eng
Выпуск #6/2015
Ю.Устынюк
"Лаборатория на чипе" и роботизация органического синтеза. Первые шаги от мечты к реальности
"Лаборатория на чипе" и роботизация органического синтеза. Первые шаги от мечты к реальности
Просмотры: 2918
Одной из важных тенденций развития современных исследований в области синтеза новых органических соединений и скрининга на их основе веществ с заданной биологической активностью и физико-химическими свойствами является технология их получения в микроколичествах. В статье рассматриваются преимущества нового направления, возникшего на стыке органической химии, достижений материаловедения, точного приборостроения, микроэлектроники и компьютерной техники и получившего название Lab on а chip – "лаборатория на чипе". Автор обсуждает методологию синтеза новых соединений в проточных микрореакторах в сочетании с современными аналитическими методами, проверкой биоактивности на биочипе и "виртуальным скринингом" эффективной структуры.
Химия и химические технологии играют решающую роль в создании новых материалов, лекарств, средств защиты растений и всех других средств, составляющих фундамент материальной культуры современной цивилизации, а химические способы воздействия на вещества и материалы составляют основу очень многих современных промышленных технологий. В развитие химической науки в последние полвека были вложены гигантские материальные и интеллектуальные ресурсы, что и явилось главной причиной опережающих темпов развития химии по сравнению с другими научными дисциплинами. Однако наряду с этой причиной, не менее важную роль в стремительном накоплении новой химической информации сыграла и другая, "внутренняя".
Это исключительно быстрое совершенствование методического арсенала химических исследований. Химик-исследователь с помощью современных спектральных и аналитических методов получает в единицу времени в тысячи раз (!!!) больше информации о составе, строении и свойствах вещества, чем в середине прошлого 20 века. Ведь историю химической науки можно рассматривать не только как эволюцию ее основных концепций на фоне накопления новых экспериментальных фактов. С полным правом ее можно изложить и как историю совершенствования и развития методического арсенала.
Заимствованный из смежной дисциплины новый метод не только многократно увеличивает исследовательские возможности освоившего его нового научного сообщества. Он подобен троянскому коню – вместе с ним в новую область проникают его теоретический и математический аппараты, с помощью которых ученые уже в этой сфере познания создают новые концепции. Яркий тому пример – спектроскопия. Как и многие другие методы, она пришла в химию в начале 20 века из физики. Вместе с ней химики освоили и теоретический аппарат спектроскопии – квантовую механику. Нет необходимости здесь рассказывать о том, к сколь глубоким и плодотворным сдвигам в теории строения молекул это привело.
Однако не все области химической науки за последние 50 лет столь кардинально меняли методы работы. Пожалуй, самой консервативной из них оставался органический синтез. В современной университетской лаборатории органического синтеза большинство манипуляций с органическими веществами по-прежнему проводится в "химическом стекле", которое мало изменилось со времен Велера, Бутлерова и Фишера. Холодильник Либиха, колба Вюрца, колба Эрленмейера, насадка Аншютца, пистолет Фишера – все эти приборы многие десятилетия верно служат студентам, аспирантам и всем химикам-органикам. Они удобны, когда вы работаете с количеством вещества грамм или больше. Cозданы их модификации, которые позволяют работать с десятками миллиграммов вещества в рутинном режиме. Но для того, чтобы идентифицировать и полностью охарактеризовать новое соединение, а также изучить многие его свойства с помощью современных аналитических и спектральных методов, сейчас вполне достаточно сотых долей миллиграмма. Например, при создании новых лекарств для оценки биологической активности нового соединения достаточно иметь всего несколько микрограммов вещества.
Современный органический синтез проводится строго целенаправленно. Необходимо получить вещество, обладающее определенным набором свойств. Среди тысячи синтезированных соединений–кандидатов в лучшем случае лишь три-пять после первичных тестов будут отобраны для дальнейших исследований и производства. А поэтому нет необходимости получать их все в количествах, превышающих минимально необходимые для проведения этих тестов.
