eng
Выпуск #3/2014
Р.Герасимов
All ions MS/MS: новый метод скрининга для жидкостных масс-спектрометров высокого разрешения компании Agilent
All ions MS/MS: новый метод скрининга для жидкостных масс-спектрометров высокого разрешения компании Agilent
Просмотры: 2795
Методика All Ions MS/MS доступна на времяпролетных и квадрупольно-времяпролетных масс-спектрометрах высокого разрешения компании Agilent. В рамках этой методики для идентификации соединений используются собственные персональные библиотеки точных масс компании Agilent (PCDL) со сведениями о молекулярных и фрагментных ионах. Библиотеки PCDL с богатым информационным наполнением включают сведения о точно измеренных массах тысяч соединений. Внедрение инструментальных средств обработки All Ions MS/MS в ПО MassHunter обеспечивает точную идентификацию соединений с возможностью удобного просмотра. В результате алгоритм All Ions MS/MS позволяет уменьшить время, затрачиваемое на настройку методик, улучшить производительность и проводить достоверный высокочувствительный количественный и качественный анализ на одном приборе в одном аналитическом цикле.
Теги: hplc ms/ms analysis quantitative and qualitative analysis screening вэжх количественный и качественный анализ мс/мс скрининг
Идентификация посредством корреляции между ионами-предшественниками и фрагментными ионами
В методике All Ions MS/MS сбор данных по точно измеренным массам с высоким разрешением (HRAM) осуществляется при разных условиях. В одних случаях при низком значении энергии соударений, в других – при одном или нескольких высоких значениях энергии. Низкоэнергетические спектры преимущественно отображают только молекулярные ионы (или ионы-предшественники) соединений, тогда как высокоэнергетические – ионы-предшественники и их фрагментные ионы.
Этот аналитический метод легко настраивается с помощью ПО MassHunter Workstation Acquisition для времяпролетных и квадрупольно-времяпролетных приборов (начиная с версии B.05.01). На рис.1 показана новая возможность в ПО для сбора данных: поле Experiment #, в котором допускается использование разных значений параметров в рамках одного временного сегмента. Например, можно настроить для первого эксперимента энергию соударений 0 В, а для второго и третьего экспериментов – энергии соударений 20 и 40 В соответственно.
При изменении напряжения на фрагментационной ячейке или энергии соударений создается файл данных с низкоэнергетическим каналом, который содержит преимущественно ионы-предшественники, и одним или несколькими высокоэнергетическими каналами, которые содержат ионы-предшественники и фрагментные ионы. На рис.2а показан спектр симазина с энергией соударения 0 В, в котором присутствует заметный пик иона-предшественника при m/z 202,08584. На рис.2б изображен усредненный спектр с энергиями 20 и 40 В, содержащий ион-предшественник и несколько фрагментных ионов.
Режим All Ions MS/MS в ПО MassHunter Qualitative Analysis выполняет корреляцию между профилем элюирования иона-предшественника в низкоэнергетическом канале и фрагментами, созданными при более высоких энергиях. Например, на рис.3 показан предшественник (красный) и фрагмент со значением m/z 132,03221 с квалифицирующим соэлюированием (зеленый). Это достигается с помощью сведений о фрагментах из библиотеки Agilent PCDL, которая содержит МС/МС спектры, полученные при разных значениях энергии соударений [1]. Кроме того, библиотеки PCDL включают сведения о соединении: название, формулу, точно измеренную массу, структуру и идентификаторы базы данных, например номер CAS. Библиотека PCDL используется для выбора возможных фрагментных ионов, для которых затем анализируется соэлюирование с ионом-предшественником.
Поиск по формуле
Методика All Ions MS/MS является расширением уникального алгоритма поиска по формуле (Find by Formula или FBF) в ПО MassHunter Qualitative Analysis (рис.4). Алгоритм поиска по формуле использует в качестве отправной точки формулу соединения (например, из PCDL) и рассчитывает моноизотопную массу и соотношение изобарных пиков. Затем из файла данных на основе наиболее распространенных изотопов извлекаются хроматограммы по выделенному иону (EIC) для каждого выбранного носителя заряда и средние спектры из первых 50% проинтегрированных пиков. Таким образом, если соединение присутствует в файле данных, оно должно отображаться в виде хроматографического пика для каждого из своих основных молекулярных ионов.
