени: 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин. Установлено, что гомосерин элюируется одним пятном, интенсивность которого не меняется в течение 360 мин. Условия проведения анализа такие же, как и в предыдущем пункте;
•пробы гомосерина наносили на пластинки, после чего проводили элюирование этих пластинок через 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин. Перед элюированием пластинки выдерживали в лабораторном помещении при комнатной температуре 20–25°С в незащищенном от света месте. Обнаружено, что гомосерин проявляется одним пятном и интенсивность этого пятна не изменяется.
Полученные таким образом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что гомосерин устойчив на тонких слоях силикагеля в течение 360 мин, что позволяет проводить денситометрические измерения.
Разработанная нами подвижная фаза для разделения компонентов КЖ штамма-продуцента гомосерина весьма эффективна: величина ΔRf >> 0,05 (для пятен треонина, гомосерина и аланина). Установлено, что аналитическая область методики, в пределах которой соблюдается линейная зависимость, охватывает интервал для гомосерина и треонина от 0,1 до 0,4 мкг в пятне (включая эти пределы).
Правильность (точность) разработанной методики в пределах аналитической области иллюстрируют результаты, представленные в таблице 2. Данные демонстрируют хорошую внутрилабораторную воспроизводимость результатов. Проверена также межлабораторная воспроизводимость результатов: результаты, полученные на межлабораторных испытаниях, хорошо коррелируют друг с другом (табл.3). Предел обнаружения гомосерина составляет 0,05 мкг, предел количественного определения гомосерина 0,1 мкг в пятне
(S/N = 20).
Исследована зависимость селективности разделения от величины объемного содержания пропанола-2 и ацетона, входящих в состав подвижной фазы. Установлено, что величины ΔRf гомосерина и сопутствующих ему в КЖ аминокислот практически не изменяются: ΔRf ± 0,05 (n = 5,
P 0,95) в интервале содержания пропанола-2 от 15,0 до 25,0 объемных процентов и ацетона от 18,0 до 25,0 объемных процентов. Температура в интервале от 15 до 30°С и время насыщения камеры от 30 до 120 мин также не оказывают влияния на величины ΔRf ± 0,05 (n = 5, P 0,95) треонина, гомосерина, аланина и валина.
Использование в ВЭТСХ различных партий пластинок "Сорбфил" (предварительно промытых и активированных) также не вызывает изменений селективности разделения компонентов КЖ [robustness (ruggedness)].
Полученные результаты свидетельствуют о пригодности разработанной нами методики для количественного определения треонина, гомосерина и сопутствующих им в КЖ аминокислот. Разработанная и валидированная методика позволяет проводить одновременное количественное определение треонина, гомосерина, лизина, глицина, глутаминовой кислоты, аланина и валина.
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы" ГК 16.522.12.2013 от 10 октября 2011 года и договора №13.G25.31.0069 с использованием оборудования ЦКП ФГУП "ГосНИИгенетика".
Авторы выражают благодарность Б.Тяглову и Е.Барсукову за помощь в работе, консультации и ценные советы.
литературА
1. Debabov V.G., Kozlov J.I., Khurges E.M., Lifshits V.A., Zhdanova N.I., Gusyatiner M.M., Sokolov A.K., Bachina T.A., Christoserdov A.Y., Tsigankov U.D. and others. L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine. Patent US 6132999 A, 2000.
2. Lee K.H., Park J.H., Kim T.Y., Kim H.U., Lee S.Y. Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L-threonine production. – Molecular Systems Biology, 2007, v.3, p.149.
3. Okamoto K., Kino K., Ikeda M. Hyperproduction of L-threonine by an Escherichia coli mutant with impaired L-threonine uptake. – Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1997, v.61, №11, p.1877–1882.
4. Гусятинер М.М., Жданова Н.И., Лившиц В.А., Заиграева Г.Г., Шакулов Р.С. Исследование функции гена relA в выражении аминокислотных оперонов. II. Влияние аллельного состояния гена relA на сверхсинтез треонина мутантом Escherichia coli K-12 устойчивым к β-оксинорвалину. – Генетика, 1978, v.14, №6, c.957–968.
