eng
Выпуск #2/2015
С.Жохов, О.Шахнович
Всероссийский симпозиум "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии". Часть 2
Всероссийский симпозиум "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии". Часть 2
Просмотры: 3216
Мы продолжаем обзор аналитического оборудования,
которое российские и зарубежные компании представили
в рамках симпозиума, состоявшегося осенью 2014 года
на базе Кубанского университета. В этой части обзора
мы расскажем главным образом о современных системах для элементного анализа, газовой хроматографии
и хромато-масс-спектрометрии, рентгеновского
сканирования поверхностей. В докладах симпозиума также освещались новейшие методологические подходы – непрерывная хроматография и капиллярный электрофорез с масс-спектрометрическим детектированием, было представлено оборудование для реализации этих методов в лабораторных условиях
которое российские и зарубежные компании представили
в рамках симпозиума, состоявшегося осенью 2014 года
на базе Кубанского университета. В этой части обзора
мы расскажем главным образом о современных системах для элементного анализа, газовой хроматографии
и хромато-масс-спектрометрии, рентгеновского
сканирования поверхностей. В докладах симпозиума также освещались новейшие методологические подходы – непрерывная хроматография и капиллярный электрофорез с масс-спектрометрическим детектированием, было представлено оборудование для реализации этих методов в лабораторных условиях
Компания Bruker производит и поставляет в Россию жидкостные и газовые хромато-масс-спектрометры, оборудование для инфракрасной спектроскопии и микроскопии, рентгеновские спектрометры и спектрометры ядерного магнитного резонанса. Представительство Bruker в России появилось еще в 1970 году, когда началось активное сотрудничество компании с ведущими научно-исследовательскими организациями Советского Союза. В 1998 году представительство было преобразовано в ООО "Брукер", дочернюю структуру корпорации Bruker. Сейчас в OOO "Брукер" работает более 50 сертифицированных специалистов. Компания поставляет в Россию весь спектр приборов и программных пакетов, производимых и разрабатываемых Bruker, а также осуществляет сервис, послегарантийное обслуживание и методическую поддержку пользователей. В Москве действуют две демонстрационных лаборатории Bruker, в которых можно не только увидеть новейшие приборы, но и испытать их в действии.
На симпозиуме было представлено новейшее масс-спектрометрическое оборудование, жидкостные и газовые хромато-масс-спектрометры, а также готовые решения на основе масс-спектрометрии с уникальными программными разработками от компании Bruker. Их нам представил Дмитрий Александрович БУРМЫКИН, ведущий специалист отдела масс-спектрометрии и систем разделения ООО "Брукер".
"На данный момент компания Bruker располагает достаточно широким выбором масс-спектрометрического оборудования, начиная от традиционных жидкостных и газовых хромато-масс-спектрометров до систем ион-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием, обеспечивающих рекордное разрешение более 10 миллионов. Сейчас хотелось бы подробно остановиться на системах, которые используются в химическом анализе.
Наиболее простая из представленных систем – газовый хромато-масс-спектрометр с тройным квадруполем ГХ-МС/МС SCION TQ. Его главное применение – количественный анализ заданных соединений с высокой селективностью. Прибор позволяет количественно определять вещества с содержанием от 0,1 миллиардной доли (ppb) и ниже, при этом можно одновременно определять большое число компонентов. Так, в экстрактах из различных образцов продуктов питания могут количественно определяться одновременно до 250 различных пестицидов с содержаниями от 0,1 до 100 ppb. То есть линейный динамический диапазон определения превышает 4 порядка. Такой высокой чувствительностью и селективностью прибор обязан многим выгодным особенностям своей конструкции. Это аксиальный ионный источник, специальная ионная оптика с кривизной 90° и системой автофокусировки ионного пучка, искривленная ячейка столкновений U-образной формы, ортогональный интегрированный детектор с технологией Extended Dynamic Range (EDR). Путь ионного пучка многократно изменяет направление, что способствует устранению шума. Помимо высоких аналитических показателей, прибор отличается компактными размерами, простотой в эксплуатации, минимально низкими требованиями к сервисному обслуживанию, экономией времени за счет быстрого выхода на рабочий режим.
Среди масс-спектрометров, используемых в сочетании с жидкостной хроматографией, отдельного внимания заслуживает линейка EVOQ с тройным квадруполем. Масс-спектрометры EVOQ выпускаются в трех модификациях, Qube, Elite и Elite ER, они отличаются друг от друга по чувствительности и диапазону определяемых масс. В зависимости от задач клиента, масс-спектрометры могут комплектоваться жидкостными хроматографами Bruker Advance HPLC, UHPLC или UPLC-OLE, последний из которых оснащен системой онлайн-экстракции.
Масс-спектрометры EVOQ проектировались для рутинных анализов. Их главная цель – обеспечить надежное количественное определение тысяч соединений в реальных образцах за минимальное время. С ними можно рассчитывать на пределы обнаружения на уровне единиц фемтограммов и ниже, а также проводить многокомпонентный количественный анализ. Одна из главных задач разработчиков приборов – сохранение их высокой чувствительности максимально долгое время. Конструкция ионного источника и масс-анализатора является результатом внедрения передовых технологических решений. Источником ионов служит нагреваемый электроспрей VIP-HESI, не разрушающий термолабильные образцы. Также может применяться источник химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Использован вакуумный интерфейс без капилляров, который гарантирует, что образовавшиеся ионы мгновенно попадут в систему двойных ионных воронок. Эта система, в свою очередь, фокусирует поток ионов в узкий пучок, обеспечивая высокую чувствительность без специфических настроек прибора. Масс-анализатор имеет безлинзовый дизайн. Камера соударений выполнена в виде U-образной ячейки, изогнутой на 180°. Конструкция детектора способствует быстрому переключению полярности и повышает чувствительность в режиме отрицательных ионов.
Высокоселективное определение заданных соединений на приборах типа "тройной квадруполь" требует, чтобы в каждый конкретный момент времени масс-анализатор был бы настроен на анализ определенного родительского и дочернего иона. Если в этот момент вдруг появится другое, незапланированное соединение, оно, к сожалению, будет пропущено. Поэтому, для проведения обзорных анализов требуются масс-спектрометры высокого разрешения. Компания Bruker представила времяпролетные и квадруполь-времяпролетные системы, из которых наиболее современные, новинки последних двух лет – это квадруполь-времяпролетные масс-спектрометры Сompact, maXis impact и maXis. Настольный прибор для рутинных анализов Compact имеет разрешение 23 тыс., прибор исследовательского класса maXis impact, также настольный – 50 тыс., а наиболее продвинутый maXis для решения уникально сложных задач имеет напольную компоновку и разрешение 80 тыс.
Что отличает приборы последних двух лет от прежних моделей? Прежде всего, усовершенствованный детектор и ускоренный аналого-цифровой преобразователь (50 Гбит/сек), благодаря которым динамический диапазон расширен более чем до 105. То есть в одном спектре можно регистрировать пики, интенсивность которых различается в 100 тыс. раз. Новая конструкция ячейки соударений позволила повысить скорость работы в режиме МС/МС и улучшить трансмиссию ионов. Новый рефлектрон отвечает за высокое разрешение и стабильность шкалы масс. Новые высоковольтные блоки повышают стабильность работы прибора в целом.
Настоящее преимущество квадруполь-времяпролетных систем – их универсальность. На одном и том же приборе можно определять как сверхлегкие соединения с массами 30–40 Да, так и сверхтяжелые порядка 150 кДа, достаточно только задать нужный режим работы. Еще один плюс таких систем – получение правильной изотопной картины. Информация о соотношении интенсивностей изотопных пиков чрезвычайно полезна при подтверждении брутто-формул. Широкий динамический диапазон в сочетании с высоким разрешением дает возможность определить нужный пик на фоне матричной помехи, масса которой может отличаться всего на тысячные доли дальтона, а ее содержание может быть в десятки тысяч раз выше.
Типичные применения данных приборов – определение брутто-формул и многокомпонентный скрининг по точным массам. Необходимость подтверждения брутто-формул хорошо знакома всем химикам-синтетикам, а также тем, кто определяет неизвестные соединения. Чтобы однозначно установить элементный состав, масс-спектрометр должен определять массы с точностью лучше 0,05 ppm, что недостижимо. В реальной жизни можно рассчитывать на точность около 2 ppm. При этом в списке возможных соединений-кандидатов, скорее всего, окажется более десятка брутто-формул, имеющих одинаковый молекулярный вес. Анализ точной изотопной картины, получаемой на наших приборах, способен существенно сократить этот список. Но для уверенного однозначного определения формулы необходима фрагментация ионов с последующим анализом точных масс и изотопных картин получившихся фрагментов. Наши приборы дают такую возможность.
Многокомпонентный скрининг по точным массам позволяет сравнивать такие параметры, как отклонение измеряемого значения массы от теоретического, разницу реального и ожидаемого времени хроматографического удерживания, соответствие полученной и рассчитанной изотопных картин. Еще один плюс данного подхода – возможность ретроспективного анализа. Если в полученном образце присутствует какое-то соединение, которое в настоящий момент не требуется определять, но такая необходимость возникнет в будущем, то уже полученные хроматограммы можно будет проанализировать еще раз и установить, было ли в пробе определяемое соединение.
На базе масс-спектрометрического определения структуры соединений мы разработали ряд готовых решений. Самое интересное из них – это Pesticide Screenеr, предназначенное для высокопроизводительного скрининга пестицидов. Pesticide Screenеr делает возможной быструю и надежную идентификацию более 900 пестицидов на уровне миллиардных долей (ppb) в сложных матрицах, при этом доля ложноположительных результатов ничтожно мала. Решение составляют три компонента: система ВЭЖХ с четко определенной конфигурацией, квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр и программное обеспечение для расшифровки. Сердце этого решения – база данных, которая включает времена удерживания, точные массы определяемых соединений, картины изотопного распределения, данные о фрагментных ионах, получаемых при определенных режимах фрагментации, и, что самое важное, подтверждающие спектры фрагментных ионов, полученные в режиме так называемой широкополосной фрагментации, индуцированной соударениями (broad-band CID). В этом режиме все ионы, образующиеся в ионном источнике, подвергаются дальнейшей фрагментации, в результате получается спектр полного набора фрагментных ионов. При выходе пика из хроматографической колонки регистрируется одновременно масс-спектр молекулярных ионов соединений, содержащихся в этом пике, а также спектр всех фрагментов этих молекулярных ионов, полученный в режиме broad-band CID. Сравнение обоих спектров и картин изотопного распределения делает идентификацию соединений чрезвычайно надежной даже в случае совпадения времен удерживания и молекулярных масс.
Подобные решения для определения веществ заданных классов могут создаваться также на основе газовой хроматографии. В комплексной системе GC-APCI-TOF газовый хроматограф подключается к источнику химической ионизации при атмосферном давлении, а затем к квадруполь-времяпролетному масс-спектрометру. Гибкая переходная линия обеспечивает быстрое и легкое подключение газового хроматографа к ионному источнику и контроль температуры на всем пути от хроматографа до источника. Источник GC-APCI позволяет ионизировать значительное количество летучих органических соединений, получать достаточно интенсивные молекулярные ионы. Одно из применений таких систем – определение эфиров жирных кислот, для каждого из которых определяются брутто-формулы. Идентификация соединений после ГХ-МС анализа осуществляется с помощью пакета программ SmartFormula™.
В заключение хотелось бы упомянуть сложную гибридную систему o-TOF + ЯМР. Это гибрид спектрометра ядерного магнитного резонанса и квадруполь-времяпролетной системы, который позволяет проводить разделение образца методом ВЭЖХ и получать одновременно как масс-спектры, так и ЯМР-спектры. Система идеальна для идентификации неизвестных соединений: масс-спектр дает информацию о брутто-формуле, ЯМР – о структуре. Несмотря на дороговизну таких систем, они сейчас получают все большее распространение, как в России, так и за рубежом".
Компания Agilent Technologies уже более десятка лет удерживает лидирующее положение на рынке аналитического оборудования. Широкую известность в мире компания завоевала главным образом благодаря системам сверхбыстрой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии. Однако это далеко не единственное направление, где компания опережает многих своих конкурентов. На данном симпозиуме было представлено оборудование Agilent Technologies для элементного анализа – воплощение новейших технологий и научных разработок. Его нам представил и подробно описал ведущий специалист по спектральному оборудованию Михаил Иванович МЕЛЬНИК.