Переход к работе на уровне микрограммов, безусловно, имеет огромные преимущества. Это дает экономию большого количества дорогих реактивов и растворителей, что особенно важно при работе с токсичными веществами, поскольку снижается опасность их утечки. Это многократно уменьшает количество токсичных отходов, а также сокращает время проведения опытов. Ведь нагреть или охладить реактор объемом в несколько микролитров на несколько десятков и даже сотен градусов можно за секунды, в то время как при проведении реакции в литровой колбе на это уходят десятки минут или часы. Это приводит к снижению пожаро- и взрывоопасности работы. Поэтому в последнее десятилетие огромные усилия и средства были потрачены на создание принципиально новых приемов работы и приборов для получения и исследования органических соединений в микроколичествах. В этих разработках использовались последние достижения материаловедения, точного приборостроения, микроэлектроники и компьютерной техники. В результате появилось целое новое направление, которое в научной литературе фигурирует под названием Lab on а chip – "лаборатория на чипе". Можно с уверенностью утверждать, что техника органического синтеза стоит на пороге революционных изменений. О важности происходящего свидетельствует тот факт, что научные журналы высшего ранга, в том числе Nature и Science, опубликовали в течение последних 10 лет более десятка статей, посвященных этому направлению (см., напр.: специальный номер Nature, 2006, 442, № 27).
Прежде всего заметим, что переход с макро- на микроуровень и создание химических микрореакторов совсем не простая задача. В микроколичествах жидкости ведут себя иначе, чем в макроколичествах. Для них существенно увеличивается отношение площади поверхности к объему. Турбулентное течение становится ламинарным. Существует целая наука, получившая название "микрофлюидика" (microfluidics), которая исследует поведение микроколичеств жидкостей (10–9–10–18 л) в каналах диаметром от десятков до сотен микрометров, и система технологий, которая создает приборы, обеспечивающие возможность работы с такими количествами. Приборы, использующие законы микрофлюидики, в действительности давно применяются в химическом анализе. Это газо-жидкостные хроматографы с капиллярными колонками, высокоэффективные жидкостные хроматографы и приборы капиллярного электрофореза. К началу 21 века уже были разработаны почти все компоненты, которые необходимы для создания химических микрореакторов – микронасосы, смесители, дозаторы, а также компьютерные программы для управления всеми выполняемыми ими операциями. Появились и сами микрореакторы, изготовленные из различных материалов (нержавеющая сталь, стекло, керамика, полидиметилсилоксан или другой полимер), которые размещаются на маленьких пластинках (чипах). В качестве примера на рис.1 показаны микрореакторы, которые выпускаются фирмами DeanFlow и KombiMix. Они представляют собой капиллярные трубки сложной конфигурации с несколькими входами для введения реагентов. Реакторы помещают в чехлы-термостаты, которые дают возможность в широких пределах менять температуру. Все операции в них по синтезу, разделению и очистке продуктов, а также анализу проводятся под компьютерным контролем.
Главными потребителями новых методов и приборов стали научные коллективы и фармацевтические фирмы, работающие в области создания новых лекарств (Drug design), которые проводят синтез больших наборов соединений близкого строения ("комбинаторных библиотек") и их испытания на биологическую активность. Особенно эффективными в такой работе оказались проточные реакторы. В ламинарном потоке единственным механизмом массопереноса и смешивания является диффузия, скорость которой определяется площадью поверхности, через которую диффузия осуществляется. Если в тонком капилляре друг за другом движутся несколько зон растворов разных веществ, разделенных зонами чистого растворителя, то их "размывание" происходит столь медленно, что каждая из зон может рассматриваться как отдельный изолированный химический реактор.
В качестве примера того, какие преимущества дает использование микрореакторов в органическом синтезе, обратимся к одной из работ (M.Reutlinger, T.Rodrigues, P.Schneider, G.Scheider, Angew. Chem., 2014, 53, 582–585) группы, возглавляемой профессором Жизбертом Шнайдером из Федерального технологического университета Швейцарии в Цюрихе, всемирно известного ETH (Eidgenössische Technische Hochschule Zürich). На мой взгляд, эта группа является сейчас одним из мировых лидеров в использовании методов микрофлюидной техники в органическом синтезе.
