eng
Выпуск #1/2015
Т.Воейкова, Б.Тяглов, Л.Новикова, К.Лобанов, С.Антонова, В.Ильин
Влияние факторов космического полета на биосинтез антибиотика тилозина штаммом Streptomyces fradiae
Влияние факторов космического полета на биосинтез антибиотика тилозина штаммом Streptomyces fradiae
Просмотры: 2786
Факторы космического полета, такие как микрогравитация, изменение электромагнитных полей, различные виды излучений могут оказывать значительное воздействие на метаболизм и стабильность генетического материала микроорганизмов. В работе изучено влияние факторов космического полета на синтез тилозина у штамма Streptomyces fradiae методом количественной тонкослойной хроматографии. Показано, что у полетных образцов происходит суммарное снижение уровня тилозиновых антибиотиков на 30%. Разработана и валидирована методика количественного определения тилозина и дезмикозина.
Теги: antibiotics factors of space flight the method of determination tylosin антибиотики методика определения тилозин факторы космического полета
Космическая микробиология в течение многих лет изучает влияние факторов космического полета (ФКП) на микрофлору человека и среды обитания в космических кораблях и орбитальных станциях. Особо актуальны исследования, направленные на выяснение механизмов изменения метаболизма, уровня патогенности микрофлоры, поскольку от этого зависит инфекционная безопасность членов экипажей действующих орбитальных станций, а также стратегия лечения заболеваний на борту. Эксперименты по оценке особенностей синтеза биологически активных веществ (БАВ) необходимы для понимания причин высокой изменчивости и адаптивности микрофлоры к условиям космического полета, а также для выработки методов защиты космонавтов, материалов и оборудования космического корабля.
В качестве объекта для исследования влияния стрессовых факторов космического полета на процессы биосинтеза биологически активных веществ микроорганизмами был выбран штамм – продуцент антибиотика тилозина, принадлежащий к роду Streptomyces. Штаммы рода Streptomyces – это классическая модель для изучения процессов биосинтеза вторичных метаболитов. Стрептомицеты являются продуцентами большого числа БАВ – антибиотиков, пигментов, витаминов, аминокислот, биосинтез которых чувствителен к различным факторам внешней среды. Известно, что изменение таких факторов как компонентный состав сред, температура, условия культивирования существенно влияют на уровень выхода продукта и его компонентный состав. Поэтому ФКП, представляющие собой уникальные и практически не воспроизводимые в земных лабораториях условия проведения экспериментов, могут быть хорошим инструментом для изучения процессов биосинтеза БАВ и получения веществ с новыми физико-химическими характеристиками. Длительное состояние невесомости, совокупное воздействие невесомости и ионизирующих излучений, отсутствие привычной циркадной ритмики могут изменить продуктивность штаммов, компонентный состав БАВ и привести к появлению веществ с новыми свойствами. В результате возможно появление штаммов с новыми адаптогенными характеристиками, способными к утилизации необычных пищевых субстратов и освоению новых экологических ниш. Ранее в экспериментах на "Фотоне-М3" на примере Streptomyces lividans (pIJ 702) – продуцента пигмента меланина – показано, что в условиях полета у штамма изменяются ростовые характеристики, процессы биосинтеза и структура метаболитов. В частности, обнаружено изменение уровня синтеза меланина и его фракционного состава. В результате образовался пигмент с качественно новыми характеристиками [1].
Цель работы состояла в исследовании влияния ФКП на биосинтез тилозина, синтезируемого штаммом Streptomyces fradiae. Эксперимент проводили на борту Российского беспилотного аппарата "Бион–М1" по программе международных космических исследований. Продолжительность полета составляла 30 суток, температура инкубации штамма 30°C.
Материалы и методы
Органические растворители очищали согласно методикам [2]. Воду получали на установке Super Q (Millipore, США).
Использовали стандарт тилозина фирмы Sigma, США. Стандартные растворы в концентрациях 0,5; 1,0; 2,0 и 3,0 мг/мл готовили в воде и хранили при температуре 4°С. Срок хранения растворов составлял две недели. Дополнительный контроль концентрации стандартных растворов тилозина проводили методом спектрофотометрии [3].
