eng
Выпуск #3/2014
И.Зверева, Е.Семенистая, Г.Кротов, Родченков
Идентификация допинговых соединений пептидной природы, распространяемых через интернет
Идентификация допинговых соединений пептидной природы, распространяемых через интернет
Просмотры: 5816
Сегодня велик соблазн применения разных видов допинговых соединений, как в профессиональном, так и в любительском спорте. Рынок спортивного питания насчитывает тысячи препаратов, однако наиболее востребованы услуги интернет-магазинов по продаже спортивного питания и биодобавок из-за низких цен и доступности запрещенных к употреблению веществ. Опасность покупок связана с тем, что есть вероятность
несоответствия заявленных на этикетке веществ содержимому упаковок. Представлены результаты исследования препаратов пептидной природы, распространяемых через интернет-магазины. В ходе работы методом ВЭЖХ-МС охарактеризованы 17 образцов: GHRP-2, GHRP-6, Ipamorelin, СJС-1295, фрагмент гормона роста 176-191 (Human Growth Hormone, HGH), MGF,
пэгилированная форма PEG-MGF, синтетический пептид TB-500 и модифицированный инсулино-подобный
фактор роста Long-R3-IGF-1.
несоответствия заявленных на этикетке веществ содержимому упаковок. Представлены результаты исследования препаратов пептидной природы, распространяемых через интернет-магазины. В ходе работы методом ВЭЖХ-МС охарактеризованы 17 образцов: GHRP-2, GHRP-6, Ipamorelin, СJС-1295, фрагмент гормона роста 176-191 (Human Growth Hormone, HGH), MGF,
пэгилированная форма PEG-MGF, синтетический пептид TB-500 и модифицированный инсулино-подобный
фактор роста Long-R3-IGF-1.
Теги: black market doping fragment hgh 176-191 ghrp-2 ghrp-6 growth hormone secretagogues ipamorelin long-r3-igf-1 mechano growth factor (mgf) peg-mgf sermorelin tb-500 tb-500. допинг сjс-1295 секретагоги гормона роста
Интерес к соединениям пептидной природы в качестве допинга и диетических добавок заметно возрос в последние несколько лет. Такой вывод можно сделать, проанализировав число интернет-запросов на эту тему, как это сделала Австралийская криминальная комиссия ACC (Australian crime commission) [5]. В своей работе АСС привела график роста числа интернет-запросов с названием одной из групп пептидов, вызывающей сейчас особый интерес у спортсменов, – РПГР – рилизинг пептид гормона роста (GHRP – growth hormone releasing peptide). Согласно приведенным данным, число интернет-запросов возросло более чем в пять раз за последние пять лет, и основные интернет-пользователи – жители Австралии и США.
Через онлайн-магазины можно приобрести целый ряд пептидов, гормонов и других соединений: СJС-1295, СJС-1295 DAC, GRF 1-29, Melatonan II, Follistatin 344, fragment HGH 176-191, MGF, PEG-MGF, IGF-1, Long-R3-IGF-1, R3-IGF-1, Des–(1-3)-IGF-1, TB-500 в виде жидкости для инъекций или порошка для растворения перед инъекцией. Пептидные препараты имеют широкий спектр действия. Например, GHRP стимулируют выработку гормона роста, способствуют усилению силовой и мышечной активности, ускоряют реабилитацию после травм. Повышенный уровень гормона роста обладает антивозрастным эффектом, компенсируя естественное снижение уровня этого гормона при старении. Некоторые соединения способствуют увеличению либидо и снижению веса, что делает их привлекательными не только для спортсменов.
Несмотря на общие представления о безвредном катаболизме пептидных соединений до простых аминокислот, прием подобных препаратов может вызвать реактивный ответ иммунной системы, в том числе и на возможные контаминирующие агенты. Применение GHRP может способствовать развитию ряда заболеваний, вызванных избыточной продукцией гормона роста, например рака. Показано, что в 2013 году от рецидива лимфомы Ходжкина, вызванного приемом пептидов СJС-1295 и GHRP-6, умер австралийский игрок в регби Джон Манна (John Mannah). Тем не менее пептиды становятся все более популярными среди спортсменов и молодежи еще и потому, что их безопасно можно приобрести – в отличие от анаболических стероидов, распространение и оборот которых наказывается наравне с наркотическими веществами. График динамики количества интернет-запросов нескольких потенциальных допинговых пептидов, составленный с помощью поискового сервиса Google (http://www.google.ru/trends/), приведен на рис.1.
Большинство из приведенных соединений пептидной природы не прошли клинические испытания и поэтому не разрешены к употреблению. Несмотря на это, их легко можно приобрести в специализированных интернет-магазинах по доступным ценам. Многие интернет-магазины предоставляют сертификаты на свою продукцию, однако проверку соответствия приложенных сертификатов и качества соединений никто не проводит, а препараты, как правило, маркируют как субстанции "только для лабораторных исследований".
В статье приведены результаты идентификации ряда доступных через интернет соединений пептидной природы, которые могут быть применены в качестве допинга. Как правило, они продаются в виде виал объемом 2 мл, внутри которых находится белая лиофилизированная субстанция. Содержимое виал исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР), позволяющим разделять и идентифицировать компоненты смеси анализируемых соединений, а также устанавливать особенности их структуры и строения. Идентификацию препаратов проводили на основании изотопного распределения многозарядных ионов пептидов, определения точных масс соединений, полученных с использованием орбитальной ионной ловушки, и спектров фрагментации в ионной ловушке.