Целью исследования в этой работе был поиск эффективных антагонистов G-протеинсвязывающего рецептора. Из ранее полученных данных было известно, что перспективным классом лигандов, блокирующих этот рецептор, являются имидазопиридины. Их легко можно синтезировать с помощью трехкомпонентной реакции Уги:
Блок-схема эксперимента представлена на рис.2. В работе использовался микрореактор KombiMix (реактор В на рис.1) объемом 13 мкл. Из одного пневматического дозатора в микрореактор подается раствор смеси амина и альдегида в этаноле с добавкой 10% НClO4, которая используется как катализатор. Из второго дозатора одновременно подается раствор изонитрила в этаноле такой же концентрации. Растворы в соотношении 1 : 1 смешиваются на входе. Условия проведения реакции были оптимизированы в серии предварительных экспериментов. Наилучшие результаты были получены при температуре 100°С и скорости потока 15 мкл/с. Заметим, что время пребывания реагентов в реакторе при такой скорости потока составляло менее 1 с. Реакционная смесь из микрореактора поступает в колонку жидкостного хроматографа с УФ-детектором. При появлении пика на хроматограмме часть потока направляется на вход масс-спектрометра и/или спектрометра ЯМР, где мгновенно определяется структура появившегося вещества. Как только обнаруживается нужный продукт, раствор собирается в отдельный специальный приемник. Полное время эксперимента с момента введения исходных реагентов до получения первого чистого конечного продукта составило 20 мин. После того, как продукты первой реакции покинули систему, в нее вводятся новые исходные вещества, и проводится новый синтез. Выходы конечных продуктов в этих условиях для всей серии из 17 полученных целевых соединений превышали 90%.
Контрольные опыты показали, что для достижения тех же выходов в стандартном лабораторном эксперименте с граммовыми количествами исходных веществ чистое время на проведение только одной реакции (без времени на выделение и очистку продуктов) составляет около 2 ч. Его можно сократить до 15 мин, если проводить синтез при 170°С в микроволновом реакторе.
Результаты работы весьма красноречивы – 17 новых соединений были синтезированы, спектрально охарактеризованы, очищены и выделены за один рабочий день. Но что же можно сделать с несколькими микрограммами каждого из полученных веществ? Этого количества вполне достаточно для проведения испытаний на биологическую активность. Такие эксперименты также полностью автоматизированы.
Десяток других научных групп в мире разрабатывают направление проведения нескольких последовательных химических реакций в потоке друг за другом без выделения промежуточных продуктов, но в препаративных количествах (до сотен граммов и даже более). Пожалуй, самых впечатляющих результатов здесь добились сотрудники специального исследовательского центра, созданного в 2004 году крупнейшей фармацевтической компанией "Новартис" (NOVARTIS) совместно с Массачусетским технологическим институтом, всемирно известным MIT.
Центр, создание которого обошлось более чем в 700 млн. долл., получил название The Novartis-MIT Center for Continuous Manufacturing или "Центр МТИ – Новартис по созданию непрерывных производств". А возглавил его профессор Бернхардт Траут (Bernhardt L.Trout).
Четыре года специалисты этого центра потратили на создание гигантского химического робота, занимающего площадь 8 × 2,5 м, который без вмешательства людей под полным компьютерным контролем в непрерывном режиме начал производить гемифумаратат алискерина (эффективное средство, понижающее артериальное давление с минимальным побочным действием, рис.3). В сенсационном отчете сообщается: "С того момента, как мы открыли кран и включили рубильник, до момента появления вещества в двухметровой трубке сушильного аппарата, который стоял на выходе, прошло 47 ч. За это время было проведено 14 операций. Обычный синтез (21 операция) потребовал 300 ч".
Эффективный лекарственный препарат должен прочно связываться в активном центре выбранного рецептора. Структуры большого числа рецепторов, представляющих собой, как правило, глобулярные белки, сейчас хорошо изучены, известны трехмерные структуры их активных центров. Разработаны методы выделения таких белков и их получения методами генной инженерии. Выделенный рецептор "иммобилизуется на биочипе", то есть прикрепляется к его поверхности ковалентной связью через линкер определенной длины. При контакте поверхности чипа с раствором потенциального лиганда связывание регистрируется и количественно оценивается спектральными методами, например, по изменению спектра люминисценции. Созданы и производятся биочипы, на которых одновременно иммобилизованы десятки разных рецепторов, что позволяет в одном эксперименте определять очень широкий спектр биоактивности вещества. Все операции при этом выполняются автоматически под компьютерным контролем.