Согласно программе биологических испытаний по изучению процессов метаболизма у микроорганизмов в условиях космического полета, в частности, синтеза антибиотика тилозина культурой Streptomyces fradiae эксперимент проводили на чашках Петри с агаризованной средой. Диаметр чашек составлял 40,0 мм. Штамм Streptomyces fradiae засевали на питательные среды за 7 суток перед полетом в условиях лаборатории ФГУП "ГосНИИгенетика" и хранили при 4°С до передачи на борт космического корабля "Бион–М1", где в течение 30 суток полета они находились в аппаратном модуле "Биоконт-Б" при температуре окружающей среды. Синхронный эксперимент проходил при тех же температурных режимах и длительности культивирования штамма, что и полетный эксперимент, в условиях микробиологической лаборатории ФГУП "ГосНИИгенетика". В лабораторном контроле штамм культивировали при 30°С в течение 10 суток, то есть в условиях оптимальных для роста и развития штамма.
По окончании полета для выделения тилозина и сопутствующих ему антибиотиков использовали схему экстрагирования тилозина из агаризованной среды, переведенной в жидкую фазу, с последующим извлечением тилозина с помощью бутилацетата. Согласно этой методике гель измельчали и растворяли в 6М-водном растворе иодида калия (KI) в течение 5 мин при 55°C при интенсивном перемешивании. Весовое соотношение: гель-6М-водный раствор KI составляло 1 : 3 [4]. Следует отметить, что используемый KI должен иметь квалификацию "ОСЧ" и не содержать свободного йода (тест "крахмальный индикатор"). Йод в кристаллическом йодиде калия образуется в присутствии атмосферной влаги под воздействием кислорода воздуха. Присутствие свободного йода в 6М-водном растворе KI недопустимо также и по другой причине: при 55°С в результате диспропорционирования молекулы свободного иода образуются йодид и йодат-ионы [5].
В качестве контрольного использовали гель, в который вносили стандартный раствор тилозина (Sigma) из расчета 4 мг на 1,0 г геля. Этот гель хранили при температуре 4°С в течение 30 суток.
Для извлечения тилозина из агаризованной среды после культивирования на ней штамма S. fradiae получали суспензию, согласно описанной выше методике. Затем суспензию фильтровали от мицелия на воронке Бюхнера; мицелий на фильтре промывали дважды 6М-водным раствором йодида калия. Полученный водный раствор доводили 2н-водным раствором КОН до величины рН 9,0, затем трижды экстрагировали бутилацетатом, при этом соотношение водной и органической фазы составляло 1 : 1. Бутилацетат широко используется для экстракции тилозина из культуральной жидкости (КЖ) в промышленных условиях, а присутствие в КЖ растворимых неорганических солей увеличивает степень извлечения тилозина из водной фазы [6]. Бутилацетатный раствор упаривали под вакуумом при 45°C досуха, а образовавшийся осадок растворяли в 50%-ном водном этаноле, при этом объем последнего раствора был фиксирован. Этот раствор использовали для анализа тилозина.
Для ТСХ применяли стандартные пластинки “Сорбфил” ПТСХ-АФ-В-УФ, размером 10 × 15см, ТУ 26-11-17-89, АО “Сорбполимер” (Краснодар), изготовленные по технологии, разработанной в НПЦ "Ленхром" (Санкт-Петербург). ТСХ-пластинки промывали смесью хлороформ-метанол (1 : 1 об/об) и активировали в течение 30 мин при 110–115°С в сушильном шкафу.
Растворы стандартных образцов и испытуемых проб наносили на пластинки с помощью автоматического аппликатора ATS-4 фирмы CAMAG (Швейцария). Объем наносимых проб – 2,0 мкл.
Хроматографию осуществляли восходящим методом в стеклянной камере (22,5 × 29,0 × 16,0 см) производства НПЦ "Ленхром" (Санкт-Петербург). Подвижная фаза состояла из этилацетата и диэтиламина 95 : 5, об/об. Насыщение камеры – 1,0 час. Время разделения составляло 15 мин. После элюирования хроматограмму выдерживали в течение 10 мин при 20°С. Для визуализации пятен тилозина использовали трансиллюминатор модели UVP-300 фирмы Ultraviolet Products Inc. (США).