5. Юзбашев Т.В., Выборная Т.В., Ларина А.С.,
Гвилава И.Т., Воюшина Н.Е., Мокрова С.С.,
Юзбашева Е.Ю., Манухов И.В., Синеокий С.П.,
Дебабов В.Г. Направленная модификация метаболизма Escherichia coli для создания штаммов – продуцентов треонина. – Биотехнология, 2013, №2, с.8–33.
6. Ленинджер А. Основы биохимии. – М: Мир, 1985, т.2.
7. www.camag.com.
8. Perrin D.D. Purification of Laboratory Chemicals. – N-Y-London – Pergamon Press, 1988
9. Mikes O. Laboratory Handbook of Chromatograhic and applied methods. – Ellis Hopwood – New York, 1979.
10. Государственная фармакопея СССР. – 11-е изд., М.: Медицина,1987, с.200–207.
11. Nyiredy S.Z., Evdelmeier S.A. TLC mobile phase optimization procedure using “Prizma” model. – Planta Medica, 1985, №2, p.241–252.
12. Kaiser R.E. Instrumental HPTLC. – Huthing, Heidel-
berg, 1980, 179 p.
13. Planar Chromatography 2002, Modern Thin-Layer Chromatography, Camag, Muttenz, 2002, p.40.
14. Poole C.F. Progress in planar chromatography. – Trends in Analytical Chemistry, 1985, v.4, p.209–213.
15. Matysik G., Wojtasik E. Automated multiple development HPTLC analysis of Frantgula Authraguinones – Journal of Planar Chromatography, 1994, v.7, p.34–38.
16. Pachaly P. Dunnshicht-Chromatographie der
Apotheka. – Stutdgart – Wissenschafilich Veriagages, 1996.
17. Rolka K., Xie J. Separation of α-amino acids by thin-layer сhromatography. – Journal of Medical Chemystry, 1989, v.32, p.1497–1503.
18. Хохлов А.С., Щукина Л.А., Шемякин М.М. Журнал общей химии, 1951, т.21, с.1016–1033.
19. Ferencz-Fodor K., Vegh Z., Renger B., Zeller M.
Validation and quality assurance of planar chromatographic procedures in pharmaceutical analysis. – Journal of the Association Official Analytical Chemists, 2001, v.84, p.1265–1276.
20. Renger B., Végh Z., Ferenczi-Fodor K. Validation of thin layer and high performance thin layer chromatographic methods. – Journal of Chromatography A., 2011, v.1218, p.2712–2721.
21. Ebel S. The chromatographic uncertainly principles. – Chromatographia, 1987, v.20, p.123–134.
Гомосерин – это изомер и ближайший предшественник треонина. В процессе биосинтеза происходит конверсия гомосерина в треонин, благодаря действию изомеразного ферментного комплекса [6]. Для успешного проведения биосинтеза треонина необходимо иметь данные о текущей концентрации гомосерина на всех стадиях процесса культивирования.
Анализ культуральных жидкостей штамма-продуцента треонина из различных партий, выполненный ранее с помощью аминокислотного анализатора, показал, что ферментационные растворы, помимо целевого продукта треонина, содержат лизин, глутаминовую кислоту, глицин и гомосерин (в редких случаях аланин, валин и изолейцин). По данным Camag bibliography service, условия для разделения этих шести аминокислот на сегодняшний день не разработаны [7].
В работе предложен экспресс-метод на основе высокоэффективной тонкослойной хроматографии для определения гомосерина и других нецелевых метаболитов, накапливающихся в среде при ферментации конструируемых штаммов продуцентов треонина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали отечественные реактивы, квалификации "ЧДА" и "ХЧ". Органические растворители очищали согласно методикам [8]. Воду получали на установке Super Q (Millipore, США), удельное сопротивление 18 МОм/см.
Использовали стандарты гомосерина, валина, лизина, глицина, глутаминовой кислоты, треонина и аланина фирмы Sigma (США). Стандартные растворы в концентрациях 0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 мг/мл готовили в воде и хранили при температуре 4°С. Срок хранения растворов – две недели.