Материалы и методы
Синтетические образцы GHRP-2, GHRP-6, Ipamorelin, СJС-1295, фрагмент HGH 176-191, MGF, PEG-MGF, Long-R3-IGF-1, Sermorelin, TB-500 были приобретены в различных интернет-магазинах. В работе использовали протеолитический фермент трипсин (Promega, США), деионизованную воду, полученную с помощью системы очистки и деионизации воды Integral 5 (Millipore, Франция), а также реактивы "хроматографической чистоты": ацетонитрил Super Gradient (Labscan, Германия), трифторуксусную кислоту (Sigma-Aldrich, США), муравьиную кислоту (Fluka, Швейцария) и ледяную уксусную кислоту (Merck, Германия).
Растворы каждого образца с концентрацией 10 мкг/мл готовили из лиофилизированного порошка, растворяя навески в соответствующем объеме 10% водного раствора ацетонитрила. Рабочие растворы пептидов получали разбавлением 0,1% уксусной кислотой до конечной концентрации 100 нг/мл. Растворы хранили при температуре –20°С не более 12 месяцев; рабочие растворы – не более 6 часов.
ВЭЖХ-МСВР анализ проводили с использованием хроматографа Surveyor (Thermo Finnigan, Германия) и гибридного масс-спектрометра высокого разрешения LTQ Orbitrap (Thermo Finnigan, Германия). Для хроматографического разделения компонентов смеси каждого образца применяли колонку Zorbax 300SB-C18, 50 × 1 мм, размер частиц 3 мкм (Agilent) с предколонкой Zorbax 300 SB-C8 Micro Bore Guard, 17 × 1 м, размер частиц 5 мкм. В качестве подвижных фаз использовали 0,1% раствор муравьиной кислоты (А) и 80% раствор ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислотой (В). Разделение компонентов смеси проводили градиентным элюированием: 20% В – 3 мин, линейное увеличение содержания буфера В до 100% в течение 32 мин, 100% В – 10 мин, линейное снижение содержания буфера В до 20% за 2 мин, 20% В – 10 мин для уравновешивания системы. Скорость потока составляла 70 мкл/мин. Температура термостата колонки 40°С.
Содержимое виал детектировали с использованием двух сегментов сканирования: режим полного сканирования и режим селективного мониторинга ионов аналитов для получения характеристичных спектров фрагментации. В режиме полного сканирования детектирование аналитов происходило в диапазоне масс 100–2000 Да с разрешением 30 000 (на половине высоты) и точностью определения масс 5 ppm. Скорость сканирования составляла 1 скан/с. В режиме селективного мониторинга ионов детектирование проводили в диапазоне масс 100–2000 Да с разрешением 1, энергии диссоциации 10–25 эВ. Температура фокусирующего капилляра составляла 250°С, скорость потока распыляющего газа (азот) была 0,75 л/мин; скорость потока вспомогательного газа (азот) – 0,095 л/мин.
Протеолитический гидролиз. Протеолитическое расщепление пептидных препаратов трипсином для получения фрагментов проводили согласно инструкции фирмы-производителя: навеску препарата разбавляли в буферном растворе Tris-HCl (pH 8,0), добавляли фермент трипсин в соотношении белок/фермент 25/1, тщательно перемешивали, инкубировали при 37°С в течение ночи. Протеолиз останавливали добавлением раствора трифторуксусной кислоты до конечной ее концентрации 0,5–1%, затем протеолитическую смесь центрифугировали 10 минут при 14000 об/мин. Идентификацию протеолитических фрагментов в надосадочной жидкости проводили методом ВЭЖХ-МС.
Результаты
Исследовали семнадцать образцов различных соединений: по два образца PEG-MGF, GHRP-2, GHRP-6, Ipamorelin; три образца фрагмента HGH 176-191; по одному образцу MGF, ТВ-500, Sermorelin, CJС-1295, Long-R3-IGF-1. Все образцы представляли собой лиофилизированные порошки белого цвета с разным размером частиц, упакованные в виалы по 2 и 5 мг. Некоторые виалы не имели фирменных этикеток.
Идентификацию каждого соединения проводили по единой схеме. В результате масс-спектрометрического исследования содержимого каждой виалы были получены масс-спектры высокого разрешения, по которым устанавливали точные массы соединений, обнаруженных в виалах, по формуле:
MW = (Mэксп · x) – x,
где x – заряд иона пептидного соединения, Mэксп – точная масса многозарядного иона с зарядом х.
Подтверждение структуры каждого образца проводили по спектру фрагментации, индуцированной соударениями в ионной ловушке с последующим детектированием полученных фрагментов в орбитальной ловушке. Предварительно рассчитывали теоретические соотношения m/z для фрагментарных ионов для каждого соединения. Сопоставляя экспериментальные значения m/z ионов-фрагментов с теоретическими, проводили идентификацию определяемых соединений.
Чистоту препарата оценивали с помощью ВЭЖХ-МСВР анализа по наличию пиков примесей. Полученные результаты заносили в таблицу для каждого соединения.
Sermorelin представляет собой фрагмент соматолиберина (рилизинг гормон гормона роста) со средней молекулярной массой 3357,8909 Да, состоящий из 29 аминокислотных остатков: YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR-NH2. Как и соматолиберин, Sermorelin стимулирует выработку гормона роста.
По результатам идентификации образца Sermorelin из интернет-магазина (табл.1) можно сделать вывод, что препарат совпадает по структуре с заявленным рилизинг-гормоном гормона роста Sermorelin.