Количественное определение тилозина проводили на денситометрах CS-920 фирмы Shimadzu (Япония) и TLC scanner 3 фирмы CAMAG при длине волны 282 нм. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли согласно методике [7].
Количественное определение тилозина методом ТСХ
В эксперименте исследовано влияние ФКП на уровень синтеза антибиотика тилозина и его фракционный состав у штамма S. fradiae. Известно, что тилозин образуется в результате микробиологического синтеза при культивировании штамма S. fradiae и состоит из трех основных фракций с различной антибактериальной активностью. Так, наряду с тилозином синтезируются дезмикозин, макроцин, а также реломицин. Есть еще ряд компонент, которые синтезируются в незначительных количествах, имеют одинаковый спектр антимикробной активности и являются токсичными. Наиболее высокую антибактериальную активность "in vivo” показывает тилозин [8]. Тилозин является бактериостатическим антибиотиком. Спектр его действия охватывает большинство грамположительных и грамотрицательных бактерий, а именно: стрептококки, стафилококки, лептоспиры, коринебактерии, клостридии, эризипелотриксы, пастереллы, хламидии, трепонемы, хиодизентерии, спирохеты и микоплазмы. Этот антибиотик применяют в сельском хозяйстве в качестве лечебно-профилактического средства при заболеваниях сельскохозяйственных животных и птицы [8]. По своей структуре тилозин относится к группе макролидных антибиотиков и включает в свою молекулу макролактонное кольцо, связанное с аминосахарами – микаминозой, микарозой и мицинозой. Показано, что для проявления антимикробной активности антибиотика присутствие микарозы и мицинозы не обязательно.
Оптимальное время культивирования штамма на агаризованных средах – 10 суток при температуре 28–30°С. Ранее установлено, что в этих условиях величина активности дезмикозина, реломицина и макроцина составляют 0,95±0,05; 0,4±0,05 и 0,2±0,05 соответственно, за единицу была принята активность тилозина [9].
Выделение тилозина и сопутствующих ему фракций проводили с помощью экстрагирования антибиотика бутилацетатом из агаризованной среды, переведенной в жидкую фазу. Полнота экстракции тилозина из геля была подтверждена данными модельного эксперимента "введено – получено". Так, при выделении тилозина из контрольного геля, содержащего 4 мг антибиотика на 1,0 г геля, установлено, что при трех циклах экстракции степень извлечения тотальной фракции антибиотика составляет 97%. Аналогичным образом проводили выделение тилозина из агаризованных гелей лабораторного, синхронного и полетного образцов, после чего анализировали с помощью метода ТСХ. Установлено, что лабораторный, синхронный и полетный образцы содержат только тилозин, Rf = 0,67 ± 0,03 (n = 5; P 0,95) и дезмикозин Rf = 0,59 ± 0,03 (n = 5; P 0,95). Количественное определение антибиотиков проводили на денситометрах CS-920 фирмы Shimadzu (Япония) и TLC scanner 3 фирмы Camag (Швейцария) при длине волны 282 нм. Полученные результаты (табл.1) обрабатывали статистически [7].
Лабораторный образец содержит суммарно 7,0 мг/г тилозина и дезмикозина, содержание тилозина составляет 83,5%, а дезмикозина – 16,5% на десятые сутки культивирования. Эта концентрация антибиотиков соответствует характеристике штамма, который может синтезировать 6–8 мг/мл антибиотика в процессе культивирования. При культивировании штамма до 30 суток (синхронный контроль) суммарное количество антибиотиков увеличивается до 8,0 мг/г, однако снижается доля тилозина и возрастает доля дезмикозина. В этом случае, скорее всего, происходит конверсия основной фракции тилозина в дезмикозин [9]. В полетном образце суммарное содержание антибиотиков снижено и составляет 5,6 мг/г, при этом также снижается доля тилозина и возрастает доля дезмикозина.