"Компания Agilent Technologies имеет собственные исследовательские центры, результаты работы которых быстро воплощаются в новом оборудовании. Многие разработки имеют научную и техническую новизну и защищены патентами. Agilent Technologies является правообладателем большинства патентов и технических новинок в области аналитического приборостроения. Для элементного анализа представлены три новинки последнего года: атомно-эмиссионный спектрометр с микроволновой плазмой 4200 MP-AES, одноквадрупольный масс-спектрометр с индуктивно-связанной плазмой 7900 ICP-MS и новейший, революционный оптико-эмиссионный спектрометр с индуктивно-связанной плазмой 5100 ICP-ОES.
Атомно-эмиссионный спектрометр Agilent 4200 MP-AES с микроволновой плазмой – это производительный и экономичный прибор по бюджетной цене. Он может служить идеальной заменой пламенным атомно-абсорбционным спектрометрам со значительным расширением возможностей по чувствительности и числу анализируемых элементов. По габаритам Agilent 4200 MP-AES не превосходит атомно-абсорбционные спектрометры, а весит он всего 73 кг. Прибор можно по праву считать наиболее безопасным в эксплуатации и обеспечивающим минимальную себестоимость анализа. В качестве газа для возбуждения плазмы используется азот. Не нужны горючие и токсичные газы – пропан-бутан, ацетилен или "проблемная" закись азота. А при наличии генератора азота можно вовсе забыть о баллонных газах и проблемах с их доставкой и хранением. Нет выбросов в окружающую среду продуктов сжигания и парниковых газов. Прибор использует воздушное охлаждение, не требуя водяных охладителей. Термостабилизированный монохроматор обеспечивает устойчивую работу в разных климатических условиях. Наконец, не нужно всегда поддерживать прибор в режиме готовности, расходуя газ и электричество. Достаточно включить его, провести анализ, а затем выключить.
В этом приборе впервые использована горелка кассетного типа, расположенная вертикально. Она исключительно просто устанавливается благодаря конструкции типа Plug & Play, с автоматическим подключением газов и автоюстировкой. Даже совсем неопытный пользователь не ошибется – горелка устанавливается по направляющим, и не надо думать, какой газ куда подключать.
Прибор открывает широкие возможности по анализу проб со сложной матрицей, таких как геохимические образцы, нефтепродукты, минеральные удобрения и продукты питания. Система ввода проб с новейшим распылителем OneNeb делает возможным анализ практически любых растворов. Даже после полутора суток непрерывной работы с растворами выщелачивания золота из минерального сырья нет никакого намека на необходимость очистки спектрометра! Что касается производительности, то всего за 5 мин можно проанализировать около 30 элементов в пробе, несмотря на то, что это последовательный инструмент. Наконец, хотелось бы отметить интуитивно понятное и простое программное обеспечение MP Expert, которое, помимо управления самим прибором, устраняет нежелательные спектральные интерференции, корректирует фон и межэлементное влияние в процессе анализа, содержит встроенные шаблоны методов анализа наиболее распространенных типов проб и модули их автоматической оптимизации.
Еще один класс оборудования для элементного анализа – масс-спектрометры с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС). Компания Agilent Technologies уже более 20 лет является признанным лидером на рынке масс-спектрометрического оборудования и выпускает самые разнообразные приборы для решения любых аналитических задач, где масс-спектрометрия может быть хотя бы как-то применена. В сегменте для элементного анализа представлены два прибора – высокопроизводительный 7900 ICP-MS, идеально подходящий для множественных рутинных анализов, и уникальный, тандемный 8800 ICP-MS с широчайшими возможностями для исследовательских задач, уникальных по сложности. Про этот последний прибор я не буду здесь подробно рассказывать – скажу лишь, что это первый и пока единственный в мире масс-спектрометр ИСП-МС с функцией тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) для элементного анализа.
Масс-спектрометр 7900 ICP-MS является логическим продолжением самой популярной в мире серии приборов Agilent 7700 ICP-MS. Появившись в 2009 году, эти приборы завоевали более половины мирового рынка спектрометров ИСП-МС. Несмотря на то что они уже тогда имели лучшие аналитические и метрологические характеристики, мы не остановились на достигнутом. Была поставлена задача улучшить еще как минимум в 10 раз все аналитические параметры – соотношение сигнал/шум, устойчивость к матрице, динамический диапазон, скорость считывания. В результате, новый спектрометр 7900 ICP-MS внедрил самые последние достижения – новый запатентованный детектор, новый ионный интерфейс, новую систему устранения полиатомных интерференций. Реализована уникальная возможность, прежде казавшаяся недостижимой для метода ИСП-МС – работа с чрезвычайно засоленными растворами, содержащими до 25% солей (до 250 г/л). Это стало возможным благодаря технологии UHMI (Ultra High Matrix Introduction). Аэрозоль образца с высокой точностью разбавляется аргоном, при этом степень разбавления регулируется в зависимости от засоленности анализируемых растворов.
Динамический диапазон заметно расширен по сравнению с приборами 7700 ICP-MS. Только у детектора линейный динамический диапазон составляет более 11 порядков, от 0,1 имп/с до 10 Гимп/с. Детектор теперь работает в 30 раз быстрее, что дает возможность следить за быстротекущими процессами. Это значительно расширило возможности по анализу наночастиц. Высокое соотношение сигнала к шуму обеспечивает новый ионный интерфейс и улучшенная ионная оптика. Так, предел обнаружения урана в водных растворах находится на уровне единиц ppq (10-15).
Возросла производительность спектрометра – 7900 ICP-MS позволяет анализировать более 60 проб в час. Для быстрого ввода пробы и старта работы применена система ISIS-3 (Integrated Sample Introduction System), оснащенная плунжерным насосом и семипортовым автоматическим краном. За счет автоматизации процессов промывки и тюнинга полностью устраняется эффект памяти. Для устранения полиатомных интерференций прибор использует октупольный коллизионно-реакционный интерфейс четвертого поколения (ORS4). Он обладает максимальной пропускной способностью и однородностью поля. Максимальная эффективность устранения полиатомных интерференций для любых типов проб достигается в режиме с использованием гелия, при этом частицы дискриминируются по кинетической энергии. Реакционные режимы с традиционными для них газами остаются доступными, но они, как правило, менее эффективны.
Кроме всех перечисленных достоинств, применено совершенно новое, интуитивно понятное и высокоэффективное программное обеспечение MassHunter, построенное по принципу многоуровневости. Первый уровень – для наименее опытных пользователей, а дальше вверх по уровню подготовки и освоения самого спектрометра. И еще одно полезное дополнение и, наверное, шаг навстречу современной моде: MassHunter имеет приложение для мобильных устройств, которое позволяет удаленно, с помощью смартфонов или планшетных компьютеров, управлять основными функциями спектрометра и выводить текущие результаты на экран мобильных устройств.
Новый оптико-эмиссионный спектрометр с индуктивно-связанной плазмой Agilent 5100 ICP-OES, сплав современных технологий и дизайна, был представлен мировому сообществу в июле 2014 года. Спектрометр воплотил в себе все последние достижения в данной области. Впервые внедрен синхронизированный вертикальный двойной обзор плазмы (SVDV, Synchronous Vertical Dual View), позволяющий одновременно регистрировать сигналы от радиального и аксиального обзоров плазмы. Это повышает производительность и удобство эксплуатации, в то же время экономит аргон. Сигналы от радиального и аксиального обзоров плазмы синхронизируются благодаря технологии дихроичного спектрального сумматора (DSC). Полученный суммарный сигнал регистрируется уникальным детектором нового поколения VistaChip II. Фактически, один спектрометр объединил в себе 4 инструмента – с синхронизированным вертикальным двойным обзором плазмы, с радиальным, с аксиальным и с обычным двойным обзором. Зачем тратить время и деньги на анализ проб на ИСП-ОЭС с обычным двойным обзором, делая при каждом анализе до четырех последовательных измерений, когда можно за одно измерение получить точные результаты для самых тяжелых проб на Agilent 5100? При этом время анализа 73 элементов в пробе составляет около полуминуты.
В Agilent 5100, подобно 4200 MP-AES, используются вертикальные горелки кассетного типа, которые легко устанавливаются и фиксируются, при этом юстировка и подключение газов производится автоматически. Конструкция горелки обеспечивает высокую устойчивость к матричным эффектам, позволяя анализировать пробы с концентрацией солей до 300 г/л. В системе ввода проб используются различные камеры распыления и высокоэффективные распылители, в том числе SeaSpray и OneNeb. Высокосолевые растворы и взвеси теперь можно анализировать практически без ущерба для чувствительности, а универсальный распылитель OneNeb безопасно работает даже с растворами, содержащими плавиковую кислоту.
Хорошо зарекомендовавшая себя технология "охлаждаемого конуса" с противотоком аргона позволяет эффективно устранять "холодный" хвост плазмы для аксиального обзора и связанные с ним матричные эффекты. Исключительная аналитическая стабильность обеспечивается еще и новейшим, запатентованным твердотельным ВЧ-генератором. Даже при анализе растворов, содержащих 25% солей, сохраняется высокая долговременная стабильность: при непрерывном анализе элементов на фоне 25% NaCl в течение 4 ч общая погрешность не превышает 1,3%. Высокая аналитическая стабильность особенно важна при анализе очень "сложных" проб – например, определения щелочных металлов на фоне высокой концентрации других щелочных металлов.
Нужно признать, что многие аналитические лаборатории сейчас испытывают проблемы с квалифицированными специалистами. Поэтому последние разработки направлены в том числе и на то, чтобы приборы могли обслуживать лаборанты невысокой квалификации. Agilent 5100 ICP-OES весьма прост в эксплуатации и обслуживании. Как уже отмечалось, горелка кассетного типа очень удобна в плане подключения и замены. Кроме того, у спектрометра обеспечен легкий доступ к местам подключения электричества, газов, системы охлаждения, очень просто подключается система ввода проб. Работу можно начинать уже через 10–15 минут после включения прибора. Впервые применена технология смарт-электроники, то есть самодиагностируемой электроники. При включении посылается запрос на все блоки управления и, в случае каких-либо проблем, тут же запускаются диагностические процедуры. Программное обеспечение ICP Expert интуитивно понятно и очень эффективно для быстрой и простой разработки методов, истинной корректировки фона, устранения спектральных интерференций и межэлементного влияния.
На этих нескольких примерах я хотел показать, что компания Agilent вносит существенный вклад в инновационное развитие аналитических методов и разработки новейшего оборудования. Представленные системы обладают отличными аналитическими и метрологическими характеристиками и позволяют пользователям получить наилучшие результаты".
Группа компаний "Аналит" – крупнейший в России генеральный дистрибьютор японской корпорации Shimadzu, ведущего мирового производителя аналитического и испытательного оборудования. Группа компаний, основанная в 1992 году, имеет представительства в Москве, Санкт-Петербурге, Нижнем Новгороде, Казани и Уфе. Помимо сотрудничества с Shimadzu, ГК "Аналит" поставляет в Россию приборы, реактивы и расходные материалы многих известных производителей, таких как Merck Millipore, LECO, Mettler Toledo, LabTech, Sigma-Aldrich, Retsch, Anton Paar, Markes Int. и других. В сферу деятельности компании входит также комплексное оснащение лабораторий – поставка оборудования, расходных материалов и мебели, методическая и сервисная поддержка, обучение персонала. ГК "Аналит" имеет собственную аккредитованную лабораторию и учебный центр в Санкт-Петербурге, где можно ознакомиться с основными видами предлагаемого оборудования. В 2014 году была также открыта демонстрационная лаборатория ГК "Аналит" в Москве.
На данном симпозиуме ГК "Аналит" представила множество разнообразных приборов и систем от компании Shimadzu. Большинство из них было подробно описано в обзорной статье предыдущего выпуска нашего журнала (Жохов С. Shimadzu: практические решения и высокотехнологичные новинки для фармацевтических и клинических лабораторий. – Аналитика, 2015, № 1, с. 54–66. Отдельную статью мы посвятили наиболее высокотехнологичному прибору – масс-микроскопу iMScope Trio (Фармаковский Д. Молекулярная визуализация с помощью масс-микроскопа iMScope TRIO. – Аналитика, 2014, № 6, с. 82-87).
Разнообразие продукции Shimadzu столь велико, что его невозможно полностью описать одной журнальной статьей. В настоящем обзоре мы рассмотрим газовые хроматографы и хромато-масс-спектрометры, рентгеновские спектрометры, электронно-зондовые микроскопы для исследования поверхности. Их нам представил руководитель группы компаний "Аналит", к.х.н. Илья Львович ГРИНШТЕЙН.