Извлеченные из пика масс-спектры исследуются для обнаружения возможных кандидатов на основе брутто-формулы соединения. Для каждого кандидата рассчитывается вероятностная оценка соответствия на основе его массы, соотношения изобарных пиков и интервала между ними (рис.5). Если соединение проходит фильтр по оценке соответствия, оно помечается как идентифицированное. Алгоритм поиска по формуле является быстрым и может проверять файл данных по базам точно измеренных масс (CSV, PCD или PCDL), которые содержат тысячи формул, за несколько минут.
Подтверждение фрагмента
В методике All Ions MS/MS алгоритм поиска по формуле усовершенствован благодаря дополнительному шагу подтверждения фрагмента с использованием одного или нескольких высокоэнергетических каналов. Если для соединения существует хотя бы один спектр МС/МС в библиотеке PCDL, наиболее распространенные ионы-продукты в библиотечных спектрах извлекаются в виде EIC из соответствующего высокоэнергетического канала. Например, на рис.6а показан библиотечный спектр МС/МС симазина при энергии соударения 20 В из библиотеки пестицидов PCDL. На рис.6б приведен высокоэнергетический спектр пробы, которая содержит симазин. Используя библиотеку PCDL, программе удалось определить фрагменты при значениях m/z 104,00 и 132,03, несмотря на наличие посторонних ионов с большей интенсивностью сигнала при m/z 94,04 и 121,05.
Фрагменты из спектров МС/МС в библиотеке PCDL извлекаются в виде EIC и налагаются на EIC иона-предшественника. Если в библиотеке PCDL отсутствуют МС/МС спектры для соединения, извлекаются и налагаются EIC для наиболее распространенных фрагментов в среднем всех спектров высокоэнергетического канала. Эти наложенные EIC оцениваются с использованием уникального параметра оценки коэффициента соэлюирования. Оценка соэлюирования рассчитывается по методике, аналогичной чистоте пика [2], используемой в УФ-хроматографии, в которой программа рассчитывает значение на основе интенсивности, формы (симметричности), ширины пика и времени удерживания. Нормализованное отношение интенсивностей фрагментных ионов и иона-предшественника отображается на графике соэлюирования поверх времени удерживания и доступно для просмотра пользователем. На рис.7а показаны наложенные EIC для симазина, а на рис.7б – график совместного элюирования со всеми ионами для одной вершины (5,571 мин). Фрагментные ионы демонстрируют отношения, приблизительно равные единице в середине пика предшественника, что свидетельствует о совместном соэлюировании всех ионов. Это подтверждает идентификацию симазина в пробе.
Для настройки параметров алгоритма работы All Ions MS/MS используется новая вкладка Fragment Confirmation (Подтверждение фрагмента) в области подтверждения по формуле в программе MassHunter Qualitative Analysis. На этой вкладке можно указать, какой спектр следует использовать, библиотечный или средний по фрагментам, и сколько наиболее распространенных ионов требуется извлекать. Можно также установить пределы для EIC фрагментных ионов на основе различий во времени удерживания, минимального соотношения "сигнал – шум" и коэффициента соэлюирования.
После завершения работы функции Find by Formula с подтверждением фрагментов можно просмотреть результаты для каждого соединения на панели результатов идентификации соединений (рис.8). Сверху отображается название соединения, его химическая формула и оценка вероятностного соответствия из FBF. Ниже перечислены отдельные фрагментные ионы, используемые для идентификации, с оценкой cоэлюирования, энергией соударения и указанием того, квалифицирован ли фрагмент. Если фрагмент не квалифицирован, приводится причина, например низкое соотношение "сигнал – шум".
Просмотр сведений о соединении
Можно быстро проверить результаты работы алгоритма All Ions MS/MS в новом представлении сведений о соединениях (рис.9). Для просмотра всех со- единений имеется возможность прокрутки списка. Также можно оперативно просматривать результаты совпадения в библиотеке, МС- и фрагментные спектры, наложенные EIC и графики соэлюирования.