Валидация методики количественного определения тилозина методом хроматоденситометрии
Согласно нормативам ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 неотъемлемой частью современного количественного анализа является валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает в себя следующие характеристики: специфичность, линейную зависимость, правильность (точность), предел обнаружения, предел количественного определения, пригодность системы [10–12]. Молекула тилозина имеет тиланолидный цикл, который может быть нестабильным из-за следующих причин: взаимодействие растворителя с молекулой тилозина, фотохимическое разложение в растворе, деструкция молекулы тилозина, обусловленная разложением на активной поверхности слоя силикагеля [12]. Известно, что тилозин устойчив в водных и водно-спиртовых растворах в течение нескольких суток при комнатной температуре [8]. Для доказательства устойчивости тилозина на слое силикагеля были проведены предвалидационные тесты в одинаковых условиях: элюент – этилацетат-диэтиламин, t = 20°С, насыщение камеры 1 ч, содержание тилозина в пятне 2,5 мкг.
Проведена двумерная хроматография тилозина, показано, что он после двумерного элюирования дает только одно пятно.
Проведена хроматография растворов одних и тех же проб тилозина в следующие промежутки времени: 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин. Установлено, что тилозин элюируются одним пятном, при этом интенсивность пятен не меняется.
Проведена хроматография нанесенных на пластинки проб тилозина через 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин после нанесения. Перед проведением элюирования пластинки выдерживались в лабораторном помещении при комнатной температуре 20–25°С в незащищенном от света месте. Обнаружено, что тилозин проявляется одним пятном, интенсивность которого не изменяется.Полученные таким образом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что тилозин устойчив на тонких слоях силикагеля в течение 360 мин.
Разработанная нами подвижная фаза для разделения тилозина является весьма селективной, величины ΔRf >> 0,05 (для пятен тилозина и дезмикозина). Таким образом, показана специфичность разработанной методики, поскольку она позволяет достоверно определять как тилозин, так и дезмикозин. Установлено, что аналитическая область методики, в пределах которой соблюдается линейная зависимость, охватывает интервал для тилозина от 0,5 до 3,0 мкг в пятне (включая эти пределы), r = 0,9986. Правильность (точность) разработанной методики, в пределах аналитической области, иллюстрируют результаты, представленные в табл.2. Кроме того, данные из этой таблицы демонстрируют хорошую внутрилабораторную воспроизводимость.
Результаты проверки межлабораторной воспроизводимости (табл.3) показали, что полученные в разных лабораториях данные хорошо согласуются друг с другом.
Предел обнаружения тилозина составляет 0,3 мкг. Предел количественного определения тилозина 0,5 мкг в пятне (S/N = 20).
Проведено исследование зависимости селективности разделения от величины объемного содержания этилацетата и диэтиламина, входящих в состав подвижной фазы. Установлено, что величины ΔRf пятен тилозина и дезмикозина практически не изменяются ΔRf (±0,05, n = 5, P 0,95) в интервале содержания этилацетата от 93,5 до 96,5% (по объему) и диэтиламина от 6,5 до 3,5% (по объему). Температура в интервале от 15 до 25°С и время насыщения камеры от 30 до 120 мин также не оказывают влияния на величины ΔRf (±0,05; n = 5, P 0,95) тилозина и дезмикозина. Использование ВЭТСХ пластинок "Сорбфил" (предварительно промытых и активированных) различных партий также не вызывает изменений селективности разделения (robustness, ruggedness).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о пригодности разработанной методики для количественного определения тилозина и дезмикозина.
Исследования выполнены при поддержке Федерального космического агентства, ГНЦ РФ – Института медико-биологических проблем РАН. Работа проведена с использованием оборудования ЦКП ФГУП "ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов".
Литература
1.Воейкова Т., Тяглов Б., Новикова Л., Емельянова Л., Антонова С. Исследование воздействия факторов космического полета на продукцию меланина штаммом Streptomyces lividans 66 (piJ 702). – Аналитика, 2013, № 1, с. 18–23.
2.Perrin D.D., Purification of Laboratory Chemicals – N-Y-London – Pergamon Press, 1988.
3.Досон Р., Эллиот Д., Джонс К. Справочник биохимика, М:, Мир, 1991. С. 14.
4.Vogelstein B., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1979, v. 76(2), p. 615–619.
5.Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества. – М.: Химия, 1979. 406 с.
6.Аксенова И.А. Тилозин. Производство и применение продуктов микробиологических производств. – М.: ВНИИСЭНТИ Медминпрома СССР, 1988, вып. 2, с. 8–17.