Создание нового лекарственного препарата включает несколько этапов. Первый этап, на котором проводится выбор структуры потенциального лиганда – "виртуальный скрининг". Существует несколько подходов к решению задачи выбора, среди которых наиболее эффективны два. Если известна трехмерная структура рецептора, проводят компьютерное моделирование ("докинг") структур комплексов с разными лигандами в активном центре и выбирают в качестве объекта синтеза соединение или группу родственных соединений, которые, по данным расчета, наиболее прочно связываются с рецептором. Сейчас такое моделирование осуществляют с использованием методов молекулярной механики, но я полагаю, весьма скоро появятся и уже появляются более строгие специально параметризованные квантовохимические методы, которые позволят выполнять очень большие объемы необходимых вычислений. Если уже известны, как это чаще всего и бывает, структуры значительного числа лигандов для данного рецептора, активности которых охарактеризованы количественно (эти сведения можно найти в базах данных), то на основе этих данных методами QSAR строятся математические модели, описывающие связь активности со структурой. С их помощью прогнозируют биологическую активность новых потенциальных лигандов. Надежность теоретического прогноза зависит от многих факторов и, в первую очередь, от размера и качества "обучающей выборки", на которой была построена модель. Сведениями об активностях новых веществ пополняют исходную базу данных, и на новой, большей по размеру выборке уточняется QSAR-модель, на основе которой вновь проводят "виртуальный скрининг", постепенно добиваясь все лучших результатов в таком итерационном процессе.
Более сложные проблемы возникают при попытке автоматизировать второй этап работы – выбор оптимального пути синтеза лигандов, отобранных по результатам математического моделирования. Ведь даже опытный химик-синтетик сразу не может предложить многостадийную последовательность сборки структуры, которую можно осуществить с приемлемыми затратами времени и с хорошими выходами. Правда, уже создано несколько компьютерных программ (RECAP, Chematica, SYNOPSIS), которые помогают химикам в таком выборе. В группе Шнайдера разработана новая компьютерная программа DOGS (см. PLoS Computational Biology, 2012, 8, № 2, е1002380, www.ploscompbiol.оrg), которая автоматически анализирует возможности сборки целевых структур исходя из 25 144 коммерчески доступных блоков-предшественников. За основу при создании библиотеки строительных блоков был взят полный каталог фирмы Sigma-Aldrich (около 57 000 соединений), из которого были выбраны только вещества, содержащие атомы С, N, O, S, P, F, Cl, Br, I, B, Si и Se, но исключены соединения с молекулярными массами меньше 30 Д и больше 300 Д, а также вещества, содержащие более трех атомов фтора и более четырех конденсированных колец. В качестве методов сборки целевых молекул по литературным данным были выбраны и специальным образом закодированы 15 наиболее отработанных методов введения функциональных групп и их взаимопревращений, а также 58 синтетических реакций построения скелетов молекул, которые протекают с высокими выходами и условия для которых детально отработаны. Программа по специальному итерационному алгоритму проводит ретросинтетический анализ целевой структуры, оценивает пути ее сборки и предлагает наиболее приемлемый путь. Полученные результаты вызывают определенный оптимизм, хотя необходимость дальнейшего совершенствования очевидна.
Роботизация самого синтеза отобранных соединений с использованием микрофлюидной техники, а также в макромасштабе, как следует из приведенного выше примера, является чисто технической задачей, так же, как и сопряжение блока синтеза с блоком испытаний на биологическую активность. Автоматизированные системы такого типа уже существуют и активно используются. Таким образом, быстрое совершенствование микрофлюидной техники и проточных микрореакторов открывает реальную перспективу осуществления фантастической дерзкой мечты полной роботизации получения органических соединений с заранее заданными свойствами, в том числе, создания новых лекарств. Полагаю, что это мнение может быть со скептической улыбкой встречено многими химиками-органиками. Как будут развиваться события, покажет ближайшее время. Состояние этой области на начало 2014 года представлено в миниобзоре Шнайдера с сотрудниками (Angew. Chem. Int. Еd. 2014, 53, 5750–5758). Интересный материал можно также найти в статье Марка Пеплова (Peplow M. Nature, 2014, 512, 20–22).
Последите далее сами за развитием событий в этой области и за работами группы профессора Шнайдера. Он, наверняка, добьется самых высоких научных наград. Разумеется, стремительное вторжение микрофлюидной техники в органический синтез никак не умаляет значения классических методов синтеза, которые всегда будут необходимы при наработке больших количеств веществ, в том числе в промышленных масштабах.
ЛИТЕРАТУРА
1.Insight: Lab on a chip // Nature. 2006. V. 442. № 27. P. 367–419.
2.Reutlinger M., Rodrigues T., Schneider P., Scheider G. Combining On-Chip Synthesis of a Focused Combinatorial Library with Computational Target Prediction Reveals Imidazopyridine GPCR Ligands // Angew.Chem. 2014. V. 53. P. 582–585.