Пробы КЖ тщательно перемешивали, отбирали аликвоты по 1,0 мл, центрифугировали на центрифуге MiniSpin фирмы Eppendorf, (Германия) при 16100 g в течение 15–20 мин, надосадочную жидкость разбавляли водой таким образом, чтобы содержание аминокислот в подготовленных пробах находилось в пределах от 0,1 до 0,4 мг/мл.
Анализ проб проводили в день приготовления.
Для ТСХ использовали стандартные пластинки "Сорбфил" ПТСХ-АФ-В размером 10×15 см, ТУ 26-11-17-89, АО "Сорбполимер" (Краснодар), изготовленные по технологии, разработанной в НТЦ "Ленхром" (Санкт-Петербург). ТСХ-пластинки промывали смесью хлороформ – метанол (1:1 по объему) и активировали в течение 30 мин при
110–115°С в сушильном шкафу.
Растворы стандартных образцов и проб КЖ наносили на пластинки с помощью автоматического аппликатора ATS-4 фирмы Camag (Швейцария) или микрошприца "Газохром 101" вместимостью 1,0 мкл фирмы "НПО Хроматограф" (Россия). Объем наносимых проб – 0,5 мкл.
Хроматографию проводили восходящим методом в стеклянной камере (22,5×29,0×16,0 см) производства НТЦ "Ленхром". Подвижная фаза состояла из пропанола-2, ацетона, воды и 25%-го водного раствора аммиака (20:20:7:6 по объему). Насыщение камеры – 1,0 ч. Время разделения составило 25–30 мин. После элюирования хроматограмму выдерживали в течение 10 мин при 20°С, затем в течение 20 мин в сушильном шкафу при 110°С. Для визуализации пятен аминокислот на хроматограмме использовали 0,3%-й раствор нингидрина (перекристаллизованного с углем [9]) в ацетоне, содержащем 1,0% ледяной уксусной кислоты. Пластинку погружали в кювету с раствором обнаруживающего реагента на 20 с, 10 мин выдерживали при комнатной температуре, затем 2 мин в сушильном шкафу при температуре 75°С. На хроматограмме наблюдали малиновые пятна на белом фоне.
Количественно аминокислоты определяли на денситометрах CS-920 фирмы Shimadzu (Япония) и TLC scanner 3 фирмы Camag при длине волны 500 нм.
Статистическую обработку полученных результатов проводили согласно методике [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор подвижной фазы для отделения
гомосерина от сопутствующих ему в КЖ
аминокислот
С помощью модели "Призма", которая широко используется для конструирования подвижных фаз в ТСХ и ВЭЖХ [11], мы разработали подвижную фазу с компонентным составом: пропанол-2 – ацетон – вода – 25%-й водный раствор аммиака (20:20:7:6 по объему), при этом время разделения составило 25–30 мин (l = 70 мм), t = 20°С. Пятно гомосерина имело компактную форму, однако оно частично перекрывало пятно аланина, образуя "восьмерку".
Учитывая, что в зоне локализации пятен гомосерина система не давала "второго фронта", для получения округлой формы целевого продукта мы использовали метод бинарного элюирования [12]. Суть его состоит в следующем: перед повторным элюированием после разделения в используемой системе (l1 = 70 мм), высушенную хроматограмму выдерживали 30 мин при 80°С для удаления остатков компонентов подвижной фазы с поверхности хроматограммы. Затем проводили повторное элюирование в той же системе (l2 = 73 мм). Когда подвижная фаза при повторном элюировании доходит до участка сорбента, содержащего пробу, пятно сжимается в направлении движения элюента. Это происходит вследствие вхождения подвижной фазы сначала в контакт с нижним краем пятна; молекулы вещества, содержащиеся в этой части пятна, начинают двигаться раньше тех молекул, до которых еще не дошел фронт элюента. Однако, как только пятно остается за фронтом растворителя, оно снова начинает размываться, главным образом за счет диффузии (рис.1).
Таким образом, используя бинарное элюирование (l1 = 70 мм, l2 = 73 мм), удалось добиться не только получения округлой формы пятна гомосерина, но и его равномерной окраски после обработки раствором нингидрина (рис.2).
