eng
Выпуск #6/2015
Д.Фармаковский
Применение жидкостных тандемных хромато-масс-спектрометров Shimadzu в клинической лабораторной диагностике
Применение жидкостных тандемных хромато-масс-спектрометров Shimadzu в клинической лабораторной диагностике
Просмотры: 3093
С момента основания в 1875 году японская корпорация Shimadzu, один из крупнейших мировых производителей аналитического, измерительного и медицинского оборудования, ставит своей целью повышение качества жизни человека. В арсенале Shimadzu тысячи технических и методических решений по контролю качества и безопасности пищевой продукции (и сырья для ее производства), анализу объектов окружающей среды, безопасности промышленных изделий и материалов. В статье представлен опыт использования жидкостных тандемных хромато-масс-спектрометров Shimadzu для решения задач в области клинической лабораторной диагностики.
Теги: catecholamines clinical laboratory diagnostic dopamine epinephrine immunosuppressive drugs lc-ms/ms mass spectrometry norepinephrine steroids адреналин вэжх-мс/мс дофамин иммунодепрессанты катехоламины клиническая лабораторная диагностика масс-спектрометрия норадреналин стероидные гормоны стероиды
Особое внимание компания уделяет постоянному совершенствованию практических решений в двух областях, непосредственно связанных со здоровьем человека: фармацевтической промышленности (включая разработку, производство и контроль качества лекарственных средств) и клинической лабораторной диагностике. Успешной работе в этом направлении способствует накопленный за столетие производства оборудования для медицины (рентгеновские аппараты, ангиографические системы, системы для томосинтеза и др.) колоссальный опыт в области исследования человеческого организма, охраны его здоровья и диагностики заболеваний.
Разработка практических решений для клинической лабораторной диагностики получила новый импульс в связи с запуском компанией в производство высокопроизводительных хромато-масс-спектрометров серии UFMS (Ultra Fast Mass Spectrometry). Благодаря высокой толерантности к интерферирующим компонентам матрицы образца, возможности одновременной идентификации и количественного определения множества целевых соединений различной природы в ходе одного анализа и, наконец, высочайшей чувствительности, тандемные жидкостные хромато-масс-спектрометры UFMS на сегодняшний день являются практически идеальными инструментами для анализа сложных биологических объектов (цельная кровь, сыворотка и плазма крови, моча, спинномозговая жидкость и т.п.). Специалисты Shimadzu уделяют пристальное внимание обеспечению удобства эксплуатации приборов (включая профилактическое обслуживание) и максимальной автоматизации процесса анализа. Особые усилия направлены на то, чтобы сделать работу на таком сложном аналитическом инструменте, как масс-спектрометр, такой же простой и удобной, как и на привычных медикам биохимических или иммуноферментных анализаторах.
Ряд областей клинической лабораторной диагностики, где могут и уже с успехом применяются тандемные жидкостные хромато-масс-спектрометры, включают терапевтический лекарственный мониторинг иммунодепрессантов, анальгетиков, противоопухолевых, гормональных препаратов и пр.; диагностику наследственных заболеваний обмена веществ (неонатальный скрининг); раннюю диагностику заболеваний путем гормонального скрининга, количественного определения катехоламинов, поиска биомаркеров (например, онкомаркеров) и пр.; судебную медицину и токсикологию, выявление и идентификацию сильнодействующих и запрещенных препаратов и их метаболитов.
Приведем несколько примеров практических решений в области клинической лабораторной диагностики с использованием тандемных хромато-масс-спектрометров серии UFMS.
Определение количественного содержания иммунодепрессантов в цельной крови*
Иммунодепрессанты играют важную роль в трансплантологии, а также используются для лечения расстройств иммунной системы и неаутоиммунных воспалительных реакций, таких как тяжелая аллергическая астма. Терапевтический диапазон концентраций этих соединений, как правило, достаточно узок, поэтому для правильной дозировки препаратов необходим тщательный и постоянный контроль их содержания в крови пациента.