CJС-1295 представляет собой модифицированный аналог рилизинг гормон гормона роста со средней молекулярной массой 3367,9046 Да, состоящий из 29 аминокислотных остатков: YADAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILSR-NH2. CJС-1295 так же, как и Sermorelin, стимулирует выработку и высвобождение гормона роста.
Ниже представлены результаты идентификации образца CJС-1295 из интернет-магазина (табл.2). Проведенный анализ подтверждает, что препарат CJС-1295 совпадает по структуре с заявленным рилизинг-гормоном гормона роста CJC-1295.
Рилизинг пептид гормона роста 2 (GHRP-2) состоит из шести аминокислотных остатков, два из которых не являются природными – это искусственная аминокислота (D-β-нафтилаланин, nA) и D-аминокислота аланин (D-A). Структурная формула GHRP-2 A(nA)(D-A)WFK-NH2. Средняя молекулярная масса соединения составляет 817,4275 Да. GHRP-2 – пептидный агонист рецептора грелина, при связывании с которым происходит стимуляция высвобождения гормона роста из гипофиза. В работе [6] отмечено, что при приеме GHRP-2 в комбинации с аргинином происходит усиленная стимуляция высвобождения гормона роста. В табл.3 представлены результаты идентификации двух образцов GHRP-2, приобретенных с помощью интернета.
По результатам идентификации образцов, приобретенных в интернет-магазинах препаратов GHRP-2, можно сделать вывод, что исследуемые образцы совпадают по структуре с пептидом GHRP-2, однако стоит отметить присутствие примесей в обоих случаях (рис.2).
Рилизинг пептид гормона роста 6 (GHRP-6) состоит из шести аминокислотных остатков, два из которых являются D-аминокислотами: триптофан (D-W) и фенилаланин (D-F). Его структурная формула H(D-W)AW(D-F)K-NH2. GHRP-6, как и GHRP-2, является одним из пептидных агонистов рецептора грелина. Средняя молекулярная масса соединения составляет 872,4446 Да. Результаты идентификации образцов GHRP-6, приобретенных через интернет, представлены в табл.4.
Результаты исследования содержимого виал показали соответствие содержимого пептиду GHRP-6, однако препараты содержали значительное количество примесей. Пример масс-хроматограммы препарата GHRP-6 (2) представлен на рис.3.
Рилизинг пептид гормона роста Ipamorelin – пептид "нового поколения", в состав которого входят две искусственные аминокислоты (2-аминоизобутиловая аминокислота, Aib и D-β-нафтилаланин, nA). Его структурная формула (Aib)H(nA)FK-NH2. Средняя молекулярная масса соединения составляет 711,3850 Да. Одно из возможных объяснений повышенного интереса к этому потенциальному допингу состоит в его способности повышать выработку соматотропина, не влияя на волновой (циркадный) характер выброса гормона роста – в отличие от ранее описанных GHRP-2 и GHRP-6.
Результаты идентификации представлены в табл.5. Определенная в ходе анализа молекулярная масса препарата не совпала с ожидаемой массой Ipamorelin в обеих приобретенных виалах. Согласно данным по определению соединений из группы GHRP, включая Ipamorelin [7], полученные фрагментные ионы также не принадлежат молекуле Ipamorelin. Профили фрагментации выбранных ионов-прекурсоров указывают на то, что основное соединение в первой виале – Sermorelin, во второй – CJС-1295.
Тимозин бета ТВ-500 – синтетический аналог человеческого тимозина бета 4, состоящий из 43 аминокислотных остатков: SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES. Средняя молекулярная масса соединения составляет 4921,4158 Да. Препарат был разработан для лечения последствий острого инфаркта миокарда и восстановления неврологической функции, например в случае рассеянного склероза. ТB-500 оказывает антиапоптотическое и противовоспалительное действие, способствует миграции клеток и пролиферации стволовых клеток, быстрому заживлению ран.
В ходе идентификации с помощью масс-спектрометрического анализа обнаружены характеристичные фрагменты тимозина бета 4 – у5, y6, y15, y15-H2O, y17 (см. табл.6).
Однако масса основного компонента препарата превышала на 42 Да расчетную массу ТB-500. Была выдвинута гипотеза, что исследуемое соединение является тимозином бета 4, но в его структуре присутствует пост-трансляционная модификация, ацилирование, которая увеличивает массу молекулы на 42 Да. Для подтверждения данной гипотезы был проведен трипсинолиз препарата с последующим анализом полученных протеолитических фрагментов методом масс-спектрометрии высокого разрешения. Показано, что масса триптических пептидов, перекрывающих область молекулы тимозина бета 4 с 15 по 43 аминокислотный остаток, совпадает с расчетной массой для молекулы тимозина бета 4. Кроме того, обнаружен двухзарядный интенсивный ион с массой, отличающейся от массы пептида, перекрывающего последовательность молекулы тимозина бета 4 с 1 по 14, на 42 Да. Из литературных данных известно, что при синтезе молекулы тимозина бета 4 может происходить ацилирование остатков серина в первом положении и/или лизинов в 3, 11, 25, 31 и 38 положениях. Для установления точного положения модификации (1-е, 3-е или 11-е) была дополнительно проведена фрагментация двухзарядного иона с m/z 847,9009. Масс-спектр высокого разрешения, полученный при фрагментации этого фрагмента, представлен на рис.4.