7.Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. – М.: Медицина, 1987. C. 163–187.
8.Biot A. Biotechnology of Industrial Antibiotics /ed: Van-Damme. – N.-Y.: Marcel Dakker, 1984. 720 p.
9.Huber G. Antibiotics / ed: HahuF –E. – Berlin: Springer Verlag, 1989. 284 p.
10.Sun S.W., Fabry H. Test procedure validation for the TLC assay of degradation products in pharmaceutical formulation // Journal Liquid Chromatography, 1994, 17, p. 2495–2509.
11.Renger B., Vegh Z. Validation of thin layer and high performance thin layer chromatographic methods // Journal of Chromatography, 2011, 1218, p. 2712–2721.
12.Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. – СПб.: Химиздат, 2005. 232 с.
В качестве объекта для исследования влияния стрессовых факторов космического полета на процессы биосинтеза биологически активных веществ микроорганизмами был выбран штамм – продуцент антибиотика тилозина, принадлежащий к роду Streptomyces. Штаммы рода Streptomyces – это классическая модель для изучения процессов биосинтеза вторичных метаболитов. Стрептомицеты являются продуцентами большого числа БАВ – антибиотиков, пигментов, витаминов, аминокислот, биосинтез которых чувствителен к различным факторам внешней среды. Известно, что изменение таких факторов как компонентный состав сред, температура, условия культивирования существенно влияют на уровень выхода продукта и его компонентный состав. Поэтому ФКП, представляющие собой уникальные и практически не воспроизводимые в земных лабораториях условия проведения экспериментов, могут быть хорошим инструментом для изучения процессов биосинтеза БАВ и получения веществ с новыми физико-химическими характеристиками. Длительное состояние невесомости, совокупное воздействие невесомости и ионизирующих излучений, отсутствие привычной циркадной ритмики могут изменить продуктивность штаммов, компонентный состав БАВ и привести к появлению веществ с новыми свойствами. В результате возможно появление штаммов с новыми адаптогенными характеристиками, способными к утилизации необычных пищевых субстратов и освоению новых экологических ниш. Ранее в экспериментах на "Фотоне-М3" на примере Streptomyces lividans (pIJ 702) – продуцента пигмента меланина – показано, что в условиях полета у штамма изменяются ростовые характеристики, процессы биосинтеза и структура метаболитов. В частности, обнаружено изменение уровня синтеза меланина и его фракционного состава. В результате образовался пигмент с качественно новыми характеристиками [1].
Цель работы состояла в исследовании влияния ФКП на биосинтез тилозина, синтезируемого штаммом Streptomyces fradiae. Эксперимент проводили на борту Российского беспилотного аппарата "Бион–М1" по программе международных космических исследований. Продолжительность полета составляла 30 суток, температура инкубации штамма 30°C.
Материалы и методы
Органические растворители очищали согласно методикам [2]. Воду получали на установке Super Q (Millipore, США).
Использовали стандарт тилозина фирмы Sigma, США. Стандартные растворы в концентрациях 0,5; 1,0; 2,0 и 3,0 мг/мл готовили в воде и хранили при температуре 4°С. Срок хранения растворов составлял две недели. Дополнительный контроль концентрации стандартных растворов тилозина проводили методом спектрофотометрии [3].
Согласно программе биологических испытаний по изучению процессов метаболизма у микроорганизмов в условиях космического полета, в частности, синтеза антибиотика тилозина культурой Streptomyces fradiae эксперимент проводили на чашках Петри с агаризованной средой. Диаметр чашек составлял 40,0 мм. Штамм Streptomyces fradiae засевали на питательные среды за 7 суток перед полетом в условиях лаборатории ФГУП "ГосНИИгенетика" и хранили при 4°С до передачи на борт космического корабля "Бион–М1", где в течение 30 суток полета они находились в аппаратном модуле "Биоконт-Б" при температуре окружающей среды. Синхронный эксперимент проходил при тех же температурных режимах и длительности культивирования штамма, что и полетный эксперимент, в условиях микробиологической лаборатории ФГУП "ГосНИИгенетика". В лабораторном контроле штамм культивировали при 30°С в течение 10 суток, то есть в условиях оптимальных для роста и развития штамма.