"Корпорация Shimadzu входит в пятерку крупнейших мировых производителей аналитического оборудования. В ее обширном каталоге имеются системы жидкостной и газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии, масс-спектрометры и масс-микроскопы MALDI, оптические и ИК-Фурье-спектрометры, рентгеновские спектрометры и дифрактометры, приборы для определения элементного состава, анализаторы общего органического углерода и азота, анализаторы размеров частиц, секвенаторы белков и нуклеиновых кислот, анализаторы влажности и т.д. При разработке аналитического оборудования Shimadzu заимствует опыт из смежных сфер своей деятельности – это оптическая и электронная промышленность, производство медицинского и аэрокосмического оборудования.
Газовая и жидкостная хроматография и хроматомасс-спектрометрия традиционно является одним из наиболее сильных направлений Shimadzu. Компания производит газовые хроматографы с 1956 года, то есть уже почти 60 лет. Нынешняя линейка включает модели GC-2010Plus, GC-2014, GC-2025. Все они поддерживают режим быстрой хроматографии, что сокращает время анализа более чем на порядок.
Газовый хроматограф GС-2010Plus использует передовую технологию распределения газовых потоков (AFT, Advanced Flow Technology), которая направляет выходящий с колонки поток на несколько детекторов. Эта же технология обеспечивает процедуру обратной продувки колонки газом-носителем, которая необходима для удаления высококипящих компонентов, загрязняющих колонку. Хроматограф комплектуется высокочувствительными детекторами серии 2010 Plus – можно подключать одновременно до четырех различных детекторов. Наиболее часто используемый детектор – пламенно-ионизационный (FID). Особо нужно отметить новый электронно-захватный детектор ECD-2010 Exceed с технологией бесконтактных потоков.
На базе GС-2010Plus была разработана хроматографическая система Tracera, оснащенная уникальным ионизационным детектором барьерного разряда (Barrier Discharge Ionization Detector, BID), новейшей разработкой Shimadzu. Система определяет следовые количества соединений различной природы, в том числе таких, которые не обнаруживаются стандартными детекторами, или определяются ими с большим трудом. Детектор BID имеет в основе холодную гелиевую плазму. Новый детектор BID-2010 объединяет возможности пламенно-ионизационного детектора и катарометра, но превосходит по чувствительности первый из них вдвое, а второй – на два порядка.
Газовый хроматограф GC-2014 идеально адаптирован для работы с насадочными колонками, но может применяться и для капиллярной хроматографии. К нему можно подключать одновременно до трех инжекторов и четырех детекторов, каждый из которых имеет независимый температурный контроль. Это дает возможность конфигурировать систему практически для любых приложений. Хроматограф GC-2025 отличается исключительной экономичностью и компактностью. Подобно предыдущим моделям, он оснащен цифровым контроллером газовых потоков и современными детекторами.
Газовые хромато-масс-спектрометры GCMS-QP 2010SE и GCMS-QP 2010Ultra разработаны на основе хроматографа GC-2010 Plus и одноквадрупольных масс-спектрометрических детекторов. GCMS-QP 2010SE – экономичная модель среднего класса, пришедшая на смену прибору GCMS-QP2010S и имеющая в сравнении с ним улучшенные аналитические характеристики. Модель GCMS-QP 2010Ultra использует новейшую запатентованную технологию автоматической оптимизации квадрупольного напряжения ASSP (Advanced Scan Speed Protocol), повышающую скорость сканирования до 20000 а.е.м./сек без потери чувствительности или искажений спектра. Функция FASST (Fast Automated Scan/SIM Type) позволяет при этой скорости сканирования регистрировать одновременно полный ионный ток и выбранные ионы – работать сразу в двух режимах.
Тандемный газовый хромато-масс-спектрометр с тройным квадруполем GCMS-TQ8040 воплотил в себе целый комплекс интеллектуальных технологий "Smart". Технология высокой производительности "Smart Performance" сочетает высокую скорость сканирования (20000 а.е.м./сек; использован протокол ASSP, как и в предыдущей модели) c применением высокоскоростной ячейки соударений UFsweeper™. В режиме тандемной масс-спектрометрии можно регистрировать до 800 MRM-переходов в секунду или до 32768 MRM-переходов за один анализ. Технология высокой эффективности "Smart Productivity" основана на подборе оптимального времени регистрации каждого целевого соединения, которое соответствует продолжительности его элюирования из колонки, то есть ширине пика. Благодаря этому, можно одновременно определять большое число целевых соединений разных классов. Наконец, технология интеллектуального управления "Smart Operation" автоматически устанавливает многочисленные параметры работы прибора и задает условия анализа для тандемной масс-спектрометрии. Теперь пользователь избавлен от необходимости делать это вручную.
Рентгеновские приборы и оборудование для исследования поверхности – это те области, где японские производители традиционно очень сильны. Кроме Shimadzu, ведущими игроками на этом рынке являются компании JEOL, Rigaku и Horiba. Компания Shimadzu производит энергодисперсионные и волнодисперсионные рентгенофлуоресцентные спектрометры, а также рентгеновские дифрактометры, электроннозондовые микроанализаторы и сканирующие зондовые микроскопы с абсолютно уникальными характеристиками.
Новая серия энергодисперсионных спектрометров EDX-7000/8000 была удостоена золотой награды IBO Design Awards 2014 года в сфере промышленного дизайна. В приборах установлены высокоскоростные кремниевые SDD детекторы (Silicon Drift Detеctor), не требующие охлаждения жидким азотом. Такие детекторы делают разрешающую способность прибора сравнимой с волнодисперсионными спектрометрами; при оптимальных условиях анализа разрешение достигает 125 эВ. Для ряда элементов предел обнаружения снижен примерно до 0,5 ppm (5 × 10-5% по массе) анализируемых элементов в твердых образцах. Диапазон определяемых элементов – от натрия (EDX-7000) или углерода (EDX-8000) до урана. Приборы очень компактны, весят менее 45 кг, при этом камера для образцов позволяет размещать в ней пробы размерами до 300 мм по ширине.
Среди волнодисперсионных приборов нужно отметить сканирующий спектрометр XRF-1800 LabCenter. Это один из мощнейших рентгенофлуоресцентных спектрометров, представленных на современном рынке. Он применяется для анализа горных пород, руды, силикатных, магнитных материалов, а также в химической, нефтяной, цементной, угольной и других отраслях промышленности. Качественный и количественный анализ всех элементов от бериллия до урана может быть выполнен всего за 2,5 минуты. Прибор отличает возможность локального анализа в любой точке поверхности образца с дискретностью 0,25 мм. К тому же, с помощью линий Комптоновского рассеяния можно определять толщину и элементный состав тонких пленок – за эту возможность отвечает новая запатентованная технология Shimadzu.
Рентгеновские дифрактометры представлены двумя моделями – XRD-6100 и XRD-7000. Дифрактометр XRD-7000 построен по θ-θ схеме, обеспечивающей неподвижность образца во время измерений. Этот прибор позволяет работать с образцами очень большого размера. Обе модели оснащены высокоскоростным широкополосным полупроводниковым детектором OneSight или традиционными сцинтилляционными детекторами.
Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) — один из наиболее мощных современных методов исследования структуры и локальных свойств поверхности. Методом СЗМ можно получать цифровые трехмерные изображения атомных решеток, живых клеток, молекулярной структуры полимеров. Компания Shimadzu производит микроскопы SPM-9700 и SPM-8000FM со сменными кантилеверами, обеспечивающими различные режимы работы, в том числе режим атомно-силового микроскопа. Приборы могут размещаться внутри климатических блоков в условиях полного контроля температуры, влажности и давления – это изюминка Shimadzu. Это крайне важно, поскольку позволяет избавиться от броуновского и когерентного шума, резко снижающего эффективность работы приборов в конденсированных средах и на воздухе.
Электронно-зондовый микроанализатор ЕPMA-8050G – мощнейшая на данный момент система для исследования микро-, нанообъектов и поверхности. Он представляет собой комбинацию мощного электронного микроскопа с разрешением 3 нм и пяти двухкристальных волнодисперсионных рентгенофлуоресцентных спектрометров-анализаторов. Таким образом, можно при необходимости совмещать оптическое и рентгеновское изображение. ЕPMA-8050G обеспечивает возможность проведения прецизионного элементного анализа, определения фазовой структуры и химического состояния исследуемых элементов.
В заключение приведу несколько примеров использования такого оборудования. С помощью электронно-зондового микроанализатора можно, например, в срезе ткани, пораженной онкологическим заболеванием, отследить проникновение лекарства, содержащего платину, непосредственно в опухолевые клетки. В образцах металлических сплавов можно обнаруживать неоднородности распределения составляющих металлов площадью менее квадратного микрона, а затем на основе суммарной площади и общего числа таких неоднородностей делать выводы о свойствах анализируемых сплавов. Атомно-силовой микроскоп серии SPM-8000FM дает возможность наблюдать, например, наведенную кристаллическую структуру мономолекулярных слоев жидкости, прилегающих к подложке.
Все это свидетельствует о принадлежности корпорации Shimadzu к мировому клубу наиболее продвинутых и инновационных производителей оборудования для инструментального исследования состава и свойств веществ. Корпорация снова и снова оправдывает свой девиз – "Процветание человечества с помощью науки и технологии".
ЗАО "БиоХимМак СТ" было создано в 1998 году сотрудниками Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова на базе отдела, существовавшего в составе ЗАО "БиоХимМак" с 1990 года. Компания разрабатывает технологические решения на базе препаративной жидкостной хроматографии в пилотном и промышленном масштабах и сейчас успешно конкурирует с зарубежными фирмами на российском рынке в плане развития методологий получения высокоочищенных субстанций природного, синтетического и биотехнологического происхождения. ЗАО "БиоХимМак СТ" стабильно поставляет в Россию хроматографические системы, оборудование для органического синтеза, сорбенты и реактивы западноевропейских фирм-производителей, таких как Biotage Sweden AB, Knauer GmbH, Resindion SRL, Akzo Nobel Chemicals AB (производитель сорбентов под торговой маркой Kromasil), и других. В отношении всех этих фирм ЗАО "БиоХимМак СТ" имеет статус их официального представителя.
Непрерывные хроматографические технологии – новый эффективный подход к очистке соединений в лабораторном и промышленном масштабах, даже если их содержание составляет всего доли процента. Для их реализации в автоматическом режиме была разработана специальная платформа Contichrom®, производимая фирмой Сhromacon (Швейцария) и предлагаемая российским пользователям ЗАО "БиоХимМак СТ". Об этой платформе, о принципах непрерывных технологий и основных сферах их применения нам рассказал генеральный директор ЗАО "БиоХимМак СТ" Сергей Михайлович СТАРОВЕРОВ.
"Технологии непрерывной хроматографии представляют собой мощный инструмент для тех случаев, когда в течение одного хроматографического цикла не удается полностью отделить целевой продукт от примесей и получить его в чистом виде. Суть метода в том, что определенная часть продуктов хроматографического разделения заново наносится на ту же колонку, или идентичную по параметрам. Этот процесс повторяется многократно. Сейчас для сложных случаев разделения все чаще применяется двумерная хроматография, которая принципиально отличается от непрерывных технологий тем, что в первом и втором цикле разделения используются разные хроматографические режимы и, как правило, разные колонки. Внедрение двумерных технологий в препаративных и промышленных масштабах связано с большими техническими сложностями, поэтому сегодня их применение, как правило, ограничивается аналитическими масштабами.
Селективность обычных колонок зачастую бывает недостаточной, чтобы идеально выделить целевой компонент из смеси, особенно при высоких нагрузках. При этом может наблюдаться так называемая "чистая зона", когда какая-то часть пика не перекрывается с пиками примесей, то есть соответствующая фракция уже содержит чистый компонент и не требует доочистки. Остальные части пика, обычно по его краям, перекрываются с другими пиками и представляют собой "смешанные зоны" – эти фракции нужно очищать повторно. Яркий пример – оптические изомеры. Для их разделения, подбор высокоселективного метода может быть вовсе невыполнимой задачей. При неидеальном разделении в препаративной хроматографии приходится выбирать "одно из двух зол" – либо собирать только чистые фракции, но тогда выход целевого продукта будет низким, либо также и часть "смешанных зон", но тогда будет низкая чистота.
Действительно, в реальных случаях мы сталкиваемся с ситуацией, когда основной компонент, так сказать, "закрыт примесями и с фронта, и с тыла". И зачастую всеми ухищрениями, усилениями селективности не удается создать метод, которым можно извлечь более 50–60% вещества в чистом виде. В препаративных процессах это ведет к огромным неоправданным расходам и трудозатратам. Еще сложнее та ситуация, когда целевое соединение само является примесью в сложной системе, и его содержание – на уровне долей процента. Его пик может быть полностью закрыт более интенсивными пиками. Тогда нужно использовать самые изощренные специальные техники, чтобы только лишь получить информацию об этом соединении, не говоря уже о его препаративном извлечении в чистом виде. Иногда на помощь приходит аффинная хроматография, но далеко не всегда удается найти специфический сорбент именно для интересующего соединения.