3.Hartenfeller M., Zettl H., Walter M., Rupp M., Reisen F., Proschak E., Weggen S., Stark H., Schneider G. DOGS: Reaction-Driven de novo Design of Bioactive Compounds // PLoS Computational Biology. 2012. V. 8. № 2, е1002380, www.ploscompbiol.оrg
4.Rodrigues T., Schneider P., Schneider G. Accessing New Chemical Entities through Microfluidic Systems // Angew. Chem. Int. Еd. 2014. V. 53, P. 5750–5758.
5.Peplow M. Organic synthesis: The robo-chemist. The race is on to build a machine that can synthesize any organic compound. It could transform chemistry. // Nature. 2014. V. 512. P. 20–22. http://www.nature.com/news/organic-synthesis-the-robo-chemist-1.15661
Это исключительно быстрое совершенствование методического арсенала химических исследований. Химик-исследователь с помощью современных спектральных и аналитических методов получает в единицу времени в тысячи раз (!!!) больше информации о составе, строении и свойствах вещества, чем в середине прошлого 20 века. Ведь историю химической науки можно рассматривать не только как эволюцию ее основных концепций на фоне накопления новых экспериментальных фактов. С полным правом ее можно изложить и как историю совершенствования и развития методического арсенала.
Заимствованный из смежной дисциплины новый метод не только многократно увеличивает исследовательские возможности освоившего его нового научного сообщества. Он подобен троянскому коню – вместе с ним в новую область проникают его теоретический и математический аппараты, с помощью которых ученые уже в этой сфере познания создают новые концепции. Яркий тому пример – спектроскопия. Как и многие другие методы, она пришла в химию в начале 20 века из физики. Вместе с ней химики освоили и теоретический аппарат спектроскопии – квантовую механику. Нет необходимости здесь рассказывать о том, к сколь глубоким и плодотворным сдвигам в теории строения молекул это привело.
Однако не все области химической науки за последние 50 лет столь кардинально меняли методы работы. Пожалуй, самой консервативной из них оставался органический синтез. В современной университетской лаборатории органического синтеза большинство манипуляций с органическими веществами по-прежнему проводится в "химическом стекле", которое мало изменилось со времен Велера, Бутлерова и Фишера. Холодильник Либиха, колба Вюрца, колба Эрленмейера, насадка Аншютца, пистолет Фишера – все эти приборы многие десятилетия верно служат студентам, аспирантам и всем химикам-органикам. Они удобны, когда вы работаете с количеством вещества грамм или больше. Cозданы их модификации, которые позволяют работать с десятками миллиграммов вещества в рутинном режиме. Но для того, чтобы идентифицировать и полностью охарактеризовать новое соединение, а также изучить многие его свойства с помощью современных аналитических и спектральных методов, сейчас вполне достаточно сотых долей миллиграмма. Например, при создании новых лекарств для оценки биологической активности нового соединения достаточно иметь всего несколько микрограммов вещества.
Современный органический синтез проводится строго целенаправленно. Необходимо получить вещество, обладающее определенным набором свойств. Среди тысячи синтезированных соединений–кандидатов в лучшем случае лишь три-пять после первичных тестов будут отобраны для дальнейших исследований и производства. А поэтому нет необходимости получать их все в количествах, превышающих минимально необходимые для проведения этих тестов.
Переход к работе на уровне микрограммов, безусловно, имеет огромные преимущества. Это дает экономию большого количества дорогих реактивов и растворителей, что особенно важно при работе с токсичными веществами, поскольку снижается опасность их утечки. Это многократно уменьшает количество токсичных отходов, а также сокращает время проведения опытов. Ведь нагреть или охладить реактор объемом в несколько микролитров на несколько десятков и даже сотен градусов можно за секунды, в то время как при проведении реакции в литровой колбе на это уходят десятки минут или часы. Это приводит к снижению пожаро- и взрывоопасности работы. Поэтому в последнее десятилетие огромные усилия и средства были потрачены на создание принципиально новых приемов работы и приборов для получения и исследования органических соединений в микроколичествах. В этих разработках использовались последние достижения материаловедения, точного приборостроения, микроэлектроники и компьютерной техники. В результате появилось целое новое направление, которое в научной литературе фигурирует под названием Lab on а chip – "лаборатория на чипе". Можно с уверенностью утверждать, что техника органического синтеза стоит на пороге революционных изменений. О важности происходящего свидетельствует тот факт, что научные журналы высшего ранга, в том числе Nature и Science, опубликовали в течение последних 10 лет более десятка статей, посвященных этому направлению (см., напр.: специальный номер Nature, 2006, 442, № 27).