По окончании полета для выделения тилозина и сопутствующих ему антибиотиков использовали схему экстрагирования тилозина из агаризованной среды, переведенной в жидкую фазу, с последующим извлечением тилозина с помощью бутилацетата. Согласно этой методике гель измельчали и растворяли в 6М-водном растворе иодида калия (KI) в течение 5 мин при 55°C при интенсивном перемешивании. Весовое соотношение: гель-6М-водный раствор KI составляло 1 : 3 [4]. Следует отметить, что используемый KI должен иметь квалификацию "ОСЧ" и не содержать свободного йода (тест "крахмальный индикатор"). Йод в кристаллическом йодиде калия образуется в присутствии атмосферной влаги под воздействием кислорода воздуха. Присутствие свободного йода в 6М-водном растворе KI недопустимо также и по другой причине: при 55°С в результате диспропорционирования молекулы свободного иода образуются йодид и йодат-ионы [5].
В качестве контрольного использовали гель, в который вносили стандартный раствор тилозина (Sigma) из расчета 4 мг на 1,0 г геля. Этот гель хранили при температуре 4°С в течение 30 суток.
Для извлечения тилозина из агаризованной среды после культивирования на ней штамма S. fradiae получали суспензию, согласно описанной выше методике. Затем суспензию фильтровали от мицелия на воронке Бюхнера; мицелий на фильтре промывали дважды 6М-водным раствором йодида калия. Полученный водный раствор доводили 2н-водным раствором КОН до величины рН 9,0, затем трижды экстрагировали бутилацетатом, при этом соотношение водной и органической фазы составляло 1 : 1. Бутилацетат широко используется для экстракции тилозина из культуральной жидкости (КЖ) в промышленных условиях, а присутствие в КЖ растворимых неорганических солей увеличивает степень извлечения тилозина из водной фазы [6]. Бутилацетатный раствор упаривали под вакуумом при 45°C досуха, а образовавшийся осадок растворяли в 50%-ном водном этаноле, при этом объем последнего раствора был фиксирован. Этот раствор использовали для анализа тилозина.
Для ТСХ применяли стандартные пластинки “Сорбфил” ПТСХ-АФ-В-УФ, размером 10 × 15см, ТУ 26-11-17-89, АО “Сорбполимер” (Краснодар), изготовленные по технологии, разработанной в НПЦ "Ленхром" (Санкт-Петербург). ТСХ-пластинки промывали смесью хлороформ-метанол (1 : 1 об/об) и активировали в течение 30 мин при 110–115°С в сушильном шкафу.
Растворы стандартных образцов и испытуемых проб наносили на пластинки с помощью автоматического аппликатора ATS-4 фирмы CAMAG (Швейцария). Объем наносимых проб – 2,0 мкл.
Хроматографию осуществляли восходящим методом в стеклянной камере (22,5 × 29,0 × 16,0 см) производства НПЦ "Ленхром" (Санкт-Петербург). Подвижная фаза состояла из этилацетата и диэтиламина 95 : 5, об/об. Насыщение камеры – 1,0 час. Время разделения составляло 15 мин. После элюирования хроматограмму выдерживали в течение 10 мин при 20°С. Для визуализации пятен тилозина использовали трансиллюминатор модели UVP-300 фирмы Ultraviolet Products Inc. (США).
Количественное определение тилозина проводили на денситометрах CS-920 фирмы Shimadzu (Япония) и TLC scanner 3 фирмы CAMAG при длине волны 282 нм. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли согласно методике [7].