Компания Shimadzu в сотрудничестве
с известным производителем реагентов для клинической диагностики – RECIPE Chemicals +
Instruments (Германия) – разработала быстрый и надежный способ определения количественного содержания широкого спектра иммунодепрессантов в цельной крови с использованием метода онлайн-твердофазной экстракции с последующим ВЭЖХ-разделением и масс-спектрометрическим детектированием (рис.1). Для анализа используются коммерческие наборы RECIPE ClinMass LC-MS/MS Complete Kit, advanced MS1100 (рис.2), которые включают колонку для онлайн-твердофазной экстракции, аналитическую хроматографическую колонку, все необходимые реагенты, стандарты и контрольные образцы, а также подвижную фазу. Конфигурация жидкостного хроматографа аналогична хорошо зарекомендовавшей себя системе для анализа биологических образцов Shimadzu Co-Sense и предусматривает наличие 6-портового/2-позиционного крана переключения потоков подвижной фазы.
Процедура подготовки образцов к анализу проста и состоит из трех стадий: осаждение белков путем добавления к 100 мкл цельной крови 220 мкл осаждающего реагента с предварительно добавленным внутренним стандартом, инкубация в течение фиксированного времени и центрифугирование полученной смеси. Для анализа достаточно пятидесяти микролитров получившегося супернатанта. Условия анализа приведены в табл.1, а режимы регистрации MRM-переходов для целевых соединений и соответствующих внутренних стандартов представлены в табл.2. Для каждого соединения и стандарта выбрано два специфических MRM-перехода. Время анализа без учета предварительной подготовки образца менее двух минут.
Как видно из рис.3, где приведен пример ТФЭ-ВЭЖХ-МС/МС анализа образца цельной крови, и рис.4, где представлены калибровочные кривые для четырех иммунодепрессантов, тандем Shimadzu-RECIPE обеспечивает быстрое количественное определение иммунодепрессантов в заданном терапевтическом диапазоне концентраций. Точность и воспроизводимость можно оценить на примере результатов, полученных для такролимуса и циклоспорина А (табл.3).
Стероидное профилирование плазмы крови
Точное определение количественного содержания различных стероидных гормонов в организме человека необходимо для диагностики множества заболеваний, например, врожденной гиперплазии коры надпочечников, болезни Иценко-Кушинга, первичного гиперальдостеронизма, эндометриоза и пр. Кроме того, поскольку метаболизм стероидов в организме регулируется несколькими механизмами, одновременное количественное определение множества стероидов в одном образце (стероидное профилирование, гормональный скрининг) может служить своеобразной диагностической картой общего состояния здоровья пациента. Существующие методы, основанные на иммуноферментном анализе, не позволяют проводить одновременное определение нескольких стероидов в одном образце и к тому же страдают недостатком специфичности. С помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии возможен одновременный полностью автоматизированный количественный анализ множества стероидов за короткое время, при этом не требуется большой объем исследуемой пробы.
Приведем пример использования масс-спектрометра LCMS-8050 для быстрого количественного определения 15 стероидов в плазме крови. Подготовку образцов проводили методом жидкостно-жидкостной экстракции в нанесенном слое (Supported Liquid Extraction, SLE) c использованием патронов ISOLUTE SLE+ (Biotage, США) объемом 1 мл и объединенных в картриджи формата 96-луночного планшета. Такой формат позволяет одновременно готовить к исследованию до 96 проб. Стандартные образцы получали из смешанного (6 доноров: 3 мужчины, 3 женщины) и дважды очищенного активированным углем образца плазмы крови (Seralab, Великобритания) и стероидов производства Sigma-Aldrich (США). К 100 мкл образца плазмы крови добавляли внутренний стандарт и 300 мкл деионизованной воды, 400 мкл полученного раствора вносили в патрон ISOLUTE SLE+ и инкубировали в течение 5 мин. Затем промывали патрон избытком дихлорметана, высушивали элюат в токе азота, сухой остаток растворяли в 100 мкл смеси вода/метанол (1 : 1).