Метод многоколоночной противоточной хроматографии в градиенте подвижной фазы (Multicolumn Countercurrent Solvent Gradient Purification, MCSGP) – результат 20-летнего труда научной группы профессора Морбиделли (Massimo Morbidelli) в Цюрихе. Процесс разделения на двух или нескольких идентичных колонках организован так, чтобы извлечь максимально возможный процент целевого продукта из сложной смеси, при этом требуемая чистота продукта задается заранее. Применение этого метода на практике увеличивает производительность процесса в 3–10 раз, а степень чистоты продукта строго контролируется. Существенно, что при этом до 50% увеличивается выход и до 70% снижается расход элюента.
Мы рассмотрим основной вариант метода, где используются две одинаковые колонки. В процессе первого разделения, фракция "чистой зоны" (с целевым веществом, не требующим доочистки) направляется непосредственно в емкость для сбора чистого продукта. Фракции вообще без целевого компонента идут в слив. Все "смешанные зоны" объединяются и поступают на вторую колонку. Перед повторным нанесением они разбавляются начальным буфером, и к ним добавляется новая порция исходного образца. Исключительно важно при этом уйти от той точки градиента, где целевое вещество элюируется, иначе оно размоется по колонке. Пока на второй колонке идет разделение, первая колонка регенерируется и подготавливается к следующему аналогичному циклу. Так повторяется до тех пор, пока целевой продукт не будет извлечен из смеси с требуемой чистотой, которая задается в самом начале процесса точками переключения на хроматограмме. Заметим, что данная технология даже не требует коллектора фракций. Нужны только две емкости: одна для сбора всех промежуточных фракций, включая регенерационные смывы, вторая – для чистого продукта.
Метод Capture SMB (silmulated moving bed) – непрерывная технология аффинной хроматографии, когда две одинаковые колонки располагаются друг за другом. Когда первая колонка насыщается, и целевой компонент начинает проскакивать, его захватывает вторая колонка. Было показано, что производительность при такой технологии возрастает вдвое по сравнению с тем случаем, когда применяется одна "большая" колонка с двойным объемом сорбента. Так, вместо одной литровой колонки можно без ущерба для производительности использовать две последовательные по 250 мл.
Метод N-Rich предназначен для тех наиболее сложных случаев, когда интересующее вещество – это небольшая примесь с низким содержанием, и его пик может быть почти целиком закрыт другими, более интенсивными пиками. Такие вещества нужно выделять из большого количества образца, которое нельзя наносить на колонку все сразу, во избежание перегрузки. Метод состоит из трех этапов. Задача первого этапа – сконцентрировать целевой продукт, повысив его абсолютную концентрацию в пробе и процентное содержание относительно других, мешающих компонентов. После первого цикла вся зона целевого пика ("чистая" плюс "смешанная") поступает на повторное разделение на такой же колонке, при этом к ней примешивается еще одна порция чистого образца. Так до тех пор, пока весь объем образца не поступит на колонку. Затем проводят несколько циклов второго этапа – все то же самое, но без введения новых порций образца. Концентрация целевого продукта в результате остается постоянной, а примеси постепенно истощаются. Третий этап – окончательное фракционирование с выделением целевого компонента. Отличие от метода MCSGP здесь в том, что весь целевой продукт прогоняется по колонке много раз, и даже самые очищенные фракции не поступают в коллектор до окончания всего процесса.
Платформа Contichrom®, разработанная швейцарской компанией ChromaCon, и оборудование, производимое этой компанией совместно с немецкой фирмой Knauer GmbH, представителями которых мы являемся, позволяют реализовать все эти методы в автоматическом режиме. Мы предлагаем систему Contichrom® Lab-10 для лабораторных масштабов (до 20 граммов целевого продукта в день) и аналогичную ей Contichrom® Prep-100 для препаративных масштабов (до 200 граммов в день). Промышленные системы требуемой мощности (без ограничений) в соответствии с требованиями GMP производятся под заказ. Все платформы оснащены программным обеспечением, контролирующим и автоматизирующим весь процесс, а также позволяющим легко разрабатывать конкретные методики, использующие данный принцип.
Работа на таких сложных системах в режиме MCSGP начинается с получения обыкновенной хроматограммы препаративного разделения образца. Затем делается фракционный анализ, где пользователь отмечает фракции "чистой зоны", содержащие продукт нужной степени очистки (95%, 99% и т.п.) и "смешанные зоны". После этого система сама составляет программу переключения и разбавления фракций. Установив вторую аналогичную колонку, можно начинать процесс в автоматическом режиме.
Применение метода N-Rich – это, прежде всего, исследование микрокомпонентов и биомаркеров. В ряде случаев бывает даже неизвестно, селективность какого типа надо применить, чтобы извлечь компонент. Бывает, что даже его пик на хроматограмме не виден отчетливо. Может вовсе не быть никакой доступной информации, кроме предположения, что данный биомаркер должен выходить в определенной точке градиента. Технология N-Rich позволит сконцентрировать нужную часть хроматограммы – на практике это будет концентрирование примерно в 1000 раз.
Второе применение метода – получение стандартов примесей в фармацевтике. Согласно ныне действующим требованиям, если лекарственный препарат содержит примесь на уровне 0,1% и выше, ее необходимо выделить в чистом виде и провести ряд биологических испытаний. В обычных лабораториях выделение может занять много месяцев. Платформа Contichrom® в режиме N-Rich позволяет извлечь примесь за одну ночь, в особо сложных случаях это займет несколько дней, при этом присутствие оператора не потребуется.
Где непрерывные технологии уже нашли применение и показали интересные результаты? В классе низкомолекулярных соединений, это прежде всего очистка синтетических пептидов и непредельных жирных кислот. Среди высокомолекулярных – это, в первую очередь, моноклональные антитела, особенно новое поколение гуманизированных моноклональных антител, где разделение может быть очень сложным. Или продукты второй генерации. Например, пегилированные белки, белки плазмы крови. Плазма крови – труднодоступное сырье, ее надо беречь. Среди прочих возможностей применения есть первые успешные попытки разделения редкоземельных элементов в системах непрерывных технологий.
Наконец, хочу отметить авторитетное мнение директора FDA: в течение последующих 25 лет подобные методы непрерывной хроматографии станут основной технологией получения высокоочищенных субстанций, если не появятся еще какие-то новые, более передовые техники.
ООО "Агентство Химэксперт" является официальным дистрибьютором корпораций Sciex и Life Technologies на российском рынке, а также поставщиком реактивов и расходных материалов зарубежных компаний Applied Biosystems, Invitrogen, Ion Torrent и Ambion. Американская корпорация Sciex, часть глобального концерна Danaher Corporation – один из ведущих мировых производителей оборудования и реактивов для биотехнологических исследований. В 2013 году компания Sciex присоединила к себе отделы по производству и разработке систем капиллярного электрофореза, которые ранее входили в состав корпорации Beckman Coulter.
Компания Sciex разрабатывает подходы по интеграции капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием. Одна из наиболее успешных разработок, новинка 2014 года – система СESI-8000, комбинирующая технологии капиллярного электрофореза и ионизации методом электрораспыления. Благодаря усилиям ООО "Агентство Химэксперт", данная система стабильно поставляется и обслуживается на территории России. О достоинствах этого прибора, а также о широких возможностях применения метода капиллярного электрофореза в современных биотехнологических и биофармацевтических лабораториях, нам рассказал ведущий эксперт по методам разделения веществ ООО "Агентство Химэксперт" Александр Анатольевич КИРИЛЮК.
"Капиллярный электрофорез является таким же мощным и производительным методом разделения молекул, как и жидкостная хроматография, несмотря на его менее широкую распространенность. Можно сказать, капиллярный электрофорез и ВЭЖХ – дополняющие друг друга методы. Если разделяемые вещества заряжены или сильно полярны, то капиллярный электрофорез более предпочтителен – особенно для тех случаев, когда исходный образец содержит множество заряженных и полярных аналитов. Метод достаточно надежный и легко переносится с одних платформ на другие, чего нельзя сказать о ВЭЖХ, когда при замене колонки или системы изменяются сразу многие параметры.
Системы капиллярного электрофореза чаще всего используют традиционные методы детектирования – оптические или флуоресцентные детекторы. Масс-спектрометрическое детектирование, очевидно, имеет ряд преимуществ. Если один пик содержит сразу несколько соединений, близких по электрофоретической подвижности, то с помощью масс-спектрометра их можно обнаруживать по отдельности. Помимо этого, детектируются соединения, которые не поглощают в УФ и видимой области и не обладают флуоресцентными свойствами. Традиционные оптические детекторы их вовсе не обнаруживают.
Оснащение системы капиллярного электрофореза масс-спектрометрическим детектором долгое время было непростой задачей. Первые попытки объединить эти два метода были предприняты еще в 1980-е годы. Конец электрофоретического капилляра помещался в футляр, где происходило электрораспыление. При этом снаружи капилляр омывался поддерживающей жидкостью (sheath liquid), которая разбавляла электрофорезный буфер с анализируемыми веществами. Это сильно снижало чувствительность определения. Дальнейшие исследования показали, что на чувствительность и нежелательные эффекты ионной супрессии заметно влияет скорость потока электрофорезного буфера. При сверхнизких скоростях, около 10–20 нанолитров в минуту, ионная супрессия практически отсутствует, а чувствительность – довольно высокая. Однако при увеличении скорости даже до 50 нл/мин чувствительность снижается в три раза. Низкие скорости потока предпочтительны потому, что при электрораспылении образуются капли микроскопических размеров.
Система CESI-8000 представляет собой весьма удачную комбинацию капиллярного электрофореза и последующей ионизации электрораспылением – они сливаются в единый динамический процесс. Интегрированность двух методов отражена даже в самом названии системы: CESI = CE (capillary electrophoresis) + ESI (electrospray ionization). В основе решения лежит технология OptiMS – электрофоретическое поле и распыляющее напряжение разобщены друг с другом. Через пористый конец электрофоретического капилляра могут свободно перемещаться электроны, но не проходят жидкости и анализируемые молекулы. Эта часть капилляра в виде его наконечника заключена в металлическую иглу, на которую подается распыляющее напряжение. При такой технологии распыления не нужно высокое напряжение, достаточно всего 1,25 кВ. Пространство внутри иглы заполнено так называемой кондуктивной жидкостью, которая не расходуется и периодически заменяется. Для нее предусмотрен специальный капилляр, идущий параллельно разделяющему капилляру. Не требуется потока поддерживающей жидкости (sheath liquid), что гарантирует отсутствие разбавления и нарушения потока даже при сверхнизких скоростях. Распыленный образец впрыскивается непосредственно в масс-спектрометр. Система работает при сверхнизких скоростях электрофоретического потока, 30 нл/мин и ниже.
Распыляющая игла, внутри которой содержится конец капилляра, в свою очередь, заключена в защитный картридж. Вся эта конструкция легко вставляется в масс-спектрометр, по принципу "plug-and-spray" – достаточно вставить и сразу можно начинать работу, без дополнительных настроек. Такая конструкция совместима с масс-спектрометрами большинства производителей. Картридж и содержащийся в нем интерфейс ионизации при необходимости можно заменять за минуты, не разбирая саму электрофоретическую систему.
Технология капиллярного электрофореза с электрораспылением и последующим масс-спектрометрическим анализом (CESI-MS) может иметь множество применений в биотехнологии и биофармацевтике. В первую очередь, это анализ крупных молекул, а также высокомолекулярных комплексов, в которых компоненты не связаны ковалентно. Крупные молекулы – это прежде всего белки, в том числе интактные, в нативной конформации. Сюда относятся биологически значимые белковые молекулы – ростовые факторы, интерфероны, интерлейкины, белковые вакцины и т.п. При анализе посттрансляционных модификаций капиллярный электрофорез имеет преимущества перед ВЭЖХ. Например, белок или пептид с множеством полярных фосфатных групп может не удерживаться на ВЭЖХ-колонке и выходить в свободном объеме.
К нативным высокомолекулярным комплексам, для анализа которых может успешно применяться технология CESI, относятся прежде всего антитела – моноклональные и с пришитыми лекарственными веществами (antibody-drug conjugates). Рынок моноклональных антител, применяемых в клинике, сейчас расширяется взрывным образом – за последние семь-десять лет он практически удвоился. Для субъединичных белковых комплексов крупных размеров метод капиллярного электрофореза также показывает значимые результаты. Был описан успешный анализ комплекса из 18 молекул с общей массой в 1,3 МДа, при этом исходная структура комплекса полностью сохранилась.