Прежде всего заметим, что переход с макро- на микроуровень и создание химических микрореакторов совсем не простая задача. В микроколичествах жидкости ведут себя иначе, чем в макроколичествах. Для них существенно увеличивается отношение площади поверхности к объему. Турбулентное течение становится ламинарным. Существует целая наука, получившая название "микрофлюидика" (microfluidics), которая исследует поведение микроколичеств жидкостей (10–9–10–18 л) в каналах диаметром от десятков до сотен микрометров, и система технологий, которая создает приборы, обеспечивающие возможность работы с такими количествами. Приборы, использующие законы микрофлюидики, в действительности давно применяются в химическом анализе. Это газо-жидкостные хроматографы с капиллярными колонками, высокоэффективные жидкостные хроматографы и приборы капиллярного электрофореза. К началу 21 века уже были разработаны почти все компоненты, которые необходимы для создания химических микрореакторов – микронасосы, смесители, дозаторы, а также компьютерные программы для управления всеми выполняемыми ими операциями. Появились и сами микрореакторы, изготовленные из различных материалов (нержавеющая сталь, стекло, керамика, полидиметилсилоксан или другой полимер), которые размещаются на маленьких пластинках (чипах). В качестве примера на рис.1 показаны микрореакторы, которые выпускаются фирмами DeanFlow и KombiMix. Они представляют собой капиллярные трубки сложной конфигурации с несколькими входами для введения реагентов. Реакторы помещают в чехлы-термостаты, которые дают возможность в широких пределах менять температуру. Все операции в них по синтезу, разделению и очистке продуктов, а также анализу проводятся под компьютерным контролем.
Главными потребителями новых методов и приборов стали научные коллективы и фармацевтические фирмы, работающие в области создания новых лекарств (Drug design), которые проводят синтез больших наборов соединений близкого строения ("комбинаторных библиотек") и их испытания на биологическую активность. Особенно эффективными в такой работе оказались проточные реакторы. В ламинарном потоке единственным механизмом массопереноса и смешивания является диффузия, скорость которой определяется площадью поверхности, через которую диффузия осуществляется. Если в тонком капилляре друг за другом движутся несколько зон растворов разных веществ, разделенных зонами чистого растворителя, то их "размывание" происходит столь медленно, что каждая из зон может рассматриваться как отдельный изолированный химический реактор.
В качестве примера того, какие преимущества дает использование микрореакторов в органическом синтезе, обратимся к одной из работ (M.Reutlinger, T.Rodrigues, P.Schneider, G.Scheider, Angew. Chem., 2014, 53, 582–585) группы, возглавляемой профессором Жизбертом Шнайдером из Федерального технологического университета Швейцарии в Цюрихе, всемирно известного ETH (Eidgenössische Technische Hochschule Zürich). На мой взгляд, эта группа является сейчас одним из мировых лидеров в использовании методов микрофлюидной техники в органическом синтезе.
Целью исследования в этой работе был поиск эффективных антагонистов G-протеинсвязывающего рецептора. Из ранее полученных данных было известно, что перспективным классом лигандов, блокирующих этот рецептор, являются имидазопиридины. Их легко можно синтезировать с помощью трехкомпонентной реакции Уги:
Блок-схема эксперимента представлена на рис.2. В работе использовался микрореактор KombiMix (реактор В на рис.1) объемом 13 мкл. Из одного пневматического дозатора в микрореактор подается раствор смеси амина и альдегида в этаноле с добавкой 10% НClO4, которая используется как катализатор. Из второго дозатора одновременно подается раствор изонитрила в этаноле такой же концентрации. Растворы в соотношении 1 : 1 смешиваются на входе. Условия проведения реакции были оптимизированы в серии предварительных экспериментов. Наилучшие результаты были получены при температуре 100°С и скорости потока 15 мкл/с. Заметим, что время пребывания реагентов в реакторе при такой скорости потока составляло менее 1 с. Реакционная смесь из микрореактора поступает в колонку жидкостного хроматографа с УФ-детектором. При появлении пика на хроматограмме часть потока направляется на вход масс-спектрометра и/или спектрометра ЯМР, где мгновенно определяется структура появившегося вещества. Как только обнаруживается нужный продукт, раствор собирается в отдельный специальный приемник. Полное время эксперимента с момента введения исходных реагентов до получения первого чистого конечного продукта составило 20 мин. После того, как продукты первой реакции покинули систему, в нее вводятся новые исходные вещества, и проводится новый синтез. Выходы конечных продуктов в этих условиях для всей серии из 17 полученных целевых соединений превышали 90%.