Условия хроматографического разделения и масс-спектрометрического анализа приведены в табл.4.
Для увеличения точности и воспроизводимости анализа использовали метод MRM Synchronisation, при котором время регистрации MRM-переходов для каждого целевого компонента синхронизировано со временем элюирования последнего (рис.5).
На рис.6 представлены типичные хроматографические пики некоторых стероидов, полученные в режиме регистрации MRM, а в табл.5 результаты анализа.
Определение количественного содержания катехоламинов в плазме крови
Катехоламины, адреналин, норадреналин и дофамин синтезируются в мозговом веществе надпочечников, в симпатической нервной системе и в мозге человека и животных. Они выполняют важную функцию медиаторов и нейрогормонов, а уровень их количественного содержания в биологических жидкостях (крови и моче) может служить диагностическим признаком развития ряда заболеваний (феохромоцитома, карциноид, нейробластома, дисфункция симпатической нервной системы и др.) На сегодняшний день стандартным методом определения концентрации катехоламинов и их метаболитов в плазме крови является высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с электрохимическим детектированием. При этом ряд проблем существенно осложняет анализ. Например, чрезвычайно слабое удерживание катехоламинов (особенно норадреналина) на стандартных хроматографических колонках с обращенной фазой, сильное влияние матричного эффекта и, соответственно, низкая селективность электрохимических детекторов, сложность в разделении изобарных соединений (адреналина и норметанефрина) и др. Специалисты Shimadzu разработали в 2015 году высокопроизводительный метод количественного определения катехоламинов в плазме / моче. Этот метод предусматривает использование специализированной хроматографической колонки, неподвижная фаза которой помимо традиционных октадецильных групп содержит еще ионы металлов.
Для количественного определения катехоламинов в плазме крови с высокой чувствительностью и точностью необходимо минимизировать влияние мешающих компонентов матрицы, например, белков. При этом процедура пробоподготовки в условиях клинической лаборатории должна позволять одновременно обрабатывать большое число образцов, быть максимально простой и обладать потенциалом для автоматизации. В работе для подготовки проб плазмы (протокол приведен в табл.6) использовали картриджи для твердофазной экстракции Evolute Express WCX в формате 96-луночных планшетов и автоматизированную станцию для пробоподготовки Extrahera (все производства Biotage, США).
На рис.7 приведен пример быстрого (< 5 мин) хроматографического разделения трех катехоламинов на колонке Shim-Pack MAqC-ODS I. Условия разделения представлены в табл.7. Видно, что катионообменные свойства колонки позволяют эффективно разделить до базовой линии все целевые компоненты, включая норадреналин.
При количественном анализе реальных образцов плазмы крови следует учитывать, что в них изначально содержится определенное количество эндогенных катехоламинов. Для оценки их влияния проведен эксперимент, в котором сравнивали калибровочные кривые, полученные при использовании двух типов образцов плазмы: предварительно очищенных и заведомо не содержащих катехоламинов ("чистых") образцов и реальных проб, полученных от доноров. Концентрацию катехоламинов в образцах обеих серий варьировали путем добавления дейтерированных катехоламинов. Результаты эксперимента, представленные в табл.8, показали, что присутствие эндогенных катехоламинов практически не влияет на количественные характеристики анализа.
Дейтерированные соединения удобно использовать в качестве внутренних стандартов при количественном анализе, поскольку (см. рис.8), их хроматографические сигналы не контаминируются пиками эндогенных катехоламинов в реальных образцах плазмы.
В табл.9 приведены результаты количественного анализа модельных образцов, приготовленных из реальных проб плазмы. В качестве внутренних стандартов использовали соответствующие дейтерированные катехоламины, а концентрацию нативных катехоламинов варьировали путем добавления определенного количества чистого препарата. Концентрацию эндогенных катехоламинов вычисляли по соотношению площадей пиков катехоламина и соответствующего внутреннего стандарта в "холостом" образце.