Анализ масс-спектральных данных показал, что прибавку в массе на 42 Да несет в себе остаток серина на N-конце полипептидной цепи. Следовательно, молекула ТB-500 ацилирована по серину в первом положении. Результаты идентификации характеристичных фрагментов триптического пептида ТБ-500 SDKPDMAEIEKFDK представлены в табл.7.
По результатам проведенного анализа препарата ТВ-500 сделан вывод о том, что исследуемый препарат ТВ-500 совпадает по структуре с фрагментом белка тимозин бета 4 и ацилирован по N-концу полипептидной цепи.
Фрагмент гормона роста HGH 176-191, средняя молекулярная масса 1815,8760 Да, представляет собой активный фрагмент человеческого гормона роста, состоящий из 16 аминокислотных остатков (с 176 по 191 аминокислотного остатка полипептидной цепи гормона роста). Его структурная формула YLRIVQCRSVEGSCGF. HGH 176-191 стимулирует сжигание жира (липолиз), и замедляет липогенез (формирование жирных кислот), способствуя снижению количества жировой ткани.
Проведена идентификация трех образцов данного препарата, купленных через интернет-магазины. По результатам исследования сделан вывод, что во всех трех виалах структура основного компонента совпадала со структурой фрагмента гормона роста 176-191, однако все образцы содержали примесные соединения. Результаты приведены в табл.8.
Модифицированный инсулино-подобный фактор роста-1 (Long-R3-IGF-1) – это рекомбинантный аналог человеческого инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), обладающий большей биологической активностью и большим временем полураспада по сравнению с природным IGF-1. Long-R3-IGF-1 состоит из 83 аминокислотных остатков: MFPAMPLSSLFVNGPRTL-CGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA. Средняя молекулярная масса соединения составляет 9105,35 Да. IGF-1 по структуре похож на гормон инсулин, однако имеет свой специфический рецептор IGF1R, присутствующий на многих клетках разных типов тканей: мышечных, нервных, клетках печени, почек, костей. Он стимулирует рост и пролиферацию клеток, являясь мощным ингибитором апоптоза.
Результаты анализа образца Long-R3-IGF-1, купленного в интернет-магазине, показали отсутствие заявленного препарата.
Механический фактор роста (Mechano Growth Factor, MGF) представляет собой сплайсинговую форму гена IGF-1 с измененной последовательностью С-конца молекулы. Его структурная формула YQPPSTNKNTKSQRRKGSTFEERK, средняя молекулярная масса 2868,1396 Да. При физических упражнениях и локальных мышечных повреждениях MGF способствует активированию и восполнению пула мышечных стволовых клеток-сателлитов, тем самым способствуя восстановлению и развитию поврежденных мышечных волокон [8].
По результатам идентификации образца MGF из интернет-магазина можно сделать вывод о том, что исследуемый препарат обладает структурой, идентичной структуре механического фактора роста (табл.9).
Пэгелированный механический фактор роста PEG-MGF получают путем пэгилирования – присоединения остатка полиэтиленгликоля (ПЭГ, PEG). Благодаря повышению гидфрофильности молекулы повышается биодоступность MGF. Структура препарата – YQPPSTNKNTKSQRRKGSTFEERK-PEG. Средняя молекулярная масса зависит от молекулярного веса присоединенного остатка PEG. PEG-MGF обладает большим периодом полураспада, что позволяет значительно снизить дозу и частоту инъекций препарата.
Проведен анализ двух образцов PEG-MGF, купленных в интернет-магазинах. Согласно полученным данным, в одной из виал заявленный препарат обнаружен не был, во второй виале основным соединением был рилизинг пептид гормона роста 2 (GHRP-2). Результаты анализа представлены в табл.10.
Заключение
В ходе работы проанализированы семнадцать образцов разных пептидных препаратов, приобретенных в интернет-магазинах на территории РФ: PEG-MGF, GHRP-2, GHRP-6 и Ipamorelin (двух различных фирм-производителей каждого соединения), три различных образца фрагмента гормона роста 176-191 и по одному образцу MGF, ТВ-500, Sermorelin, CJС-1295 и Long-R3-IGF-1. Результаты анализа показали, что большая часть препаратов не обладала высокой степенью очистки, многие содержали примесные компоненты. В работе не проводилась идентификация примесей, поэтому природа и источник этих соединений, а также их возможные последствия для жизни и здоровья потребителя остаются неизученными. Возможно, это побочные продукты синтеза пептидных соединений или их деградации при хранении. Также в ходе работы установлено несоответствие содержимого виал заявленной маркировке для образцов препаратов Ipamorelin (вместо заявленного соединения были Sermorelin и СJC-1295) и PEG-MGF (в одной из виал вместо PEG-MGF был GHRP-2). При идентификации содержимого виал с Long-R3-IGF-1 и одной из виал PEG-MGF заявленные соединения обнаружены не были ("пустышки").
литературА:
1. Cox H., Eichner D. Detection of human insulin-like growth factor-1 in deer antler velvet supplements. Rapid Commun Mass Spectrom. – 2013, v.27(19), p.2170–2178.
2. Esposito S., Deventer K., Goeman J., Van der Eycken J., Van Eenoo P. Synthesis and characterization of the N-terminal acetylated 17-23 fragment of thymosin beta 4 identified in TB-500, a product suspected to possess doping potential. – Drug Test Anal., 2012, v.4(9), p.733–738.
3. Esposito S., Deventer K., Van Eenoo P. Characterization and identification of a C-terminal amidated mechano growth factor (MGF) analogue in black market products. – Rapid Commun Mass Spectrom., 2012, v.26(6), p.686–692.