Бинарное и многократное элюирование ши-
роко применяется для анализа сложных смесей. Созданы приборы для автоматического многократного хроматографического элюирования [13–14],
которые в настоящее время используют для разделения алкалоидов, пестицидов и продуктов, выделенных из растительного сырья [15]. Принцип действия такого прибора показан на рис.3. В нем происходит ступенчатое изократическое разделение сложных смесей, благодаря чему возрастает разрешение. Так, при проведении пяти циклов элюирования смесь разделили на пять компонентов, а в случае проведения n циклов элюирования аналит разделен на семь компонентов. При каждом цикле элюирования фронт элюента поднимается на определенную фиксированную высоту.
Количественное определение гомосерина
и сопутствующих ему в КЖ аминокислот
Раствор нингидрированного реактива на хроматограмму наносили методом погружения (dipping, immersion), поскольку при денситометрии таких хроматограмм получаются результаты с лучшими метрологическими характеристиками по сравнению с использованием опрыскивания (при сохранении выборки и доверительной вероятности) [16–17]. Установлено, что оптимальные условия визуализации пятен на хроматограмме следующие: экспозиция хроматограммы в кювете с раствором нингидринового реактива – 17–20°C; время, необходимое для проведения цветной реакции, – 2 мин; температура проведения цветной реакции – 70–75°С.
Окраска пятен гомосерина на хроматограммах при температуре 21°С устойчива в интервале от 0,5 до 7,0 ч при хранении хроматограмм в защищенном от света месте. Следует отметить, что при хранении хроматограммы в холодильнике при 12°С (хроматограмма должна быть тщательно защищена от влаги) окраска пятен гомосерина стабильна в течение 24–30 ч. По истечении этого времени на хроматограмме появляется светло-малиновый фон, окраска которого со временем усиливается [18], что нежелательно при проведении денситометрических измерений.
Количественную обработку хроматограмм проводили с помощью денситометров сразу после проведения нингидриновой реакции. На рис.4 представлен фрагмент денситограммы модельной смеси аминокислот (0,2 мкг в пятне), содержащихся в КЖ штамма-продуцента. Видно, что в этих условиях анализируемые аминокислоты проявляются в виде четких индивидуальных пиков.
Установлено, что зависимость денситометрических сигналов гомосерина линейна в диапазоне от 0,1 до 0,4 мкг в пятне. Градуировочный график выполнен по четырем точкам веществ-стандартов, взятых в трех повторностях (0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 мкг в пятне), r = 0,9941. Предел количественного определения гомосерина – 0,1 мкг в пятне. Предел обнаружения гомосерина – 0,05 мкг в пятне.
В таблице 1 представлены результаты измерения содержания гомосерина в различных партиях слива КЖ, полученные методом ВЭТСХ. Результаты имеют хорошие метрологические характеристики, величины (n = 3, P 0,95) не превышают 5,0%.
Разработанная методика позволяет в случае необходимости проводить определение содержания не только целевого продукта – гомосерина, но и других аминокислот, присутствующих в КЖ. Для упрощения решения этой задачи мы определили величины денситометрических сигналов пятен аминокислот (содержание аминокислот в пятне составляло 0,2 мкг). Проведена регистрация спектров поглощения нингидриновых комплексов гомосерина и сопутствующих ему в КЖ аминокислот in situ (рис.5). Полученные спектры не отличаются друг от друга. Следовательно, и корректирующие нормировочные коэффициенты гомосерина и аминокислот, сопутствующих ему в КЖ, имеют одинаковую величину.
Валидация методики количественного определения гомосерина методом хроматоденситометрии
Согласно требованиям ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009, неотъемлемая часть современного количественного анализа – валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает в себя следующие характеристики: специфичность, линейную зависимость, правильность (точность), предел обнаружения, предел количественного определения, пригодность системы [19–20]. Так, согласно правилам валидации для метода ВЭТСХ [19–20], необходимо провести предварительные тесты и выяснить, насколько стабильна во времени окраска пятен нингидринового комплекса аминокислот на хроматограммах после проведения цветной реакции. Исследована зависимость денситометрических сигналов пятен гомосерина на хроматограммах от времени (содержание гомосерина в пятне 0,2 мкг). Регистрацию денситометрических сигналов пятен аминокислот на хроматограммах проводили при температуре 21°С через следующие промежутки времени: 0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 и 10,0 ч.