Технология CESI-MS обеспечивает полное покрытие пептидной последовательности, включая посттрансляционные модификации, в течение одного анализа. Этот метод совершенно незаменим, например, в задачах по характеристике качества антител, в том числе, при анализе так называемых "горячих точек", где происходят какие-то изменения, свойственные данному классу антител – например, окисление или характерные посттрансляционные модификации. ВЭЖХ-МС не дает возможности анализировать короткие и длинные пептиды одновременно: или короткие выходят в свободном объеме, или длинные застревают на колонке. В отличие от этого, CESI-MS позволяет сразу анализировать белки и пептиды, заметно различающиеся и по длине, и по числу и характеру посттрансляционных модификаций. Есть примеры одновременного детектирования модифицированных и немодифицированных пептидов, что происходит достаточно легко. Как говорилось в самом начале, метод капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием дополняет ВЭЖХ-МС, и комбинация этих методов может дать наиболее полную информацию об анализируемых веществах".
На симпозиуме было представлено новейшее масс-спектрометрическое оборудование, жидкостные и газовые хромато-масс-спектрометры, а также готовые решения на основе масс-спектрометрии с уникальными программными разработками от компании Bruker. Их нам представил Дмитрий Александрович БУРМЫКИН, ведущий специалист отдела масс-спектрометрии и систем разделения ООО "Брукер".
"На данный момент компания Bruker располагает достаточно широким выбором масс-спектрометрического оборудования, начиная от традиционных жидкостных и газовых хромато-масс-спектрометров до систем ион-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием, обеспечивающих рекордное разрешение более 10 миллионов. Сейчас хотелось бы подробно остановиться на системах, которые используются в химическом анализе.
Наиболее простая из представленных систем – газовый хромато-масс-спектрометр с тройным квадруполем ГХ-МС/МС SCION TQ. Его главное применение – количественный анализ заданных соединений с высокой селективностью. Прибор позволяет количественно определять вещества с содержанием от 0,1 миллиардной доли (ppb) и ниже, при этом можно одновременно определять большое число компонентов. Так, в экстрактах из различных образцов продуктов питания могут количественно определяться одновременно до 250 различных пестицидов с содержаниями от 0,1 до 100 ppb. То есть линейный динамический диапазон определения превышает 4 порядка. Такой высокой чувствительностью и селективностью прибор обязан многим выгодным особенностям своей конструкции. Это аксиальный ионный источник, специальная ионная оптика с кривизной 90° и системой автофокусировки ионного пучка, искривленная ячейка столкновений U-образной формы, ортогональный интегрированный детектор с технологией Extended Dynamic Range (EDR). Путь ионного пучка многократно изменяет направление, что способствует устранению шума. Помимо высоких аналитических показателей, прибор отличается компактными размерами, простотой в эксплуатации, минимально низкими требованиями к сервисному обслуживанию, экономией времени за счет быстрого выхода на рабочий режим.
Среди масс-спектрометров, используемых в сочетании с жидкостной хроматографией, отдельного внимания заслуживает линейка EVOQ с тройным квадруполем. Масс-спектрометры EVOQ выпускаются в трех модификациях, Qube, Elite и Elite ER, они отличаются друг от друга по чувствительности и диапазону определяемых масс. В зависимости от задач клиента, масс-спектрометры могут комплектоваться жидкостными хроматографами Bruker Advance HPLC, UHPLC или UPLC-OLE, последний из которых оснащен системой онлайн-экстракции.
Масс-спектрометры EVOQ проектировались для рутинных анализов. Их главная цель – обеспечить надежное количественное определение тысяч соединений в реальных образцах за минимальное время. С ними можно рассчитывать на пределы обнаружения на уровне единиц фемтограммов и ниже, а также проводить многокомпонентный количественный анализ. Одна из главных задач разработчиков приборов – сохранение их высокой чувствительности максимально долгое время. Конструкция ионного источника и масс-анализатора является результатом внедрения передовых технологических решений. Источником ионов служит нагреваемый электроспрей VIP-HESI, не разрушающий термолабильные образцы. Также может применяться источник химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Использован вакуумный интерфейс без капилляров, который гарантирует, что образовавшиеся ионы мгновенно попадут в систему двойных ионных воронок. Эта система, в свою очередь, фокусирует поток ионов в узкий пучок, обеспечивая высокую чувствительность без специфических настроек прибора. Масс-анализатор имеет безлинзовый дизайн. Камера соударений выполнена в виде U-образной ячейки, изогнутой на 180°. Конструкция детектора способствует быстрому переключению полярности и повышает чувствительность в режиме отрицательных ионов.
Высокоселективное определение заданных соединений на приборах типа "тройной квадруполь" требует, чтобы в каждый конкретный момент времени масс-анализатор был бы настроен на анализ определенного родительского и дочернего иона. Если в этот момент вдруг появится другое, незапланированное соединение, оно, к сожалению, будет пропущено. Поэтому, для проведения обзорных анализов требуются масс-спектрометры высокого разрешения. Компания Bruker представила времяпролетные и квадруполь-времяпролетные системы, из которых наиболее современные, новинки последних двух лет – это квадруполь-времяпролетные масс-спектрометры Сompact, maXis impact и maXis. Настольный прибор для рутинных анализов Compact имеет разрешение 23 тыс., прибор исследовательского класса maXis impact, также настольный – 50 тыс., а наиболее продвинутый maXis для решения уникально сложных задач имеет напольную компоновку и разрешение 80 тыс.
Что отличает приборы последних двух лет от прежних моделей? Прежде всего, усовершенствованный детектор и ускоренный аналого-цифровой преобразователь (50 Гбит/сек), благодаря которым динамический диапазон расширен более чем до 105. То есть в одном спектре можно регистрировать пики, интенсивность которых различается в 100 тыс. раз. Новая конструкция ячейки соударений позволила повысить скорость работы в режиме МС/МС и улучшить трансмиссию ионов. Новый рефлектрон отвечает за высокое разрешение и стабильность шкалы масс. Новые высоковольтные блоки повышают стабильность работы прибора в целом.
Настоящее преимущество квадруполь-времяпролетных систем – их универсальность. На одном и том же приборе можно определять как сверхлегкие соединения с массами 30–40 Да, так и сверхтяжелые порядка 150 кДа, достаточно только задать нужный режим работы. Еще один плюс таких систем – получение правильной изотопной картины. Информация о соотношении интенсивностей изотопных пиков чрезвычайно полезна при подтверждении брутто-формул. Широкий динамический диапазон в сочетании с высоким разрешением дает возможность определить нужный пик на фоне матричной помехи, масса которой может отличаться всего на тысячные доли дальтона, а ее содержание может быть в десятки тысяч раз выше.
Типичные применения данных приборов – определение брутто-формул и многокомпонентный скрининг по точным массам. Необходимость подтверждения брутто-формул хорошо знакома всем химикам-синтетикам, а также тем, кто определяет неизвестные соединения. Чтобы однозначно установить элементный состав, масс-спектрометр должен определять массы с точностью лучше 0,05 ppm, что недостижимо. В реальной жизни можно рассчитывать на точность около 2 ppm. При этом в списке возможных соединений-кандидатов, скорее всего, окажется более десятка брутто-формул, имеющих одинаковый молекулярный вес. Анализ точной изотопной картины, получаемой на наших приборах, способен существенно сократить этот список. Но для уверенного однозначного определения формулы необходима фрагментация ионов с последующим анализом точных масс и изотопных картин получившихся фрагментов. Наши приборы дают такую возможность.
Многокомпонентный скрининг по точным массам позволяет сравнивать такие параметры, как отклонение измеряемого значения массы от теоретического, разницу реального и ожидаемого времени хроматографического удерживания, соответствие полученной и рассчитанной изотопных картин. Еще один плюс данного подхода – возможность ретроспективного анализа. Если в полученном образце присутствует какое-то соединение, которое в настоящий момент не требуется определять, но такая необходимость возникнет в будущем, то уже полученные хроматограммы можно будет проанализировать еще раз и установить, было ли в пробе определяемое соединение.
На базе масс-спектрометрического определения структуры соединений мы разработали ряд готовых решений. Самое интересное из них – это Pesticide Screenеr, предназначенное для высокопроизводительного скрининга пестицидов. Pesticide Screenеr делает возможной быструю и надежную идентификацию более 900 пестицидов на уровне миллиардных долей (ppb) в сложных матрицах, при этом доля ложноположительных результатов ничтожно мала. Решение составляют три компонента: система ВЭЖХ с четко определенной конфигурацией, квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр и программное обеспечение для расшифровки. Сердце этого решения – база данных, которая включает времена удерживания, точные массы определяемых соединений, картины изотопного распределения, данные о фрагментных ионах, получаемых при определенных режимах фрагментации, и, что самое важное, подтверждающие спектры фрагментных ионов, полученные в режиме так называемой широкополосной фрагментации, индуцированной соударениями (broad-band CID). В этом режиме все ионы, образующиеся в ионном источнике, подвергаются дальнейшей фрагментации, в результате получается спектр полного набора фрагментных ионов. При выходе пика из хроматографической колонки регистрируется одновременно масс-спектр молекулярных ионов соединений, содержащихся в этом пике, а также спектр всех фрагментов этих молекулярных ионов, полученный в режиме broad-band CID. Сравнение обоих спектров и картин изотопного распределения делает идентификацию соединений чрезвычайно надежной даже в случае совпадения времен удерживания и молекулярных масс.
Подобные решения для определения веществ заданных классов могут создаваться также на основе газовой хроматографии. В комплексной системе GC-APCI-TOF газовый хроматограф подключается к источнику химической ионизации при атмосферном давлении, а затем к квадруполь-времяпролетному масс-спектрометру. Гибкая переходная линия обеспечивает быстрое и легкое подключение газового хроматографа к ионному источнику и контроль температуры на всем пути от хроматографа до источника. Источник GC-APCI позволяет ионизировать значительное количество летучих органических соединений, получать достаточно интенсивные молекулярные ионы. Одно из применений таких систем – определение эфиров жирных кислот, для каждого из которых определяются брутто-формулы. Идентификация соединений после ГХ-МС анализа осуществляется с помощью пакета программ SmartFormula™.
В заключение хотелось бы упомянуть сложную гибридную систему o-TOF + ЯМР. Это гибрид спектрометра ядерного магнитного резонанса и квадруполь-времяпролетной системы, который позволяет проводить разделение образца методом ВЭЖХ и получать одновременно как масс-спектры, так и ЯМР-спектры. Система идеальна для идентификации неизвестных соединений: масс-спектр дает информацию о брутто-формуле, ЯМР – о структуре. Несмотря на дороговизну таких систем, они сейчас получают все большее распространение, как в России, так и за рубежом".
Компания Agilent Technologies уже более десятка лет удерживает лидирующее положение на рынке аналитического оборудования. Широкую известность в мире компания завоевала главным образом благодаря системам сверхбыстрой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии. Однако это далеко не единственное направление, где компания опережает многих своих конкурентов. На данном симпозиуме было представлено оборудование Agilent Technologies для элементного анализа – воплощение новейших технологий и научных разработок. Его нам представил и подробно описал ведущий специалист по спектральному оборудованию Михаил Иванович МЕЛЬНИК.
"Компания Agilent Technologies имеет собственные исследовательские центры, результаты работы которых быстро воплощаются в новом оборудовании. Многие разработки имеют научную и техническую новизну и защищены патентами. Agilent Technologies является правообладателем большинства патентов и технических новинок в области аналитического приборостроения. Для элементного анализа представлены три новинки последнего года: атомно-эмиссионный спектрометр с микроволновой плазмой 4200 MP-AES, одноквадрупольный масс-спектрометр с индуктивно-связанной плазмой 7900 ICP-MS и новейший, революционный оптико-эмиссионный спектрометр с индуктивно-связанной плазмой 5100 ICP-ОES.
Атомно-эмиссионный спектрометр Agilent 4200 MP-AES с микроволновой плазмой – это производительный и экономичный прибор по бюджетной цене. Он может служить идеальной заменой пламенным атомно-абсорбционным спектрометрам со значительным расширением возможностей по чувствительности и числу анализируемых элементов. По габаритам Agilent 4200 MP-AES не превосходит атомно-абсорбционные спектрометры, а весит он всего 73 кг. Прибор можно по праву считать наиболее безопасным в эксплуатации и обеспечивающим минимальную себестоимость анализа. В качестве газа для возбуждения плазмы используется азот. Не нужны горючие и токсичные газы – пропан-бутан, ацетилен или "проблемная" закись азота. А при наличии генератора азота можно вовсе забыть о баллонных газах и проблемах с их доставкой и хранением. Нет выбросов в окружающую среду продуктов сжигания и парниковых газов. Прибор использует воздушное охлаждение, не требуя водяных охладителей. Термостабилизированный монохроматор обеспечивает устойчивую работу в разных климатических условиях. Наконец, не нужно всегда поддерживать прибор в режиме готовности, расходуя газ и электричество. Достаточно включить его, провести анализ, а затем выключить.