4. Thomas A., Kohler M., Mester J., Geyer H., Schänzer W., Petrou M., Thevis M. Identification of the growth-hormone-releasing peptide-2 (GHRP-2) in a nutritional supplement. – Drug Test Anal., 2010, v.2(3), p.144–148.
5. Organized crime and drugs in sport. New Generation performance and Image Enhancing Drugs and Organized Criminal Involvement in their use in Professional Sport. 140-2012/13/SA // https://www.crimecommission.gov.au/sites/default/files/13-4-Doc1-Strategic-Assesment.pdf.
6. Veldhuis J.D., Keenan D.M., Bailey J.N., Miles J.M., Bowers C.Y. Preservation of GHRH and GH-releasing peptide-2 efficacy in young men with experimentally induced hypogonadism. – Eur J Endocrinol., 2009, Aug, v.161(2), p.293–300.
7. Thomas A., Delahaut P., Krug O., Schänzer W., Thevis M. Metabolism of growth hormone releasing peptides . Anal Chem., 2012, v.84(23), p.10252–10259.
8. Goldspink G. Research on mechano growth factor: its potential for optimizing physical training as well as misuse in doping.–Br J Sports Med., 2005, Nov, v.39(11), p.787–788.
Через онлайн-магазины можно приобрести целый ряд пептидов, гормонов и других соединений: СJС-1295, СJС-1295 DAC, GRF 1-29, Melatonan II, Follistatin 344, fragment HGH 176-191, MGF, PEG-MGF, IGF-1, Long-R3-IGF-1, R3-IGF-1, Des–(1-3)-IGF-1, TB-500 в виде жидкости для инъекций или порошка для растворения перед инъекцией. Пептидные препараты имеют широкий спектр действия. Например, GHRP стимулируют выработку гормона роста, способствуют усилению силовой и мышечной активности, ускоряют реабилитацию после травм. Повышенный уровень гормона роста обладает антивозрастным эффектом, компенсируя естественное снижение уровня этого гормона при старении. Некоторые соединения способствуют увеличению либидо и снижению веса, что делает их привлекательными не только для спортсменов.
Несмотря на общие представления о безвредном катаболизме пептидных соединений до простых аминокислот, прием подобных препаратов может вызвать реактивный ответ иммунной системы, в том числе и на возможные контаминирующие агенты. Применение GHRP может способствовать развитию ряда заболеваний, вызванных избыточной продукцией гормона роста, например рака. Показано, что в 2013 году от рецидива лимфомы Ходжкина, вызванного приемом пептидов СJС-1295 и GHRP-6, умер австралийский игрок в регби Джон Манна (John Mannah). Тем не менее пептиды становятся все более популярными среди спортсменов и молодежи еще и потому, что их безопасно можно приобрести – в отличие от анаболических стероидов, распространение и оборот которых наказывается наравне с наркотическими веществами. График динамики количества интернет-запросов нескольких потенциальных допинговых пептидов, составленный с помощью поискового сервиса Google (http://www.google.ru/trends/), приведен на рис.1.
Большинство из приведенных соединений пептидной природы не прошли клинические испытания и поэтому не разрешены к употреблению. Несмотря на это, их легко можно приобрести в специализированных интернет-магазинах по доступным ценам. Многие интернет-магазины предоставляют сертификаты на свою продукцию, однако проверку соответствия приложенных сертификатов и качества соединений никто не проводит, а препараты, как правило, маркируют как субстанции "только для лабораторных исследований".
В статье приведены результаты идентификации ряда доступных через интернет соединений пептидной природы, которые могут быть применены в качестве допинга. Как правило, они продаются в виде виал объемом 2 мл, внутри которых находится белая лиофилизированная субстанция. Содержимое виал исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР), позволяющим разделять и идентифицировать компоненты смеси анализируемых соединений, а также устанавливать особенности их структуры и строения. Идентификацию препаратов проводили на основании изотопного распределения многозарядных ионов пептидов, определения точных масс соединений, полученных с использованием орбитальной ионной ловушки, и спектров фрагментации в ионной ловушке.
Материалы и методы
Синтетические образцы GHRP-2, GHRP-6, Ipamorelin, СJС-1295, фрагмент HGH 176-191, MGF, PEG-MGF, Long-R3-IGF-1, Sermorelin, TB-500 были приобретены в различных интернет-магазинах. В работе использовали протеолитический фермент трипсин (Promega, США), деионизованную воду, полученную с помощью системы очистки и деионизации воды Integral 5 (Millipore, Франция), а также реактивы "хроматографической чистоты": ацетонитрил Super Gradient (Labscan, Германия), трифторуксусную кислоту (Sigma-Aldrich, США), муравьиную кислоту (Fluka, Швейцария) и ледяную уксусную кислоту (Merck, Германия).
Растворы каждого образца с концентрацией 10 мкг/мл готовили из лиофилизированного порошка, растворяя навески в соответствующем объеме 10% водного раствора ацетонитрила. Рабочие растворы пептидов получали разбавлением 0,1% уксусной кислотой до конечной концентрации 100 нг/мл. Растворы хранили при температуре –20°С не более 12 месяцев; рабочие растворы – не более 6 часов.