К этому моменту пользователи разработают методы качественного анализа для идентификации соединений с использованием методики All Ions MS/MS. Они могут продолжить анализ проб без необходимости доступа к МС/МС спектрам в библиотеке PCDL, поскольку сведения о фрагментных ионах сохраняются в методе MassHunter Qualitative Analysis. В скрининг можно легко добавить новые соединения, дополнив PCDL и выполнив повторную обработку данных. Эта полезная опция позволяет выполнять последующие запросы данных без повторного анализа пробы.
Количественный анализ
После просмотра представления сведений о соединениях можно экспортировать данные в ПО MassHunter Quantitative Analysis в файле с форматом CEF (Compound Exchange Format). Файл CEF содержит сведения, необходимые для настройки количественного метода: название соединения, время удерживания, ион-предшественник, фрагментные ионы (для создания квалифицирующих ионов), энергия соударения и относительные интенсивности. Это значительно ускоряет создание метода обработки количественных данных. ПО MassHunter Quantitative Analysis позволяет автоматически выбирать основные ионы-предшественники и фрагментные ионы для каждого соединения с относительной интенсивностью выше 10%, упрощая трудоемкую обработку вручную. Программа может использовать фрагментные ионы с разными энергиями соударения в ячейке соударений (рис.10). Можно также использовать в качестве квалифицирующего иона один из изотопов иона-предшественника из низкоэнергетического канала (рис.10, ион-продукт при m/z 204,0828). Программа количественного анализа извлекает хроматограммы для основного целевого иона (квантификатор), по которому будет проводиться количественная оценка, ионов-квалификаторов и изотопного кластера молекулярного иона. Можно проверить изотопные вариации, просмотрев их наложение на теоретический шаблон (рис.11).
Выводы
All Ions MS/MS – это новый революционный способ обработки масс-спектральных данных, который сводит к минимуму ошибки пользователя при проведении качественных и количественных измерений. Этот рабочий процесс намного быстрее настройки количественных анализов с использованием ВЭЖХ-МС/МС систем с тройным квадруполем, для которой требуется многочасовой ввод сведений о соединениях и выбор ионов-квалификаторов с высокой интенсивностью. All Ions MS/MS – это удобный и надежный алгоритм для повседневной работы при проведении идентификации соединений, который не требует повторных измерений, поскольку данные сканирования всегда под рукой. All Ions MS/MS – это уникальный метод, позволяющий проводить на масс-спектрометре высокого разрешения как качественный, так и количественный анализ в рамках одного эксперимента, выполнив всего один ввод образца.
Литература
1. Руководство по быстрому запуску персональной базы данных соединений и библиотеки точных масс для MassHunter, номер публикации G3336-90014, февраль 2011.
2. Hans-Jurgen P. Sievert, Anton C.J.H. Drouen. Spectral matching and peak purity in Diode Array Detection in High Performance Liquid Chromatography. – New York: Marcel Dekker, 1993.
В методике All Ions MS/MS сбор данных по точно измеренным массам с высоким разрешением (HRAM) осуществляется при разных условиях. В одних случаях при низком значении энергии соударений, в других – при одном или нескольких высоких значениях энергии. Низкоэнергетические спектры преимущественно отображают только молекулярные ионы (или ионы-предшественники) соединений, тогда как высокоэнергетические – ионы-предшественники и их фрагментные ионы.
Этот аналитический метод легко настраивается с помощью ПО MassHunter Workstation Acquisition для времяпролетных и квадрупольно-времяпролетных приборов (начиная с версии B.05.01). На рис.1 показана новая возможность в ПО для сбора данных: поле Experiment #, в котором допускается использование разных значений параметров в рамках одного временного сегмента. Например, можно настроить для первого эксперимента энергию соударений 0 В, а для второго и третьего экспериментов – энергии соударений 20 и 40 В соответственно.
При изменении напряжения на фрагментационной ячейке или энергии соударений создается файл данных с низкоэнергетическим каналом, который содержит преимущественно ионы-предшественники, и одним или несколькими высокоэнергетическими каналами, которые содержат ионы-предшественники и фрагментные ионы. На рис.2а показан спектр симазина с энергией соударения 0 В, в котором присутствует заметный пик иона-предшественника при m/z 202,08584. На рис.2б изображен усредненный спектр с энергиями 20 и 40 В, содержащий ион-предшественник и несколько фрагментных ионов.