В этом приборе впервые использована горелка кассетного типа, расположенная вертикально. Она исключительно просто устанавливается благодаря конструкции типа Plug & Play, с автоматическим подключением газов и автоюстировкой. Даже совсем неопытный пользователь не ошибется – горелка устанавливается по направляющим, и не надо думать, какой газ куда подключать.
Прибор открывает широкие возможности по анализу проб со сложной матрицей, таких как геохимические образцы, нефтепродукты, минеральные удобрения и продукты питания. Система ввода проб с новейшим распылителем OneNeb делает возможным анализ практически любых растворов. Даже после полутора суток непрерывной работы с растворами выщелачивания золота из минерального сырья нет никакого намека на необходимость очистки спектрометра! Что касается производительности, то всего за 5 мин можно проанализировать около 30 элементов в пробе, несмотря на то, что это последовательный инструмент. Наконец, хотелось бы отметить интуитивно понятное и простое программное обеспечение MP Expert, которое, помимо управления самим прибором, устраняет нежелательные спектральные интерференции, корректирует фон и межэлементное влияние в процессе анализа, содержит встроенные шаблоны методов анализа наиболее распространенных типов проб и модули их автоматической оптимизации.
Еще один класс оборудования для элементного анализа – масс-спектрометры с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС). Компания Agilent Technologies уже более 20 лет является признанным лидером на рынке масс-спектрометрического оборудования и выпускает самые разнообразные приборы для решения любых аналитических задач, где масс-спектрометрия может быть хотя бы как-то применена. В сегменте для элементного анализа представлены два прибора – высокопроизводительный 7900 ICP-MS, идеально подходящий для множественных рутинных анализов, и уникальный, тандемный 8800 ICP-MS с широчайшими возможностями для исследовательских задач, уникальных по сложности. Про этот последний прибор я не буду здесь подробно рассказывать – скажу лишь, что это первый и пока единственный в мире масс-спектрометр ИСП-МС с функцией тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) для элементного анализа.
Масс-спектрометр 7900 ICP-MS является логическим продолжением самой популярной в мире серии приборов Agilent 7700 ICP-MS. Появившись в 2009 году, эти приборы завоевали более половины мирового рынка спектрометров ИСП-МС. Несмотря на то что они уже тогда имели лучшие аналитические и метрологические характеристики, мы не остановились на достигнутом. Была поставлена задача улучшить еще как минимум в 10 раз все аналитические параметры – соотношение сигнал/шум, устойчивость к матрице, динамический диапазон, скорость считывания. В результате, новый спектрометр 7900 ICP-MS внедрил самые последние достижения – новый запатентованный детектор, новый ионный интерфейс, новую систему устранения полиатомных интерференций. Реализована уникальная возможность, прежде казавшаяся недостижимой для метода ИСП-МС – работа с чрезвычайно засоленными растворами, содержащими до 25% солей (до 250 г/л). Это стало возможным благодаря технологии UHMI (Ultra High Matrix Introduction). Аэрозоль образца с высокой точностью разбавляется аргоном, при этом степень разбавления регулируется в зависимости от засоленности анализируемых растворов.
Динамический диапазон заметно расширен по сравнению с приборами 7700 ICP-MS. Только у детектора линейный динамический диапазон составляет более 11 порядков, от 0,1 имп/с до 10 Гимп/с. Детектор теперь работает в 30 раз быстрее, что дает возможность следить за быстротекущими процессами. Это значительно расширило возможности по анализу наночастиц. Высокое соотношение сигнала к шуму обеспечивает новый ионный интерфейс и улучшенная ионная оптика. Так, предел обнаружения урана в водных растворах находится на уровне единиц ppq (10-15).
Возросла производительность спектрометра – 7900 ICP-MS позволяет анализировать более 60 проб в час. Для быстрого ввода пробы и старта работы применена система ISIS-3 (Integrated Sample Introduction System), оснащенная плунжерным насосом и семипортовым автоматическим краном. За счет автоматизации процессов промывки и тюнинга полностью устраняется эффект памяти. Для устранения полиатомных интерференций прибор использует октупольный коллизионно-реакционный интерфейс четвертого поколения (ORS4). Он обладает максимальной пропускной способностью и однородностью поля. Максимальная эффективность устранения полиатомных интерференций для любых типов проб достигается в режиме с использованием гелия, при этом частицы дискриминируются по кинетической энергии. Реакционные режимы с традиционными для них газами остаются доступными, но они, как правило, менее эффективны.
Кроме всех перечисленных достоинств, применено совершенно новое, интуитивно понятное и высокоэффективное программное обеспечение MassHunter, построенное по принципу многоуровневости. Первый уровень – для наименее опытных пользователей, а дальше вверх по уровню подготовки и освоения самого спектрометра. И еще одно полезное дополнение и, наверное, шаг навстречу современной моде: MassHunter имеет приложение для мобильных устройств, которое позволяет удаленно, с помощью смартфонов или планшетных компьютеров, управлять основными функциями спектрометра и выводить текущие результаты на экран мобильных устройств.
Новый оптико-эмиссионный спектрометр с индуктивно-связанной плазмой Agilent 5100 ICP-OES, сплав современных технологий и дизайна, был представлен мировому сообществу в июле 2014 года. Спектрометр воплотил в себе все последние достижения в данной области. Впервые внедрен синхронизированный вертикальный двойной обзор плазмы (SVDV, Synchronous Vertical Dual View), позволяющий одновременно регистрировать сигналы от радиального и аксиального обзоров плазмы. Это повышает производительность и удобство эксплуатации, в то же время экономит аргон. Сигналы от радиального и аксиального обзоров плазмы синхронизируются благодаря технологии дихроичного спектрального сумматора (DSC). Полученный суммарный сигнал регистрируется уникальным детектором нового поколения VistaChip II. Фактически, один спектрометр объединил в себе 4 инструмента – с синхронизированным вертикальным двойным обзором плазмы, с радиальным, с аксиальным и с обычным двойным обзором. Зачем тратить время и деньги на анализ проб на ИСП-ОЭС с обычным двойным обзором, делая при каждом анализе до четырех последовательных измерений, когда можно за одно измерение получить точные результаты для самых тяжелых проб на Agilent 5100? При этом время анализа 73 элементов в пробе составляет около полуминуты.
В Agilent 5100, подобно 4200 MP-AES, используются вертикальные горелки кассетного типа, которые легко устанавливаются и фиксируются, при этом юстировка и подключение газов производится автоматически. Конструкция горелки обеспечивает высокую устойчивость к матричным эффектам, позволяя анализировать пробы с концентрацией солей до 300 г/л. В системе ввода проб используются различные камеры распыления и высокоэффективные распылители, в том числе SeaSpray и OneNeb. Высокосолевые растворы и взвеси теперь можно анализировать практически без ущерба для чувствительности, а универсальный распылитель OneNeb безопасно работает даже с растворами, содержащими плавиковую кислоту.
Хорошо зарекомендовавшая себя технология "охлаждаемого конуса" с противотоком аргона позволяет эффективно устранять "холодный" хвост плазмы для аксиального обзора и связанные с ним матричные эффекты. Исключительная аналитическая стабильность обеспечивается еще и новейшим, запатентованным твердотельным ВЧ-генератором. Даже при анализе растворов, содержащих 25% солей, сохраняется высокая долговременная стабильность: при непрерывном анализе элементов на фоне 25% NaCl в течение 4 ч общая погрешность не превышает 1,3%. Высокая аналитическая стабильность особенно важна при анализе очень "сложных" проб – например, определения щелочных металлов на фоне высокой концентрации других щелочных металлов.
Нужно признать, что многие аналитические лаборатории сейчас испытывают проблемы с квалифицированными специалистами. Поэтому последние разработки направлены в том числе и на то, чтобы приборы могли обслуживать лаборанты невысокой квалификации. Agilent 5100 ICP-OES весьма прост в эксплуатации и обслуживании. Как уже отмечалось, горелка кассетного типа очень удобна в плане подключения и замены. Кроме того, у спектрометра обеспечен легкий доступ к местам подключения электричества, газов, системы охлаждения, очень просто подключается система ввода проб. Работу можно начинать уже через 10–15 минут после включения прибора. Впервые применена технология смарт-электроники, то есть самодиагностируемой электроники. При включении посылается запрос на все блоки управления и, в случае каких-либо проблем, тут же запускаются диагностические процедуры. Программное обеспечение ICP Expert интуитивно понятно и очень эффективно для быстрой и простой разработки методов, истинной корректировки фона, устранения спектральных интерференций и межэлементного влияния.
На этих нескольких примерах я хотел показать, что компания Agilent вносит существенный вклад в инновационное развитие аналитических методов и разработки новейшего оборудования. Представленные системы обладают отличными аналитическими и метрологическими характеристиками и позволяют пользователям получить наилучшие результаты".
Группа компаний "Аналит" – крупнейший в России генеральный дистрибьютор японской корпорации Shimadzu, ведущего мирового производителя аналитического и испытательного оборудования. Группа компаний, основанная в 1992 году, имеет представительства в Москве, Санкт-Петербурге, Нижнем Новгороде, Казани и Уфе. Помимо сотрудничества с Shimadzu, ГК "Аналит" поставляет в Россию приборы, реактивы и расходные материалы многих известных производителей, таких как Merck Millipore, LECO, Mettler Toledo, LabTech, Sigma-Aldrich, Retsch, Anton Paar, Markes Int. и других. В сферу деятельности компании входит также комплексное оснащение лабораторий – поставка оборудования, расходных материалов и мебели, методическая и сервисная поддержка, обучение персонала. ГК "Аналит" имеет собственную аккредитованную лабораторию и учебный центр в Санкт-Петербурге, где можно ознакомиться с основными видами предлагаемого оборудования. В 2014 году была также открыта демонстрационная лаборатория ГК "Аналит" в Москве.
На данном симпозиуме ГК "Аналит" представила множество разнообразных приборов и систем от компании Shimadzu. Большинство из них было подробно описано в обзорной статье предыдущего выпуска нашего журнала (Жохов С. Shimadzu: практические решения и высокотехнологичные новинки для фармацевтических и клинических лабораторий. – Аналитика, 2015, № 1, с. 54–66. Отдельную статью мы посвятили наиболее высокотехнологичному прибору – масс-микроскопу iMScope Trio (Фармаковский Д. Молекулярная визуализация с помощью масс-микроскопа iMScope TRIO. – Аналитика, 2014, № 6, с. 82-87).
Разнообразие продукции Shimadzu столь велико, что его невозможно полностью описать одной журнальной статьей. В настоящем обзоре мы рассмотрим газовые хроматографы и хромато-масс-спектрометры, рентгеновские спектрометры, электронно-зондовые микроскопы для исследования поверхности. Их нам представил руководитель группы компаний "Аналит", к.х.н. Илья Львович ГРИНШТЕЙН.
"Корпорация Shimadzu входит в пятерку крупнейших мировых производителей аналитического оборудования. В ее обширном каталоге имеются системы жидкостной и газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии, масс-спектрометры и масс-микроскопы MALDI, оптические и ИК-Фурье-спектрометры, рентгеновские спектрометры и дифрактометры, приборы для определения элементного состава, анализаторы общего органического углерода и азота, анализаторы размеров частиц, секвенаторы белков и нуклеиновых кислот, анализаторы влажности и т.д. При разработке аналитического оборудования Shimadzu заимствует опыт из смежных сфер своей деятельности – это оптическая и электронная промышленность, производство медицинского и аэрокосмического оборудования.
Газовая и жидкостная хроматография и хроматомасс-спектрометрия традиционно является одним из наиболее сильных направлений Shimadzu. Компания производит газовые хроматографы с 1956 года, то есть уже почти 60 лет. Нынешняя линейка включает модели GC-2010Plus, GC-2014, GC-2025. Все они поддерживают режим быстрой хроматографии, что сокращает время анализа более чем на порядок.