Контрольные опыты показали, что для достижения тех же выходов в стандартном лабораторном эксперименте с граммовыми количествами исходных веществ чистое время на проведение только одной реакции (без времени на выделение и очистку продуктов) составляет около 2 ч. Его можно сократить до 15 мин, если проводить синтез при 170°С в микроволновом реакторе.
Результаты работы весьма красноречивы – 17 новых соединений были синтезированы, спектрально охарактеризованы, очищены и выделены за один рабочий день. Но что же можно сделать с несколькими микрограммами каждого из полученных веществ? Этого количества вполне достаточно для проведения испытаний на биологическую активность. Такие эксперименты также полностью автоматизированы.
Десяток других научных групп в мире разрабатывают направление проведения нескольких последовательных химических реакций в потоке друг за другом без выделения промежуточных продуктов, но в препаративных количествах (до сотен граммов и даже более). Пожалуй, самых впечатляющих результатов здесь добились сотрудники специального исследовательского центра, созданного в 2004 году крупнейшей фармацевтической компанией "Новартис" (NOVARTIS) совместно с Массачусетским технологическим институтом, всемирно известным MIT.
Центр, создание которого обошлось более чем в 700 млн. долл., получил название The Novartis-MIT Center for Continuous Manufacturing или "Центр МТИ – Новартис по созданию непрерывных производств". А возглавил его профессор Бернхардт Траут (Bernhardt L.Trout).
Четыре года специалисты этого центра потратили на создание гигантского химического робота, занимающего площадь 8 × 2,5 м, который без вмешательства людей под полным компьютерным контролем в непрерывном режиме начал производить гемифумаратат алискерина (эффективное средство, понижающее артериальное давление с минимальным побочным действием, рис.3). В сенсационном отчете сообщается: "С того момента, как мы открыли кран и включили рубильник, до момента появления вещества в двухметровой трубке сушильного аппарата, который стоял на выходе, прошло 47 ч. За это время было проведено 14 операций. Обычный синтез (21 операция) потребовал 300 ч".
Эффективный лекарственный препарат должен прочно связываться в активном центре выбранного рецептора. Структуры большого числа рецепторов, представляющих собой, как правило, глобулярные белки, сейчас хорошо изучены, известны трехмерные структуры их активных центров. Разработаны методы выделения таких белков и их получения методами генной инженерии. Выделенный рецептор "иммобилизуется на биочипе", то есть прикрепляется к его поверхности ковалентной связью через линкер определенной длины. При контакте поверхности чипа с раствором потенциального лиганда связывание регистрируется и количественно оценивается спектральными методами, например, по изменению спектра люминисценции. Созданы и производятся биочипы, на которых одновременно иммобилизованы десятки разных рецепторов, что позволяет в одном эксперименте определять очень широкий спектр биоактивности вещества. Все операции при этом выполняются автоматически под компьютерным контролем.
Создание нового лекарственного препарата включает несколько этапов. Первый этап, на котором проводится выбор структуры потенциального лиганда – "виртуальный скрининг". Существует несколько подходов к решению задачи выбора, среди которых наиболее эффективны два. Если известна трехмерная структура рецептора, проводят компьютерное моделирование ("докинг") структур комплексов с разными лигандами в активном центре и выбирают в качестве объекта синтеза соединение или группу родственных соединений, которые, по данным расчета, наиболее прочно связываются с рецептором. Сейчас такое моделирование осуществляют с использованием методов молекулярной механики, но я полагаю, весьма скоро появятся и уже появляются более строгие специально параметризованные квантовохимические методы, которые позволят выполнять очень большие объемы необходимых вычислений. Если уже известны, как это чаще всего и бывает, структуры значительного числа лигандов для данного рецептора, активности которых охарактеризованы количественно (эти сведения можно найти в базах данных), то на основе этих данных методами QSAR строятся математические модели, описывающие связь активности со структурой. С их помощью прогнозируют биологическую активность новых потенциальных лигандов. Надежность теоретического прогноза зависит от многих факторов и, в первую очередь, от размера и качества "обучающей выборки", на которой была построена модель. Сведениями об активностях новых веществ пополняют исходную базу данных, и на новой, большей по размеру выборке уточняется QSAR-модель, на основе которой вновь проводят "виртуальный скрининг", постепенно добиваясь все лучших результатов в таком итерационном процессе.