В перерывах между измерениями хроматограммы выдерживали в защищенном от света месте. В качестве репера использовали денситометрический сигнал пятна бихромата калия, который наносили на хроматограмму (0,03 мкг на пятно) после окончания цветной реакции. Следует отметить, что бихромат калия имеет в спектре поглощения максимум при 500 нм, и что самое главное для нас, его пятно не изменяет интенсивности своей окраски более 5 суток, будучи на поверхности активного слоя силикагеля при хранении в защищенном от света месте.
Согласно нормативам GLP (Good Laboratory Practice), неотъемлемая часть современного количественного анализа – валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает в себя следующие характеристики: специфичность, линейную зависимость, правильность (точность), предел обнаружения, предел количественного определения и пригодность системы [20–21]. Известно, что гомосерин устойчив в водных и водно-спиртовых растворах в течение нескольких суток при комнатной температуре. Для доказательства устойчивости гомосерина на слое силикагеля проведены следующие предвалидационные тесты:
•двумерная хроматография гомосерина, которая показала, что после двумерного элюирования он дает только одно пятно. Условия проведения анализа для гомосерина следующие: элюент – пропанол-2 – ацетон –
25%-й водный раствор аммиака – вода(20:20:7:6),
t = 20°С, насыщение камеры 1 ч, содержание гомосерина в пятне 0,3 мкг;
•хроматография растворов одних и тех же проб гомосерина в следующие промежутки времени: 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин. Установлено, что гомосерин элюируется одним пятном, интенсивность которого не меняется в течение 360 мин. Условия проведения анализа такие же, как и в предыдущем пункте;
•пробы гомосерина наносили на пластинки, после чего проводили элюирование этих пластинок через 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин. Перед элюированием пластинки выдерживали в лабораторном помещении при комнатной температуре 20–25°С в незащищенном от света месте. Обнаружено, что гомосерин проявляется одним пятном и интенсивность этого пятна не изменяется.
Полученные таким образом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что гомосерин устойчив на тонких слоях силикагеля в течение 360 мин, что позволяет проводить денситометрические измерения.
Разработанная нами подвижная фаза для разделения компонентов КЖ штамма-продуцента гомосерина весьма эффективна: величина ΔRf >> 0,05 (для пятен треонина, гомосерина и аланина). Установлено, что аналитическая область методики, в пределах которой соблюдается линейная зависимость, охватывает интервал для гомосерина и треонина от 0,1 до 0,4 мкг в пятне (включая эти пределы).
Правильность (точность) разработанной методики в пределах аналитической области иллюстрируют результаты, представленные в таблице 2. Данные демонстрируют хорошую внутрилабораторную воспроизводимость результатов. Проверена также межлабораторная воспроизводимость результатов: результаты, полученные на межлабораторных испытаниях, хорошо коррелируют друг с другом (табл.3). Предел обнаружения гомосерина составляет 0,05 мкг, предел количественного определения гомосерина 0,1 мкг в пятне
(S/N = 20).
Исследована зависимость селективности разделения от величины объемного содержания пропанола-2 и ацетона, входящих в состав подвижной фазы. Установлено, что величины ΔRf гомосерина и сопутствующих ему в КЖ аминокислот практически не изменяются: ΔRf ± 0,05 (n = 5,
P 0,95) в интервале содержания пропанола-2 от 15,0 до 25,0 объемных процентов и ацетона от 18,0 до 25,0 объемных процентов. Температура в интервале от 15 до 30°С и время насыщения камеры от 30 до 120 мин также не оказывают влияния на величины ΔRf ± 0,05 (n = 5, P 0,95) треонина, гомосерина, аланина и валина.
Использование в ВЭТСХ различных партий пластинок "Сорбфил" (предварительно промытых и активированных) также не вызывает изменений селективности разделения компонентов КЖ [robustness (ruggedness)].
Полученные результаты свидетельствуют о пригодности разработанной нами методики для количественного определения треонина, гомосерина и сопутствующих им в КЖ аминокислот. Разработанная и валидированная методика позволяет проводить одновременное количественное определение треонина, гомосерина, лизина, глицина, глутаминовой кислоты, аланина и валина.