Разумеется, в рамках одной статьи невозможно охватить весь спектр практических решений Shimadzu с использованием жидкостных тандемных масс-спектрометров для современных клинических лабораторий. За рамками статьи остались следующие методические разработки:
•количественное определение 25-OH витамина D2/D3 в плазме и сыворотке крови;
•количественное определение метилмалоновой кислоты в сыворотке и плазме крови;
•количественное определение 33 бензодиазепинов в сыворотке крови;
•количественное определение этилглюкуронида и этилсульфата в плазме и сыворотке крови и моче;
•количественное определение метилмалоновой, 3-OH пропионовой, янтарной и фумарилацетоуксусной кислот в сухом пятне крови;
•количественное определение гомоцистеина в плазме крови;
•количественное определение аденозиндезаминазы (ADA) в моче;
•количественное определение аминокислот и ацилкарнитинов в сухом пятне крови (Neonatal Solutions);
•количественное определение дельта-9-тетрагидроканнабинола и его метаболитов в цельной крови, плазме и моче;
•быстрое полуколичественное определение более 500 запрещенных и сильнодействующих средств и их метаболитов в сыворотке крови (Rapid Tox Screening Package) и др.
Совершенствование модельного ряда оборудования и сотрудничество компании с рядом ведущих европейских, японских и североамериканских производителей реагентов и наборов для клинической диагностики позволяют постоянно расширять область применения масс-спектрометров в медицине. Жидкостные хромато-масс-спектрометры Shimadzu сертифицированы как устройства для лабораторной диагностики (IVD) и имеют регистрационные удостоверения на медицинские изделия Росздравназора РФ.
* Данные любезно предоставлены Сильвией Бёхер (RECIPE Chemicals+Instruments) и Аней Грюнинг (Shimadzu Europa).
Разработка практических решений для клинической лабораторной диагностики получила новый импульс в связи с запуском компанией в производство высокопроизводительных хромато-масс-спектрометров серии UFMS (Ultra Fast Mass Spectrometry). Благодаря высокой толерантности к интерферирующим компонентам матрицы образца, возможности одновременной идентификации и количественного определения множества целевых соединений различной природы в ходе одного анализа и, наконец, высочайшей чувствительности, тандемные жидкостные хромато-масс-спектрометры UFMS на сегодняшний день являются практически идеальными инструментами для анализа сложных биологических объектов (цельная кровь, сыворотка и плазма крови, моча, спинномозговая жидкость и т.п.). Специалисты Shimadzu уделяют пристальное внимание обеспечению удобства эксплуатации приборов (включая профилактическое обслуживание) и максимальной автоматизации процесса анализа. Особые усилия направлены на то, чтобы сделать работу на таком сложном аналитическом инструменте, как масс-спектрометр, такой же простой и удобной, как и на привычных медикам биохимических или иммуноферментных анализаторах.
Ряд областей клинической лабораторной диагностики, где могут и уже с успехом применяются тандемные жидкостные хромато-масс-спектрометры, включают терапевтический лекарственный мониторинг иммунодепрессантов, анальгетиков, противоопухолевых, гормональных препаратов и пр.; диагностику наследственных заболеваний обмена веществ (неонатальный скрининг); раннюю диагностику заболеваний путем гормонального скрининга, количественного определения катехоламинов, поиска биомаркеров (например, онкомаркеров) и пр.; судебную медицину и токсикологию, выявление и идентификацию сильнодействующих и запрещенных препаратов и их метаболитов.
Приведем несколько примеров практических решений в области клинической лабораторной диагностики с использованием тандемных хромато-масс-спектрометров серии UFMS.