Более сложные проблемы возникают при попытке автоматизировать второй этап работы – выбор оптимального пути синтеза лигандов, отобранных по результатам математического моделирования. Ведь даже опытный химик-синтетик сразу не может предложить многостадийную последовательность сборки структуры, которую можно осуществить с приемлемыми затратами времени и с хорошими выходами. Правда, уже создано несколько компьютерных программ (RECAP, Chematica, SYNOPSIS), которые помогают химикам в таком выборе. В группе Шнайдера разработана новая компьютерная программа DOGS (см. PLoS Computational Biology, 2012, 8, № 2, е1002380, www.ploscompbiol.оrg), которая автоматически анализирует возможности сборки целевых структур исходя из 25 144 коммерчески доступных блоков-предшественников. За основу при создании библиотеки строительных блоков был взят полный каталог фирмы Sigma-Aldrich (около 57 000 соединений), из которого были выбраны только вещества, содержащие атомы С, N, O, S, P, F, Cl, Br, I, B, Si и Se, но исключены соединения с молекулярными массами меньше 30 Д и больше 300 Д, а также вещества, содержащие более трех атомов фтора и более четырех конденсированных колец. В качестве методов сборки целевых молекул по литературным данным были выбраны и специальным образом закодированы 15 наиболее отработанных методов введения функциональных групп и их взаимопревращений, а также 58 синтетических реакций построения скелетов молекул, которые протекают с высокими выходами и условия для которых детально отработаны. Программа по специальному итерационному алгоритму проводит ретросинтетический анализ целевой структуры, оценивает пути ее сборки и предлагает наиболее приемлемый путь. Полученные результаты вызывают определенный оптимизм, хотя необходимость дальнейшего совершенствования очевидна.
Роботизация самого синтеза отобранных соединений с использованием микрофлюидной техники, а также в макромасштабе, как следует из приведенного выше примера, является чисто технической задачей, так же, как и сопряжение блока синтеза с блоком испытаний на биологическую активность. Автоматизированные системы такого типа уже существуют и активно используются. Таким образом, быстрое совершенствование микрофлюидной техники и проточных микрореакторов открывает реальную перспективу осуществления фантастической дерзкой мечты полной роботизации получения органических соединений с заранее заданными свойствами, в том числе, создания новых лекарств. Полагаю, что это мнение может быть со скептической улыбкой встречено многими химиками-органиками. Как будут развиваться события, покажет ближайшее время. Состояние этой области на начало 2014 года представлено в миниобзоре Шнайдера с сотрудниками (Angew. Chem. Int. Еd. 2014, 53, 5750–5758). Интересный материал можно также найти в статье Марка Пеплова (Peplow M. Nature, 2014, 512, 20–22).
Последите далее сами за развитием событий в этой области и за работами группы профессора Шнайдера. Он, наверняка, добьется самых высоких научных наград. Разумеется, стремительное вторжение микрофлюидной техники в органический синтез никак не умаляет значения классических методов синтеза, которые всегда будут необходимы при наработке больших количеств веществ, в том числе в промышленных масштабах.
ЛИТЕРАТУРА
1.Insight: Lab on a chip // Nature. 2006. V. 442. № 27. P. 367–419.
2.Reutlinger M., Rodrigues T., Schneider P., Scheider G. Combining On-Chip Synthesis of a Focused Combinatorial Library with Computational Target Prediction Reveals Imidazopyridine GPCR Ligands // Angew.Chem. 2014. V. 53. P. 582–585.
3.Hartenfeller M., Zettl H., Walter M., Rupp M., Reisen F., Proschak E., Weggen S., Stark H., Schneider G. DOGS: Reaction-Driven de novo Design of Bioactive Compounds // PLoS Computational Biology. 2012. V. 8. № 2, е1002380, www.ploscompbiol.оrg
4.Rodrigues T., Schneider P., Schneider G. Accessing New Chemical Entities through Microfluidic Systems // Angew. Chem. Int. Еd. 2014. V. 53, P. 5750–5758.
5.Peplow M. Organic synthesis: The robo-chemist. The race is on to build a machine that can synthesize any organic compound. It could transform chemistry. // Nature. 2014. V. 512. P. 20–22. http://www.nature.com/news/organic-synthesis-the-robo-chemist-1.15661
Отзывы читателей