Количественное определение тилозина методом ТСХ
В эксперименте исследовано влияние ФКП на уровень синтеза антибиотика тилозина и его фракционный состав у штамма S. fradiae. Известно, что тилозин образуется в результате микробиологического синтеза при культивировании штамма S. fradiae и состоит из трех основных фракций с различной антибактериальной активностью. Так, наряду с тилозином синтезируются дезмикозин, макроцин, а также реломицин. Есть еще ряд компонент, которые синтезируются в незначительных количествах, имеют одинаковый спектр антимикробной активности и являются токсичными. Наиболее высокую антибактериальную активность "in vivo” показывает тилозин [8]. Тилозин является бактериостатическим антибиотиком. Спектр его действия охватывает большинство грамположительных и грамотрицательных бактерий, а именно: стрептококки, стафилококки, лептоспиры, коринебактерии, клостридии, эризипелотриксы, пастереллы, хламидии, трепонемы, хиодизентерии, спирохеты и микоплазмы. Этот антибиотик применяют в сельском хозяйстве в качестве лечебно-профилактического средства при заболеваниях сельскохозяйственных животных и птицы [8]. По своей структуре тилозин относится к группе макролидных антибиотиков и включает в свою молекулу макролактонное кольцо, связанное с аминосахарами – микаминозой, микарозой и мицинозой. Показано, что для проявления антимикробной активности антибиотика присутствие микарозы и мицинозы не обязательно.
Оптимальное время культивирования штамма на агаризованных средах – 10 суток при температуре 28–30°С. Ранее установлено, что в этих условиях величина активности дезмикозина, реломицина и макроцина составляют 0,95±0,05; 0,4±0,05 и 0,2±0,05 соответственно, за единицу была принята активность тилозина [9].
Выделение тилозина и сопутствующих ему фракций проводили с помощью экстрагирования антибиотика бутилацетатом из агаризованной среды, переведенной в жидкую фазу. Полнота экстракции тилозина из геля была подтверждена данными модельного эксперимента "введено – получено". Так, при выделении тилозина из контрольного геля, содержащего 4 мг антибиотика на 1,0 г геля, установлено, что при трех циклах экстракции степень извлечения тотальной фракции антибиотика составляет 97%. Аналогичным образом проводили выделение тилозина из агаризованных гелей лабораторного, синхронного и полетного образцов, после чего анализировали с помощью метода ТСХ. Установлено, что лабораторный, синхронный и полетный образцы содержат только тилозин, Rf = 0,67 ± 0,03 (n = 5; P 0,95) и дезмикозин Rf = 0,59 ± 0,03 (n = 5; P 0,95). Количественное определение антибиотиков проводили на денситометрах CS-920 фирмы Shimadzu (Япония) и TLC scanner 3 фирмы Camag (Швейцария) при длине волны 282 нм. Полученные результаты (табл.1) обрабатывали статистически [7].
Лабораторный образец содержит суммарно 7,0 мг/г тилозина и дезмикозина, содержание тилозина составляет 83,5%, а дезмикозина – 16,5% на десятые сутки культивирования. Эта концентрация антибиотиков соответствует характеристике штамма, который может синтезировать 6–8 мг/мл антибиотика в процессе культивирования. При культивировании штамма до 30 суток (синхронный контроль) суммарное количество антибиотиков увеличивается до 8,0 мг/г, однако снижается доля тилозина и возрастает доля дезмикозина. В этом случае, скорее всего, происходит конверсия основной фракции тилозина в дезмикозин [9]. В полетном образце суммарное содержание антибиотиков снижено и составляет 5,6 мг/г, при этом также снижается доля тилозина и возрастает доля дезмикозина.
Валидация методики количественного определения тилозина методом хроматоденситометрии
Согласно нормативам ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 неотъемлемой частью современного количественного анализа является валидация (оценка пригодности) используемых аналитических методик, которая включает в себя следующие характеристики: специфичность, линейную зависимость, правильность (точность), предел обнаружения, предел количественного определения, пригодность системы [10–12]. Молекула тилозина имеет тиланолидный цикл, который может быть нестабильным из-за следующих причин: взаимодействие растворителя с молекулой тилозина, фотохимическое разложение в растворе, деструкция молекулы тилозина, обусловленная разложением на активной поверхности слоя силикагеля [12]. Известно, что тилозин устойчив в водных и водно-спиртовых растворах в течение нескольких суток при комнатной температуре [8]. Для доказательства устойчивости тилозина на слое силикагеля были проведены предвалидационные тесты в одинаковых условиях: элюент – этилацетат-диэтиламин, t = 20°С, насыщение камеры 1 ч, содержание тилозина в пятне 2,5 мкг.
Проведена двумерная хроматография тилозина, показано, что он после двумерного элюирования дает только одно пятно.
Проведена хроматография растворов одних и тех же проб тилозина в следующие промежутки времени: 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин. Установлено, что тилозин элюируются одним пятном, при этом интенсивность пятен не меняется.