Режим All Ions MS/MS в ПО MassHunter Qualitative Analysis выполняет корреляцию между профилем элюирования иона-предшественника в низкоэнергетическом канале и фрагментами, созданными при более высоких энергиях. Например, на рис.3 показан предшественник (красный) и фрагмент со значением m/z 132,03221 с квалифицирующим соэлюированием (зеленый). Это достигается с помощью сведений о фрагментах из библиотеки Agilent PCDL, которая содержит МС/МС спектры, полученные при разных значениях энергии соударений [1]. Кроме того, библиотеки PCDL включают сведения о соединении: название, формулу, точно измеренную массу, структуру и идентификаторы базы данных, например номер CAS. Библиотека PCDL используется для выбора возможных фрагментных ионов, для которых затем анализируется соэлюирование с ионом-предшественником.
Поиск по формуле
Методика All Ions MS/MS является расширением уникального алгоритма поиска по формуле (Find by Formula или FBF) в ПО MassHunter Qualitative Analysis (рис.4). Алгоритм поиска по формуле использует в качестве отправной точки формулу соединения (например, из PCDL) и рассчитывает моноизотопную массу и соотношение изобарных пиков. Затем из файла данных на основе наиболее распространенных изотопов извлекаются хроматограммы по выделенному иону (EIC) для каждого выбранного носителя заряда и средние спектры из первых 50% проинтегрированных пиков. Таким образом, если соединение присутствует в файле данных, оно должно отображаться в виде хроматографического пика для каждого из своих основных молекулярных ионов.
Извлеченные из пика масс-спектры исследуются для обнаружения возможных кандидатов на основе брутто-формулы соединения. Для каждого кандидата рассчитывается вероятностная оценка соответствия на основе его массы, соотношения изобарных пиков и интервала между ними (рис.5). Если соединение проходит фильтр по оценке соответствия, оно помечается как идентифицированное. Алгоритм поиска по формуле является быстрым и может проверять файл данных по базам точно измеренных масс (CSV, PCD или PCDL), которые содержат тысячи формул, за несколько минут.
Подтверждение фрагмента
В методике All Ions MS/MS алгоритм поиска по формуле усовершенствован благодаря дополнительному шагу подтверждения фрагмента с использованием одного или нескольких высокоэнергетических каналов. Если для соединения существует хотя бы один спектр МС/МС в библиотеке PCDL, наиболее распространенные ионы-продукты в библиотечных спектрах извлекаются в виде EIC из соответствующего высокоэнергетического канала. Например, на рис.6а показан библиотечный спектр МС/МС симазина при энергии соударения 20 В из библиотеки пестицидов PCDL. На рис.6б приведен высокоэнергетический спектр пробы, которая содержит симазин. Используя библиотеку PCDL, программе удалось определить фрагменты при значениях m/z 104,00 и 132,03, несмотря на наличие посторонних ионов с большей интенсивностью сигнала при m/z 94,04 и 121,05.
Фрагменты из спектров МС/МС в библиотеке PCDL извлекаются в виде EIC и налагаются на EIC иона-предшественника. Если в библиотеке PCDL отсутствуют МС/МС спектры для соединения, извлекаются и налагаются EIC для наиболее распространенных фрагментов в среднем всех спектров высокоэнергетического канала. Эти наложенные EIC оцениваются с использованием уникального параметра оценки коэффициента соэлюирования. Оценка соэлюирования рассчитывается по методике, аналогичной чистоте пика [2], используемой в УФ-хроматографии, в которой программа рассчитывает значение на основе интенсивности, формы (симметричности), ширины пика и времени удерживания. Нормализованное отношение интенсивностей фрагментных ионов и иона-предшественника отображается на графике соэлюирования поверх времени удерживания и доступно для просмотра пользователем. На рис.7а показаны наложенные EIC для симазина, а на рис.7б – график совместного элюирования со всеми ионами для одной вершины (5,571 мин). Фрагментные ионы демонстрируют отношения, приблизительно равные единице в середине пика предшественника, что свидетельствует о совместном соэлюировании всех ионов. Это подтверждает идентификацию симазина в пробе.