ВЭЖХ-МСВР анализ проводили с использованием хроматографа Surveyor (Thermo Finnigan, Германия) и гибридного масс-спектрометра высокого разрешения LTQ Orbitrap (Thermo Finnigan, Германия). Для хроматографического разделения компонентов смеси каждого образца применяли колонку Zorbax 300SB-C18, 50 × 1 мм, размер частиц 3 мкм (Agilent) с предколонкой Zorbax 300 SB-C8 Micro Bore Guard, 17 × 1 м, размер частиц 5 мкм. В качестве подвижных фаз использовали 0,1% раствор муравьиной кислоты (А) и 80% раствор ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислотой (В). Разделение компонентов смеси проводили градиентным элюированием: 20% В – 3 мин, линейное увеличение содержания буфера В до 100% в течение 32 мин, 100% В – 10 мин, линейное снижение содержания буфера В до 20% за 2 мин, 20% В – 10 мин для уравновешивания системы. Скорость потока составляла 70 мкл/мин. Температура термостата колонки 40°С.
Содержимое виал детектировали с использованием двух сегментов сканирования: режим полного сканирования и режим селективного мониторинга ионов аналитов для получения характеристичных спектров фрагментации. В режиме полного сканирования детектирование аналитов происходило в диапазоне масс 100–2000 Да с разрешением 30 000 (на половине высоты) и точностью определения масс 5 ppm. Скорость сканирования составляла 1 скан/с. В режиме селективного мониторинга ионов детектирование проводили в диапазоне масс 100–2000 Да с разрешением 1, энергии диссоциации 10–25 эВ. Температура фокусирующего капилляра составляла 250°С, скорость потока распыляющего газа (азот) была 0,75 л/мин; скорость потока вспомогательного газа (азот) – 0,095 л/мин.
Протеолитический гидролиз. Протеолитическое расщепление пептидных препаратов трипсином для получения фрагментов проводили согласно инструкции фирмы-производителя: навеску препарата разбавляли в буферном растворе Tris-HCl (pH 8,0), добавляли фермент трипсин в соотношении белок/фермент 25/1, тщательно перемешивали, инкубировали при 37°С в течение ночи. Протеолиз останавливали добавлением раствора трифторуксусной кислоты до конечной ее концентрации 0,5–1%, затем протеолитическую смесь центрифугировали 10 минут при 14000 об/мин. Идентификацию протеолитических фрагментов в надосадочной жидкости проводили методом ВЭЖХ-МС.
Результаты
Исследовали семнадцать образцов различных соединений: по два образца PEG-MGF, GHRP-2, GHRP-6, Ipamorelin; три образца фрагмента HGH 176-191; по одному образцу MGF, ТВ-500, Sermorelin, CJС-1295, Long-R3-IGF-1. Все образцы представляли собой лиофилизированные порошки белого цвета с разным размером частиц, упакованные в виалы по 2 и 5 мг. Некоторые виалы не имели фирменных этикеток.
Идентификацию каждого соединения проводили по единой схеме. В результате масс-спектрометрического исследования содержимого каждой виалы были получены масс-спектры высокого разрешения, по которым устанавливали точные массы соединений, обнаруженных в виалах, по формуле:
MW = (Mэксп · x) – x,
где x – заряд иона пептидного соединения, Mэксп – точная масса многозарядного иона с зарядом х.
Подтверждение структуры каждого образца проводили по спектру фрагментации, индуцированной соударениями в ионной ловушке с последующим детектированием полученных фрагментов в орбитальной ловушке. Предварительно рассчитывали теоретические соотношения m/z для фрагментарных ионов для каждого соединения. Сопоставляя экспериментальные значения m/z ионов-фрагментов с теоретическими, проводили идентификацию определяемых соединений.
Чистоту препарата оценивали с помощью ВЭЖХ-МСВР анализа по наличию пиков примесей. Полученные результаты заносили в таблицу для каждого соединения.
Sermorelin представляет собой фрагмент соматолиберина (рилизинг гормон гормона роста) со средней молекулярной массой 3357,8909 Да, состоящий из 29 аминокислотных остатков: YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR-NH2. Как и соматолиберин, Sermorelin стимулирует выработку гормона роста.
По результатам идентификации образца Sermorelin из интернет-магазина (табл.1) можно сделать вывод, что препарат совпадает по структуре с заявленным рилизинг-гормоном гормона роста Sermorelin.
CJС-1295 представляет собой модифицированный аналог рилизинг гормон гормона роста со средней молекулярной массой 3367,9046 Да, состоящий из 29 аминокислотных остатков: YADAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILSR-NH2. CJС-1295 так же, как и Sermorelin, стимулирует выработку и высвобождение гормона роста.
Ниже представлены результаты идентификации образца CJС-1295 из интернет-магазина (табл.2). Проведенный анализ подтверждает, что препарат CJС-1295 совпадает по структуре с заявленным рилизинг-гормоном гормона роста CJC-1295.
Рилизинг пептид гормона роста 2 (GHRP-2) состоит из шести аминокислотных остатков, два из которых не являются природными – это искусственная аминокислота (D-β-нафтилаланин, nA) и D-аминокислота аланин (D-A). Структурная формула GHRP-2 A(nA)(D-A)WFK-NH2. Средняя молекулярная масса соединения составляет 817,4275 Да. GHRP-2 – пептидный агонист рецептора грелина, при связывании с которым происходит стимуляция высвобождения гормона роста из гипофиза. В работе [6] отмечено, что при приеме GHRP-2 в комбинации с аргинином происходит усиленная стимуляция высвобождения гормона роста. В табл.3 представлены результаты идентификации двух образцов GHRP-2, приобретенных с помощью интернета.