Проведена хроматография нанесенных на пластинки проб тилозина через 5, 30, 60, 180, 240 и 360 мин после нанесения. Перед проведением элюирования пластинки выдерживались в лабораторном помещении при комнатной температуре 20–25°С в незащищенном от света месте. Обнаружено, что тилозин проявляется одним пятном, интенсивность которого не изменяется.Полученные таким образом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что тилозин устойчив на тонких слоях силикагеля в течение 360 мин.
Разработанная нами подвижная фаза для разделения тилозина является весьма селективной, величины ΔRf >> 0,05 (для пятен тилозина и дезмикозина). Таким образом, показана специфичность разработанной методики, поскольку она позволяет достоверно определять как тилозин, так и дезмикозин. Установлено, что аналитическая область методики, в пределах которой соблюдается линейная зависимость, охватывает интервал для тилозина от 0,5 до 3,0 мкг в пятне (включая эти пределы), r = 0,9986. Правильность (точность) разработанной методики, в пределах аналитической области, иллюстрируют результаты, представленные в табл.2. Кроме того, данные из этой таблицы демонстрируют хорошую внутрилабораторную воспроизводимость.
Результаты проверки межлабораторной воспроизводимости (табл.3) показали, что полученные в разных лабораториях данные хорошо согласуются друг с другом.
Предел обнаружения тилозина составляет 0,3 мкг. Предел количественного определения тилозина 0,5 мкг в пятне (S/N = 20).
Проведено исследование зависимости селективности разделения от величины объемного содержания этилацетата и диэтиламина, входящих в состав подвижной фазы. Установлено, что величины ΔRf пятен тилозина и дезмикозина практически не изменяются ΔRf (±0,05, n = 5, P 0,95) в интервале содержания этилацетата от 93,5 до 96,5% (по объему) и диэтиламина от 6,5 до 3,5% (по объему). Температура в интервале от 15 до 25°С и время насыщения камеры от 30 до 120 мин также не оказывают влияния на величины ΔRf (±0,05; n = 5, P 0,95) тилозина и дезмикозина. Использование ВЭТСХ пластинок "Сорбфил" (предварительно промытых и активированных) различных партий также не вызывает изменений селективности разделения (robustness, ruggedness).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о пригодности разработанной методики для количественного определения тилозина и дезмикозина.
Исследования выполнены при поддержке Федерального космического агентства, ГНЦ РФ – Института медико-биологических проблем РАН. Работа проведена с использованием оборудования ЦКП ФГУП "ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов".
Литература
1.Воейкова Т., Тяглов Б., Новикова Л., Емельянова Л., Антонова С. Исследование воздействия факторов космического полета на продукцию меланина штаммом Streptomyces lividans 66 (piJ 702). – Аналитика, 2013, № 1, с. 18–23.
2.Perrin D.D., Purification of Laboratory Chemicals – N-Y-London – Pergamon Press, 1988.
3.Досон Р., Эллиот Д., Джонс К. Справочник биохимика, М:, Мир, 1991. С. 14.
4.Vogelstein B., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1979, v. 76(2), p. 615–619.
5.Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества. – М.: Химия, 1979. 406 с.
6.Аксенова И.А. Тилозин. Производство и применение продуктов микробиологических производств. – М.: ВНИИСЭНТИ Медминпрома СССР, 1988, вып. 2, с. 8–17.
7.Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. – М.: Медицина, 1987. C. 163–187.
8.Biot A. Biotechnology of Industrial Antibiotics /ed: Van-Damme. – N.-Y.: Marcel Dakker, 1984. 720 p.
9.Huber G. Antibiotics / ed: HahuF –E. – Berlin: Springer Verlag, 1989. 284 p.
10.Sun S.W., Fabry H. Test procedure validation for the TLC assay of degradation products in pharmaceutical formulation // Journal Liquid Chromatography, 1994, 17, p. 2495–2509.
11.Renger B., Vegh Z. Validation of thin layer and high performance thin layer chromatographic methods // Journal of Chromatography, 2011, 1218, p. 2712–2721.
12.Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. – СПб.: Химиздат, 2005. 232 с.
Отзывы читателей