Для настройки параметров алгоритма работы All Ions MS/MS используется новая вкладка Fragment Confirmation (Подтверждение фрагмента) в области подтверждения по формуле в программе MassHunter Qualitative Analysis. На этой вкладке можно указать, какой спектр следует использовать, библиотечный или средний по фрагментам, и сколько наиболее распространенных ионов требуется извлекать. Можно также установить пределы для EIC фрагментных ионов на основе различий во времени удерживания, минимального соотношения "сигнал – шум" и коэффициента соэлюирования.
После завершения работы функции Find by Formula с подтверждением фрагментов можно просмотреть результаты для каждого соединения на панели результатов идентификации соединений (рис.8). Сверху отображается название соединения, его химическая формула и оценка вероятностного соответствия из FBF. Ниже перечислены отдельные фрагментные ионы, используемые для идентификации, с оценкой cоэлюирования, энергией соударения и указанием того, квалифицирован ли фрагмент. Если фрагмент не квалифицирован, приводится причина, например низкое соотношение "сигнал – шум".
Просмотр сведений о соединении
Можно быстро проверить результаты работы алгоритма All Ions MS/MS в новом представлении сведений о соединениях (рис.9). Для просмотра всех со- единений имеется возможность прокрутки списка. Также можно оперативно просматривать результаты совпадения в библиотеке, МС- и фрагментные спектры, наложенные EIC и графики соэлюирования.
К этому моменту пользователи разработают методы качественного анализа для идентификации соединений с использованием методики All Ions MS/MS. Они могут продолжить анализ проб без необходимости доступа к МС/МС спектрам в библиотеке PCDL, поскольку сведения о фрагментных ионах сохраняются в методе MassHunter Qualitative Analysis. В скрининг можно легко добавить новые соединения, дополнив PCDL и выполнив повторную обработку данных. Эта полезная опция позволяет выполнять последующие запросы данных без повторного анализа пробы.
Количественный анализ
После просмотра представления сведений о соединениях можно экспортировать данные в ПО MassHunter Quantitative Analysis в файле с форматом CEF (Compound Exchange Format). Файл CEF содержит сведения, необходимые для настройки количественного метода: название соединения, время удерживания, ион-предшественник, фрагментные ионы (для создания квалифицирующих ионов), энергия соударения и относительные интенсивности. Это значительно ускоряет создание метода обработки количественных данных. ПО MassHunter Quantitative Analysis позволяет автоматически выбирать основные ионы-предшественники и фрагментные ионы для каждого соединения с относительной интенсивностью выше 10%, упрощая трудоемкую обработку вручную. Программа может использовать фрагментные ионы с разными энергиями соударения в ячейке соударений (рис.10). Можно также использовать в качестве квалифицирующего иона один из изотопов иона-предшественника из низкоэнергетического канала (рис.10, ион-продукт при m/z 204,0828). Программа количественного анализа извлекает хроматограммы для основного целевого иона (квантификатор), по которому будет проводиться количественная оценка, ионов-квалификаторов и изотопного кластера молекулярного иона. Можно проверить изотопные вариации, просмотрев их наложение на теоретический шаблон (рис.11).
Выводы
All Ions MS/MS – это новый революционный способ обработки масс-спектральных данных, который сводит к минимуму ошибки пользователя при проведении качественных и количественных измерений. Этот рабочий процесс намного быстрее настройки количественных анализов с использованием ВЭЖХ-МС/МС систем с тройным квадруполем, для которой требуется многочасовой ввод сведений о соединениях и выбор ионов-квалификаторов с высокой интенсивностью. All Ions MS/MS – это удобный и надежный алгоритм для повседневной работы при проведении идентификации соединений, который не требует повторных измерений, поскольку данные сканирования всегда под рукой. All Ions MS/MS – это уникальный метод, позволяющий проводить на масс-спектрометре высокого разрешения как качественный, так и количественный анализ в рамках одного эксперимента, выполнив всего один ввод образца.
Литература
1. Руководство по быстрому запуску персональной базы данных соединений и библиотеки точных масс для MassHunter, номер публикации G3336-90014, февраль 2011.
2. Hans-Jurgen P. Sievert, Anton C.J.H. Drouen. Spectral matching and peak purity in Diode Array Detection in High Performance Liquid Chromatography. – New York: Marcel Dekker, 1993.
Отзывы читателей