Газовый хроматограф GС-2010Plus использует передовую технологию распределения газовых потоков (AFT, Advanced Flow Technology), которая направляет выходящий с колонки поток на несколько детекторов. Эта же технология обеспечивает процедуру обратной продувки колонки газом-носителем, которая необходима для удаления высококипящих компонентов, загрязняющих колонку. Хроматограф комплектуется высокочувствительными детекторами серии 2010 Plus – можно подключать одновременно до четырех различных детекторов. Наиболее часто используемый детектор – пламенно-ионизационный (FID). Особо нужно отметить новый электронно-захватный детектор ECD-2010 Exceed с технологией бесконтактных потоков.
На базе GС-2010Plus была разработана хроматографическая система Tracera, оснащенная уникальным ионизационным детектором барьерного разряда (Barrier Discharge Ionization Detector, BID), новейшей разработкой Shimadzu. Система определяет следовые количества соединений различной природы, в том числе таких, которые не обнаруживаются стандартными детекторами, или определяются ими с большим трудом. Детектор BID имеет в основе холодную гелиевую плазму. Новый детектор BID-2010 объединяет возможности пламенно-ионизационного детектора и катарометра, но превосходит по чувствительности первый из них вдвое, а второй – на два порядка.
Газовый хроматограф GC-2014 идеально адаптирован для работы с насадочными колонками, но может применяться и для капиллярной хроматографии. К нему можно подключать одновременно до трех инжекторов и четырех детекторов, каждый из которых имеет независимый температурный контроль. Это дает возможность конфигурировать систему практически для любых приложений. Хроматограф GC-2025 отличается исключительной экономичностью и компактностью. Подобно предыдущим моделям, он оснащен цифровым контроллером газовых потоков и современными детекторами.
Газовые хромато-масс-спектрометры GCMS-QP 2010SE и GCMS-QP 2010Ultra разработаны на основе хроматографа GC-2010 Plus и одноквадрупольных масс-спектрометрических детекторов. GCMS-QP 2010SE – экономичная модель среднего класса, пришедшая на смену прибору GCMS-QP2010S и имеющая в сравнении с ним улучшенные аналитические характеристики. Модель GCMS-QP 2010Ultra использует новейшую запатентованную технологию автоматической оптимизации квадрупольного напряжения ASSP (Advanced Scan Speed Protocol), повышающую скорость сканирования до 20000 а.е.м./сек без потери чувствительности или искажений спектра. Функция FASST (Fast Automated Scan/SIM Type) позволяет при этой скорости сканирования регистрировать одновременно полный ионный ток и выбранные ионы – работать сразу в двух режимах.
Тандемный газовый хромато-масс-спектрометр с тройным квадруполем GCMS-TQ8040 воплотил в себе целый комплекс интеллектуальных технологий "Smart". Технология высокой производительности "Smart Performance" сочетает высокую скорость сканирования (20000 а.е.м./сек; использован протокол ASSP, как и в предыдущей модели) c применением высокоскоростной ячейки соударений UFsweeper™. В режиме тандемной масс-спектрометрии можно регистрировать до 800 MRM-переходов в секунду или до 32768 MRM-переходов за один анализ. Технология высокой эффективности "Smart Productivity" основана на подборе оптимального времени регистрации каждого целевого соединения, которое соответствует продолжительности его элюирования из колонки, то есть ширине пика. Благодаря этому, можно одновременно определять большое число целевых соединений разных классов. Наконец, технология интеллектуального управления "Smart Operation" автоматически устанавливает многочисленные параметры работы прибора и задает условия анализа для тандемной масс-спектрометрии. Теперь пользователь избавлен от необходимости делать это вручную.
Рентгеновские приборы и оборудование для исследования поверхности – это те области, где японские производители традиционно очень сильны. Кроме Shimadzu, ведущими игроками на этом рынке являются компании JEOL, Rigaku и Horiba. Компания Shimadzu производит энергодисперсионные и волнодисперсионные рентгенофлуоресцентные спектрометры, а также рентгеновские дифрактометры, электроннозондовые микроанализаторы и сканирующие зондовые микроскопы с абсолютно уникальными характеристиками.
Новая серия энергодисперсионных спектрометров EDX-7000/8000 была удостоена золотой награды IBO Design Awards 2014 года в сфере промышленного дизайна. В приборах установлены высокоскоростные кремниевые SDD детекторы (Silicon Drift Detеctor), не требующие охлаждения жидким азотом. Такие детекторы делают разрешающую способность прибора сравнимой с волнодисперсионными спектрометрами; при оптимальных условиях анализа разрешение достигает 125 эВ. Для ряда элементов предел обнаружения снижен примерно до 0,5 ppm (5 × 10-5% по массе) анализируемых элементов в твердых образцах. Диапазон определяемых элементов – от натрия (EDX-7000) или углерода (EDX-8000) до урана. Приборы очень компактны, весят менее 45 кг, при этом камера для образцов позволяет размещать в ней пробы размерами до 300 мм по ширине.
Среди волнодисперсионных приборов нужно отметить сканирующий спектрометр XRF-1800 LabCenter. Это один из мощнейших рентгенофлуоресцентных спектрометров, представленных на современном рынке. Он применяется для анализа горных пород, руды, силикатных, магнитных материалов, а также в химической, нефтяной, цементной, угольной и других отраслях промышленности. Качественный и количественный анализ всех элементов от бериллия до урана может быть выполнен всего за 2,5 минуты. Прибор отличает возможность локального анализа в любой точке поверхности образца с дискретностью 0,25 мм. К тому же, с помощью линий Комптоновского рассеяния можно определять толщину и элементный состав тонких пленок – за эту возможность отвечает новая запатентованная технология Shimadzu.
Рентгеновские дифрактометры представлены двумя моделями – XRD-6100 и XRD-7000. Дифрактометр XRD-7000 построен по θ-θ схеме, обеспечивающей неподвижность образца во время измерений. Этот прибор позволяет работать с образцами очень большого размера. Обе модели оснащены высокоскоростным широкополосным полупроводниковым детектором OneSight или традиционными сцинтилляционными детекторами.
Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) — один из наиболее мощных современных методов исследования структуры и локальных свойств поверхности. Методом СЗМ можно получать цифровые трехмерные изображения атомных решеток, живых клеток, молекулярной структуры полимеров. Компания Shimadzu производит микроскопы SPM-9700 и SPM-8000FM со сменными кантилеверами, обеспечивающими различные режимы работы, в том числе режим атомно-силового микроскопа. Приборы могут размещаться внутри климатических блоков в условиях полного контроля температуры, влажности и давления – это изюминка Shimadzu. Это крайне важно, поскольку позволяет избавиться от броуновского и когерентного шума, резко снижающего эффективность работы приборов в конденсированных средах и на воздухе.
Электронно-зондовый микроанализатор ЕPMA-8050G – мощнейшая на данный момент система для исследования микро-, нанообъектов и поверхности. Он представляет собой комбинацию мощного электронного микроскопа с разрешением 3 нм и пяти двухкристальных волнодисперсионных рентгенофлуоресцентных спектрометров-анализаторов. Таким образом, можно при необходимости совмещать оптическое и рентгеновское изображение. ЕPMA-8050G обеспечивает возможность проведения прецизионного элементного анализа, определения фазовой структуры и химического состояния исследуемых элементов.
В заключение приведу несколько примеров использования такого оборудования. С помощью электронно-зондового микроанализатора можно, например, в срезе ткани, пораженной онкологическим заболеванием, отследить проникновение лекарства, содержащего платину, непосредственно в опухолевые клетки. В образцах металлических сплавов можно обнаруживать неоднородности распределения составляющих металлов площадью менее квадратного микрона, а затем на основе суммарной площади и общего числа таких неоднородностей делать выводы о свойствах анализируемых сплавов. Атомно-силовой микроскоп серии SPM-8000FM дает возможность наблюдать, например, наведенную кристаллическую структуру мономолекулярных слоев жидкости, прилегающих к подложке.
Все это свидетельствует о принадлежности корпорации Shimadzu к мировому клубу наиболее продвинутых и инновационных производителей оборудования для инструментального исследования состава и свойств веществ. Корпорация снова и снова оправдывает свой девиз – "Процветание человечества с помощью науки и технологии".
ЗАО "БиоХимМак СТ" было создано в 1998 году сотрудниками Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова на базе отдела, существовавшего в составе ЗАО "БиоХимМак" с 1990 года. Компания разрабатывает технологические решения на базе препаративной жидкостной хроматографии в пилотном и промышленном масштабах и сейчас успешно конкурирует с зарубежными фирмами на российском рынке в плане развития методологий получения высокоочищенных субстанций природного, синтетического и биотехнологического происхождения. ЗАО "БиоХимМак СТ" стабильно поставляет в Россию хроматографические системы, оборудование для органического синтеза, сорбенты и реактивы западноевропейских фирм-производителей, таких как Biotage Sweden AB, Knauer GmbH, Resindion SRL, Akzo Nobel Chemicals AB (производитель сорбентов под торговой маркой Kromasil), и других. В отношении всех этих фирм ЗАО "БиоХимМак СТ" имеет статус их официального представителя.
Непрерывные хроматографические технологии – новый эффективный подход к очистке соединений в лабораторном и промышленном масштабах, даже если их содержание составляет всего доли процента. Для их реализации в автоматическом режиме была разработана специальная платформа Contichrom®, производимая фирмой Сhromacon (Швейцария) и предлагаемая российским пользователям ЗАО "БиоХимМак СТ". Об этой платформе, о принципах непрерывных технологий и основных сферах их применения нам рассказал генеральный директор ЗАО "БиоХимМак СТ" Сергей Михайлович СТАРОВЕРОВ.
"Технологии непрерывной хроматографии представляют собой мощный инструмент для тех случаев, когда в течение одного хроматографического цикла не удается полностью отделить целевой продукт от примесей и получить его в чистом виде. Суть метода в том, что определенная часть продуктов хроматографического разделения заново наносится на ту же колонку, или идентичную по параметрам. Этот процесс повторяется многократно. Сейчас для сложных случаев разделения все чаще применяется двумерная хроматография, которая принципиально отличается от непрерывных технологий тем, что в первом и втором цикле разделения используются разные хроматографические режимы и, как правило, разные колонки. Внедрение двумерных технологий в препаративных и промышленных масштабах связано с большими техническими сложностями, поэтому сегодня их применение, как правило, ограничивается аналитическими масштабами.
Селективность обычных колонок зачастую бывает недостаточной, чтобы идеально выделить целевой компонент из смеси, особенно при высоких нагрузках. При этом может наблюдаться так называемая "чистая зона", когда какая-то часть пика не перекрывается с пиками примесей, то есть соответствующая фракция уже содержит чистый компонент и не требует доочистки. Остальные части пика, обычно по его краям, перекрываются с другими пиками и представляют собой "смешанные зоны" – эти фракции нужно очищать повторно. Яркий пример – оптические изомеры. Для их разделения, подбор высокоселективного метода может быть вовсе невыполнимой задачей. При неидеальном разделении в препаративной хроматографии приходится выбирать "одно из двух зол" – либо собирать только чистые фракции, но тогда выход целевого продукта будет низким, либо также и часть "смешанных зон", но тогда будет низкая чистота.
Действительно, в реальных случаях мы сталкиваемся с ситуацией, когда основной компонент, так сказать, "закрыт примесями и с фронта, и с тыла". И зачастую всеми ухищрениями, усилениями селективности не удается создать метод, которым можно извлечь более 50–60% вещества в чистом виде. В препаративных процессах это ведет к огромным неоправданным расходам и трудозатратам. Еще сложнее та ситуация, когда целевое соединение само является примесью в сложной системе, и его содержание – на уровне долей процента. Его пик может быть полностью закрыт более интенсивными пиками. Тогда нужно использовать самые изощренные специальные техники, чтобы только лишь получить информацию об этом соединении, не говоря уже о его препаративном извлечении в чистом виде. Иногда на помощь приходит аффинная хроматография, но далеко не всегда удается найти специфический сорбент именно для интересующего соединения.
Метод многоколоночной противоточной хроматографии в градиенте подвижной фазы (Multicolumn Countercurrent Solvent Gradient Purification, MCSGP) – результат 20-летнего труда научной группы профессора Морбиделли (Massimo Morbidelli) в Цюрихе. Процесс разделения на двух или нескольких идентичных колонках организован так, чтобы извлечь максимально возможный процент целевого продукта из сложной смеси, при этом требуемая чистота продукта задается заранее. Применение этого метода на практике увеличивает производительность процесса в 3–10 раз, а степень чистоты продукта строго контролируется. Существенно, что при этом до 50% увеличивается выход и до 70% снижается расход элюента.