По результатам идентификации образцов, приобретенных в интернет-магазинах препаратов GHRP-2, можно сделать вывод, что исследуемые образцы совпадают по структуре с пептидом GHRP-2, однако стоит отметить присутствие примесей в обоих случаях (рис.2).
Рилизинг пептид гормона роста 6 (GHRP-6) состоит из шести аминокислотных остатков, два из которых являются D-аминокислотами: триптофан (D-W) и фенилаланин (D-F). Его структурная формула H(D-W)AW(D-F)K-NH2. GHRP-6, как и GHRP-2, является одним из пептидных агонистов рецептора грелина. Средняя молекулярная масса соединения составляет 872,4446 Да. Результаты идентификации образцов GHRP-6, приобретенных через интернет, представлены в табл.4.
Результаты исследования содержимого виал показали соответствие содержимого пептиду GHRP-6, однако препараты содержали значительное количество примесей. Пример масс-хроматограммы препарата GHRP-6 (2) представлен на рис.3.
Рилизинг пептид гормона роста Ipamorelin – пептид "нового поколения", в состав которого входят две искусственные аминокислоты (2-аминоизобутиловая аминокислота, Aib и D-β-нафтилаланин, nA). Его структурная формула (Aib)H(nA)FK-NH2. Средняя молекулярная масса соединения составляет 711,3850 Да. Одно из возможных объяснений повышенного интереса к этому потенциальному допингу состоит в его способности повышать выработку соматотропина, не влияя на волновой (циркадный) характер выброса гормона роста – в отличие от ранее описанных GHRP-2 и GHRP-6.
Результаты идентификации представлены в табл.5. Определенная в ходе анализа молекулярная масса препарата не совпала с ожидаемой массой Ipamorelin в обеих приобретенных виалах. Согласно данным по определению соединений из группы GHRP, включая Ipamorelin [7], полученные фрагментные ионы также не принадлежат молекуле Ipamorelin. Профили фрагментации выбранных ионов-прекурсоров указывают на то, что основное соединение в первой виале – Sermorelin, во второй – CJС-1295.
Тимозин бета ТВ-500 – синтетический аналог человеческого тимозина бета 4, состоящий из 43 аминокислотных остатков: SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES. Средняя молекулярная масса соединения составляет 4921,4158 Да. Препарат был разработан для лечения последствий острого инфаркта миокарда и восстановления неврологической функции, например в случае рассеянного склероза. ТB-500 оказывает антиапоптотическое и противовоспалительное действие, способствует миграции клеток и пролиферации стволовых клеток, быстрому заживлению ран.
В ходе идентификации с помощью масс-спектрометрического анализа обнаружены характеристичные фрагменты тимозина бета 4 – у5, y6, y15, y15-H2O, y17 (см. табл.6).
Однако масса основного компонента препарата превышала на 42 Да расчетную массу ТB-500. Была выдвинута гипотеза, что исследуемое соединение является тимозином бета 4, но в его структуре присутствует пост-трансляционная модификация, ацилирование, которая увеличивает массу молекулы на 42 Да. Для подтверждения данной гипотезы был проведен трипсинолиз препарата с последующим анализом полученных протеолитических фрагментов методом масс-спектрометрии высокого разрешения. Показано, что масса триптических пептидов, перекрывающих область молекулы тимозина бета 4 с 15 по 43 аминокислотный остаток, совпадает с расчетной массой для молекулы тимозина бета 4. Кроме того, обнаружен двухзарядный интенсивный ион с массой, отличающейся от массы пептида, перекрывающего последовательность молекулы тимозина бета 4 с 1 по 14, на 42 Да. Из литературных данных известно, что при синтезе молекулы тимозина бета 4 может происходить ацилирование остатков серина в первом положении и/или лизинов в 3, 11, 25, 31 и 38 положениях. Для установления точного положения модификации (1-е, 3-е или 11-е) была дополнительно проведена фрагментация двухзарядного иона с m/z 847,9009. Масс-спектр высокого разрешения, полученный при фрагментации этого фрагмента, представлен на рис.4.
Анализ масс-спектральных данных показал, что прибавку в массе на 42 Да несет в себе остаток серина на N-конце полипептидной цепи. Следовательно, молекула ТB-500 ацилирована по серину в первом положении. Результаты идентификации характеристичных фрагментов триптического пептида ТБ-500 SDKPDMAEIEKFDK представлены в табл.7.
По результатам проведенного анализа препарата ТВ-500 сделан вывод о том, что исследуемый препарат ТВ-500 совпадает по структуре с фрагментом белка тимозин бета 4 и ацилирован по N-концу полипептидной цепи.
Фрагмент гормона роста HGH 176-191, средняя молекулярная масса 1815,8760 Да, представляет собой активный фрагмент человеческого гормона роста, состоящий из 16 аминокислотных остатков (с 176 по 191 аминокислотного остатка полипептидной цепи гормона роста). Его структурная формула YLRIVQCRSVEGSCGF. HGH 176-191 стимулирует сжигание жира (липолиз), и замедляет липогенез (формирование жирных кислот), способствуя снижению количества жировой ткани.
Проведена идентификация трех образцов данного препарата, купленных через интернет-магазины. По результатам исследования сделан вывод, что во всех трех виалах структура основного компонента совпадала со структурой фрагмента гормона роста 176-191, однако все образцы содержали примесные соединения. Результаты приведены в табл.8.