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы" ГК 16.522.12.2013 от 10 октября 2011 года и договора №13.G25.31.0069 с использованием оборудования ЦКП ФГУП "ГосНИИгенетика".
Авторы выражают благодарность Б.Тяглову и Е.Барсукову за помощь в работе, консультации и ценные советы.
литературА
1. Debabov V.G., Kozlov J.I., Khurges E.M., Lifshits V.A., Zhdanova N.I., Gusyatiner M.M., Sokolov A.K., Bachina T.A., Christoserdov A.Y., Tsigankov U.D. and others. L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine. Patent US 6132999 A, 2000.
2. Lee K.H., Park J.H., Kim T.Y., Kim H.U., Lee S.Y. Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L-threonine production. – Molecular Systems Biology, 2007, v.3, p.149.
3. Okamoto K., Kino K., Ikeda M. Hyperproduction of L-threonine by an Escherichia coli mutant with impaired L-threonine uptake. – Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1997, v.61, №11, p.1877–1882.
4. Гусятинер М.М., Жданова Н.И., Лившиц В.А., Заиграева Г.Г., Шакулов Р.С. Исследование функции гена relA в выражении аминокислотных оперонов. II. Влияние аллельного состояния гена relA на сверхсинтез треонина мутантом Escherichia coli K-12 устойчивым к β-оксинорвалину. – Генетика, 1978, v.14, №6, c.957–968.
5. Юзбашев Т.В., Выборная Т.В., Ларина А.С.,
Гвилава И.Т., Воюшина Н.Е., Мокрова С.С.,
Юзбашева Е.Ю., Манухов И.В., Синеокий С.П.,
Дебабов В.Г. Направленная модификация метаболизма Escherichia coli для создания штаммов – продуцентов треонина. – Биотехнология, 2013, №2, с.8–33.
6. Ленинджер А. Основы биохимии. – М: Мир, 1985, т.2.
7. www.camag.com.
8. Perrin D.D. Purification of Laboratory Chemicals. – N-Y-London – Pergamon Press, 1988
9. Mikes O. Laboratory Handbook of Chromatograhic and applied methods. – Ellis Hopwood – New York, 1979.
10. Государственная фармакопея СССР. – 11-е изд., М.: Медицина,1987, с.200–207.
11. Nyiredy S.Z., Evdelmeier S.A. TLC mobile phase optimization procedure using “Prizma” model. – Planta Medica, 1985, №2, p.241–252.
12. Kaiser R.E. Instrumental HPTLC. – Huthing, Heidel-
berg, 1980, 179 p.
13. Planar Chromatography 2002, Modern Thin-Layer Chromatography, Camag, Muttenz, 2002, p.40.
14. Poole C.F. Progress in planar chromatography. – Trends in Analytical Chemistry, 1985, v.4, p.209–213.
15. Matysik G., Wojtasik E. Automated multiple development HPTLC analysis of Frantgula Authraguinones – Journal of Planar Chromatography, 1994, v.7, p.34–38.
16. Pachaly P. Dunnshicht-Chromatographie der
Apotheka. – Stutdgart – Wissenschafilich Veriagages, 1996.
17. Rolka K., Xie J. Separation of α-amino acids by thin-layer сhromatography. – Journal of Medical Chemystry, 1989, v.32, p.1497–1503.
18. Хохлов А.С., Щукина Л.А., Шемякин М.М. Журнал общей химии, 1951, т.21, с.1016–1033.
19. Ferencz-Fodor K., Vegh Z., Renger B., Zeller M.
Validation and quality assurance of planar chromatographic procedures in pharmaceutical analysis. – Journal of the Association Official Analytical Chemists, 2001, v.84, p.1265–1276.
20. Renger B., Végh Z., Ferenczi-Fodor K. Validation of thin layer and high performance thin layer chromatographic methods. – Journal of Chromatography A., 2011, v.1218, p.2712–2721.
21. Ebel S. The chromatographic uncertainly principles. – Chromatographia, 1987, v.20, p.123–134.
Отзывы читателей