Мы рассмотрим основной вариант метода, где используются две одинаковые колонки. В процессе первого разделения, фракция "чистой зоны" (с целевым веществом, не требующим доочистки) направляется непосредственно в емкость для сбора чистого продукта. Фракции вообще без целевого компонента идут в слив. Все "смешанные зоны" объединяются и поступают на вторую колонку. Перед повторным нанесением они разбавляются начальным буфером, и к ним добавляется новая порция исходного образца. Исключительно важно при этом уйти от той точки градиента, где целевое вещество элюируется, иначе оно размоется по колонке. Пока на второй колонке идет разделение, первая колонка регенерируется и подготавливается к следующему аналогичному циклу. Так повторяется до тех пор, пока целевой продукт не будет извлечен из смеси с требуемой чистотой, которая задается в самом начале процесса точками переключения на хроматограмме. Заметим, что данная технология даже не требует коллектора фракций. Нужны только две емкости: одна для сбора всех промежуточных фракций, включая регенерационные смывы, вторая – для чистого продукта.
Метод Capture SMB (silmulated moving bed) – непрерывная технология аффинной хроматографии, когда две одинаковые колонки располагаются друг за другом. Когда первая колонка насыщается, и целевой компонент начинает проскакивать, его захватывает вторая колонка. Было показано, что производительность при такой технологии возрастает вдвое по сравнению с тем случаем, когда применяется одна "большая" колонка с двойным объемом сорбента. Так, вместо одной литровой колонки можно без ущерба для производительности использовать две последовательные по 250 мл.
Метод N-Rich предназначен для тех наиболее сложных случаев, когда интересующее вещество – это небольшая примесь с низким содержанием, и его пик может быть почти целиком закрыт другими, более интенсивными пиками. Такие вещества нужно выделять из большого количества образца, которое нельзя наносить на колонку все сразу, во избежание перегрузки. Метод состоит из трех этапов. Задача первого этапа – сконцентрировать целевой продукт, повысив его абсолютную концентрацию в пробе и процентное содержание относительно других, мешающих компонентов. После первого цикла вся зона целевого пика ("чистая" плюс "смешанная") поступает на повторное разделение на такой же колонке, при этом к ней примешивается еще одна порция чистого образца. Так до тех пор, пока весь объем образца не поступит на колонку. Затем проводят несколько циклов второго этапа – все то же самое, но без введения новых порций образца. Концентрация целевого продукта в результате остается постоянной, а примеси постепенно истощаются. Третий этап – окончательное фракционирование с выделением целевого компонента. Отличие от метода MCSGP здесь в том, что весь целевой продукт прогоняется по колонке много раз, и даже самые очищенные фракции не поступают в коллектор до окончания всего процесса.
Платформа Contichrom®, разработанная швейцарской компанией ChromaCon, и оборудование, производимое этой компанией совместно с немецкой фирмой Knauer GmbH, представителями которых мы являемся, позволяют реализовать все эти методы в автоматическом режиме. Мы предлагаем систему Contichrom® Lab-10 для лабораторных масштабов (до 20 граммов целевого продукта в день) и аналогичную ей Contichrom® Prep-100 для препаративных масштабов (до 200 граммов в день). Промышленные системы требуемой мощности (без ограничений) в соответствии с требованиями GMP производятся под заказ. Все платформы оснащены программным обеспечением, контролирующим и автоматизирующим весь процесс, а также позволяющим легко разрабатывать конкретные методики, использующие данный принцип.
Работа на таких сложных системах в режиме MCSGP начинается с получения обыкновенной хроматограммы препаративного разделения образца. Затем делается фракционный анализ, где пользователь отмечает фракции "чистой зоны", содержащие продукт нужной степени очистки (95%, 99% и т.п.) и "смешанные зоны". После этого система сама составляет программу переключения и разбавления фракций. Установив вторую аналогичную колонку, можно начинать процесс в автоматическом режиме.
Применение метода N-Rich – это, прежде всего, исследование микрокомпонентов и биомаркеров. В ряде случаев бывает даже неизвестно, селективность какого типа надо применить, чтобы извлечь компонент. Бывает, что даже его пик на хроматограмме не виден отчетливо. Может вовсе не быть никакой доступной информации, кроме предположения, что данный биомаркер должен выходить в определенной точке градиента. Технология N-Rich позволит сконцентрировать нужную часть хроматограммы – на практике это будет концентрирование примерно в 1000 раз.
Второе применение метода – получение стандартов примесей в фармацевтике. Согласно ныне действующим требованиям, если лекарственный препарат содержит примесь на уровне 0,1% и выше, ее необходимо выделить в чистом виде и провести ряд биологических испытаний. В обычных лабораториях выделение может занять много месяцев. Платформа Contichrom® в режиме N-Rich позволяет извлечь примесь за одну ночь, в особо сложных случаях это займет несколько дней, при этом присутствие оператора не потребуется.
Где непрерывные технологии уже нашли применение и показали интересные результаты? В классе низкомолекулярных соединений, это прежде всего очистка синтетических пептидов и непредельных жирных кислот. Среди высокомолекулярных – это, в первую очередь, моноклональные антитела, особенно новое поколение гуманизированных моноклональных антител, где разделение может быть очень сложным. Или продукты второй генерации. Например, пегилированные белки, белки плазмы крови. Плазма крови – труднодоступное сырье, ее надо беречь. Среди прочих возможностей применения есть первые успешные попытки разделения редкоземельных элементов в системах непрерывных технологий.
Наконец, хочу отметить авторитетное мнение директора FDA: в течение последующих 25 лет подобные методы непрерывной хроматографии станут основной технологией получения высокоочищенных субстанций, если не появятся еще какие-то новые, более передовые техники.
ООО "Агентство Химэксперт" является официальным дистрибьютором корпораций Sciex и Life Technologies на российском рынке, а также поставщиком реактивов и расходных материалов зарубежных компаний Applied Biosystems, Invitrogen, Ion Torrent и Ambion. Американская корпорация Sciex, часть глобального концерна Danaher Corporation – один из ведущих мировых производителей оборудования и реактивов для биотехнологических исследований. В 2013 году компания Sciex присоединила к себе отделы по производству и разработке систем капиллярного электрофореза, которые ранее входили в состав корпорации Beckman Coulter.
Компания Sciex разрабатывает подходы по интеграции капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием. Одна из наиболее успешных разработок, новинка 2014 года – система СESI-8000, комбинирующая технологии капиллярного электрофореза и ионизации методом электрораспыления. Благодаря усилиям ООО "Агентство Химэксперт", данная система стабильно поставляется и обслуживается на территории России. О достоинствах этого прибора, а также о широких возможностях применения метода капиллярного электрофореза в современных биотехнологических и биофармацевтических лабораториях, нам рассказал ведущий эксперт по методам разделения веществ ООО "Агентство Химэксперт" Александр Анатольевич КИРИЛЮК.
"Капиллярный электрофорез является таким же мощным и производительным методом разделения молекул, как и жидкостная хроматография, несмотря на его менее широкую распространенность. Можно сказать, капиллярный электрофорез и ВЭЖХ – дополняющие друг друга методы. Если разделяемые вещества заряжены или сильно полярны, то капиллярный электрофорез более предпочтителен – особенно для тех случаев, когда исходный образец содержит множество заряженных и полярных аналитов. Метод достаточно надежный и легко переносится с одних платформ на другие, чего нельзя сказать о ВЭЖХ, когда при замене колонки или системы изменяются сразу многие параметры.
Системы капиллярного электрофореза чаще всего используют традиционные методы детектирования – оптические или флуоресцентные детекторы. Масс-спектрометрическое детектирование, очевидно, имеет ряд преимуществ. Если один пик содержит сразу несколько соединений, близких по электрофоретической подвижности, то с помощью масс-спектрометра их можно обнаруживать по отдельности. Помимо этого, детектируются соединения, которые не поглощают в УФ и видимой области и не обладают флуоресцентными свойствами. Традиционные оптические детекторы их вовсе не обнаруживают.
Оснащение системы капиллярного электрофореза масс-спектрометрическим детектором долгое время было непростой задачей. Первые попытки объединить эти два метода были предприняты еще в 1980-е годы. Конец электрофоретического капилляра помещался в футляр, где происходило электрораспыление. При этом снаружи капилляр омывался поддерживающей жидкостью (sheath liquid), которая разбавляла электрофорезный буфер с анализируемыми веществами. Это сильно снижало чувствительность определения. Дальнейшие исследования показали, что на чувствительность и нежелательные эффекты ионной супрессии заметно влияет скорость потока электрофорезного буфера. При сверхнизких скоростях, около 10–20 нанолитров в минуту, ионная супрессия практически отсутствует, а чувствительность – довольно высокая. Однако при увеличении скорости даже до 50 нл/мин чувствительность снижается в три раза. Низкие скорости потока предпочтительны потому, что при электрораспылении образуются капли микроскопических размеров.
Система CESI-8000 представляет собой весьма удачную комбинацию капиллярного электрофореза и последующей ионизации электрораспылением – они сливаются в единый динамический процесс. Интегрированность двух методов отражена даже в самом названии системы: CESI = CE (capillary electrophoresis) + ESI (electrospray ionization). В основе решения лежит технология OptiMS – электрофоретическое поле и распыляющее напряжение разобщены друг с другом. Через пористый конец электрофоретического капилляра могут свободно перемещаться электроны, но не проходят жидкости и анализируемые молекулы. Эта часть капилляра в виде его наконечника заключена в металлическую иглу, на которую подается распыляющее напряжение. При такой технологии распыления не нужно высокое напряжение, достаточно всего 1,25 кВ. Пространство внутри иглы заполнено так называемой кондуктивной жидкостью, которая не расходуется и периодически заменяется. Для нее предусмотрен специальный капилляр, идущий параллельно разделяющему капилляру. Не требуется потока поддерживающей жидкости (sheath liquid), что гарантирует отсутствие разбавления и нарушения потока даже при сверхнизких скоростях. Распыленный образец впрыскивается непосредственно в масс-спектрометр. Система работает при сверхнизких скоростях электрофоретического потока, 30 нл/мин и ниже.
Распыляющая игла, внутри которой содержится конец капилляра, в свою очередь, заключена в защитный картридж. Вся эта конструкция легко вставляется в масс-спектрометр, по принципу "plug-and-spray" – достаточно вставить и сразу можно начинать работу, без дополнительных настроек. Такая конструкция совместима с масс-спектрометрами большинства производителей. Картридж и содержащийся в нем интерфейс ионизации при необходимости можно заменять за минуты, не разбирая саму электрофоретическую систему.
Технология капиллярного электрофореза с электрораспылением и последующим масс-спектрометрическим анализом (CESI-MS) может иметь множество применений в биотехнологии и биофармацевтике. В первую очередь, это анализ крупных молекул, а также высокомолекулярных комплексов, в которых компоненты не связаны ковалентно. Крупные молекулы – это прежде всего белки, в том числе интактные, в нативной конформации. Сюда относятся биологически значимые белковые молекулы – ростовые факторы, интерфероны, интерлейкины, белковые вакцины и т.п. При анализе посттрансляционных модификаций капиллярный электрофорез имеет преимущества перед ВЭЖХ. Например, белок или пептид с множеством полярных фосфатных групп может не удерживаться на ВЭЖХ-колонке и выходить в свободном объеме.
К нативным высокомолекулярным комплексам, для анализа которых может успешно применяться технология CESI, относятся прежде всего антитела – моноклональные и с пришитыми лекарственными веществами (antibody-drug conjugates). Рынок моноклональных антител, применяемых в клинике, сейчас расширяется взрывным образом – за последние семь-десять лет он практически удвоился. Для субъединичных белковых комплексов крупных размеров метод капиллярного электрофореза также показывает значимые результаты. Был описан успешный анализ комплекса из 18 молекул с общей массой в 1,3 МДа, при этом исходная структура комплекса полностью сохранилась.
Технология CESI-MS обеспечивает полное покрытие пептидной последовательности, включая посттрансляционные модификации, в течение одного анализа. Этот метод совершенно незаменим, например, в задачах по характеристике качества антител, в том числе, при анализе так называемых "горячих точек", где происходят какие-то изменения, свойственные данному классу антител – например, окисление или характерные посттрансляционные модификации. ВЭЖХ-МС не дает возможности анализировать короткие и длинные пептиды одновременно: или короткие выходят в свободном объеме, или длинные застревают на колонке. В отличие от этого, CESI-MS позволяет сразу анализировать белки и пептиды, заметно различающиеся и по длине, и по числу и характеру посттрансляционных модификаций. Есть примеры одновременного детектирования модифицированных и немодифицированных пептидов, что происходит достаточно легко. Как говорилось в самом начале, метод капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием дополняет ВЭЖХ-МС, и комбинация этих методов может дать наиболее полную информацию об анализируемых веществах".
Отзывы читателей