Модифицированный инсулино-подобный фактор роста-1 (Long-R3-IGF-1) – это рекомбинантный аналог человеческого инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), обладающий большей биологической активностью и большим временем полураспада по сравнению с природным IGF-1. Long-R3-IGF-1 состоит из 83 аминокислотных остатков: MFPAMPLSSLFVNGPRTL-CGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA. Средняя молекулярная масса соединения составляет 9105,35 Да. IGF-1 по структуре похож на гормон инсулин, однако имеет свой специфический рецептор IGF1R, присутствующий на многих клетках разных типов тканей: мышечных, нервных, клетках печени, почек, костей. Он стимулирует рост и пролиферацию клеток, являясь мощным ингибитором апоптоза.
Результаты анализа образца Long-R3-IGF-1, купленного в интернет-магазине, показали отсутствие заявленного препарата.
Механический фактор роста (Mechano Growth Factor, MGF) представляет собой сплайсинговую форму гена IGF-1 с измененной последовательностью С-конца молекулы. Его структурная формула YQPPSTNKNTKSQRRKGSTFEERK, средняя молекулярная масса 2868,1396 Да. При физических упражнениях и локальных мышечных повреждениях MGF способствует активированию и восполнению пула мышечных стволовых клеток-сателлитов, тем самым способствуя восстановлению и развитию поврежденных мышечных волокон [8].
По результатам идентификации образца MGF из интернет-магазина можно сделать вывод о том, что исследуемый препарат обладает структурой, идентичной структуре механического фактора роста (табл.9).
Пэгелированный механический фактор роста PEG-MGF получают путем пэгилирования – присоединения остатка полиэтиленгликоля (ПЭГ, PEG). Благодаря повышению гидфрофильности молекулы повышается биодоступность MGF. Структура препарата – YQPPSTNKNTKSQRRKGSTFEERK-PEG. Средняя молекулярная масса зависит от молекулярного веса присоединенного остатка PEG. PEG-MGF обладает большим периодом полураспада, что позволяет значительно снизить дозу и частоту инъекций препарата.
Проведен анализ двух образцов PEG-MGF, купленных в интернет-магазинах. Согласно полученным данным, в одной из виал заявленный препарат обнаружен не был, во второй виале основным соединением был рилизинг пептид гормона роста 2 (GHRP-2). Результаты анализа представлены в табл.10.
Заключение
В ходе работы проанализированы семнадцать образцов разных пептидных препаратов, приобретенных в интернет-магазинах на территории РФ: PEG-MGF, GHRP-2, GHRP-6 и Ipamorelin (двух различных фирм-производителей каждого соединения), три различных образца фрагмента гормона роста 176-191 и по одному образцу MGF, ТВ-500, Sermorelin, CJС-1295 и Long-R3-IGF-1. Результаты анализа показали, что большая часть препаратов не обладала высокой степенью очистки, многие содержали примесные компоненты. В работе не проводилась идентификация примесей, поэтому природа и источник этих соединений, а также их возможные последствия для жизни и здоровья потребителя остаются неизученными. Возможно, это побочные продукты синтеза пептидных соединений или их деградации при хранении. Также в ходе работы установлено несоответствие содержимого виал заявленной маркировке для образцов препаратов Ipamorelin (вместо заявленного соединения были Sermorelin и СJC-1295) и PEG-MGF (в одной из виал вместо PEG-MGF был GHRP-2). При идентификации содержимого виал с Long-R3-IGF-1 и одной из виал PEG-MGF заявленные соединения обнаружены не были ("пустышки").
литературА:
1. Cox H., Eichner D. Detection of human insulin-like growth factor-1 in deer antler velvet supplements. Rapid Commun Mass Spectrom. – 2013, v.27(19), p.2170–2178.
2. Esposito S., Deventer K., Goeman J., Van der Eycken J., Van Eenoo P. Synthesis and characterization of the N-terminal acetylated 17-23 fragment of thymosin beta 4 identified in TB-500, a product suspected to possess doping potential. – Drug Test Anal., 2012, v.4(9), p.733–738.
3. Esposito S., Deventer K., Van Eenoo P. Characterization and identification of a C-terminal amidated mechano growth factor (MGF) analogue in black market products. – Rapid Commun Mass Spectrom., 2012, v.26(6), p.686–692.
4. Thomas A., Kohler M., Mester J., Geyer H., Schänzer W., Petrou M., Thevis M. Identification of the growth-hormone-releasing peptide-2 (GHRP-2) in a nutritional supplement. – Drug Test Anal., 2010, v.2(3), p.144–148.
5. Organized crime and drugs in sport. New Generation performance and Image Enhancing Drugs and Organized Criminal Involvement in their use in Professional Sport. 140-2012/13/SA // https://www.crimecommission.gov.au/sites/default/files/13-4-Doc1-Strategic-Assesment.pdf.
6. Veldhuis J.D., Keenan D.M., Bailey J.N., Miles J.M., Bowers C.Y. Preservation of GHRH and GH-releasing peptide-2 efficacy in young men with experimentally induced hypogonadism. – Eur J Endocrinol., 2009, Aug, v.161(2), p.293–300.
7. Thomas A., Delahaut P., Krug O., Schänzer W., Thevis M. Metabolism of growth hormone releasing peptides . Anal Chem., 2012, v.84(23), p.10252–10259.
8. Goldspink G. Research on mechano growth factor: its potential for optimizing physical training as well as misuse in doping.–Br J Sports Med., 2005, Nov, v.39(11), p.787–788.
Отзывы читателей