Определение количественного содержания иммунодепрессантов в цельной крови*
Иммунодепрессанты играют важную роль в трансплантологии, а также используются для лечения расстройств иммунной системы и неаутоиммунных воспалительных реакций, таких как тяжелая аллергическая астма. Терапевтический диапазон концентраций этих соединений, как правило, достаточно узок, поэтому для правильной дозировки препаратов необходим тщательный и постоянный контроль их содержания в крови пациента.
Компания Shimadzu в сотрудничестве
с известным производителем реагентов для клинической диагностики – RECIPE Chemicals +
Instruments (Германия) – разработала быстрый и надежный способ определения количественного содержания широкого спектра иммунодепрессантов в цельной крови с использованием метода онлайн-твердофазной экстракции с последующим ВЭЖХ-разделением и масс-спектрометрическим детектированием (рис.1). Для анализа используются коммерческие наборы RECIPE ClinMass LC-MS/MS Complete Kit, advanced MS1100 (рис.2), которые включают колонку для онлайн-твердофазной экстракции, аналитическую хроматографическую колонку, все необходимые реагенты, стандарты и контрольные образцы, а также подвижную фазу. Конфигурация жидкостного хроматографа аналогична хорошо зарекомендовавшей себя системе для анализа биологических образцов Shimadzu Co-Sense и предусматривает наличие 6-портового/2-позиционного крана переключения потоков подвижной фазы.
Процедура подготовки образцов к анализу проста и состоит из трех стадий: осаждение белков путем добавления к 100 мкл цельной крови 220 мкл осаждающего реагента с предварительно добавленным внутренним стандартом, инкубация в течение фиксированного времени и центрифугирование полученной смеси. Для анализа достаточно пятидесяти микролитров получившегося супернатанта. Условия анализа приведены в табл.1, а режимы регистрации MRM-переходов для целевых соединений и соответствующих внутренних стандартов представлены в табл.2. Для каждого соединения и стандарта выбрано два специфических MRM-перехода. Время анализа без учета предварительной подготовки образца менее двух минут.
Как видно из рис.3, где приведен пример ТФЭ-ВЭЖХ-МС/МС анализа образца цельной крови, и рис.4, где представлены калибровочные кривые для четырех иммунодепрессантов, тандем Shimadzu-RECIPE обеспечивает быстрое количественное определение иммунодепрессантов в заданном терапевтическом диапазоне концентраций. Точность и воспроизводимость можно оценить на примере результатов, полученных для такролимуса и циклоспорина А (табл.3).
Стероидное профилирование плазмы крови
Точное определение количественного содержания различных стероидных гормонов в организме человека необходимо для диагностики множества заболеваний, например, врожденной гиперплазии коры надпочечников, болезни Иценко-Кушинга, первичного гиперальдостеронизма, эндометриоза и пр. Кроме того, поскольку метаболизм стероидов в организме регулируется несколькими механизмами, одновременное количественное определение множества стероидов в одном образце (стероидное профилирование, гормональный скрининг) может служить своеобразной диагностической картой общего состояния здоровья пациента. Существующие методы, основанные на иммуноферментном анализе, не позволяют проводить одновременное определение нескольких стероидов в одном образце и к тому же страдают недостатком специфичности. С помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии возможен одновременный полностью автоматизированный количественный анализ множества стероидов за короткое время, при этом не требуется большой объем исследуемой пробы.
Приведем пример использования масс-спектрометра LCMS-8050 для быстрого количественного определения 15 стероидов в плазме крови. Подготовку образцов проводили методом жидкостно-жидкостной экстракции в нанесенном слое (Supported Liquid Extraction, SLE) c использованием патронов ISOLUTE SLE+ (Biotage, США) объемом 1 мл и объединенных в картриджи формата 96-луночного планшета. Такой формат позволяет одновременно готовить к исследованию до 96 проб. Стандартные образцы получали из смешанного (6 доноров: 3 мужчины, 3 женщины) и дважды очищенного активированным углем образца плазмы крови (Seralab, Великобритания) и стероидов производства Sigma-Aldrich (США). К 100 мкл образца плазмы крови добавляли внутренний стандарт и 300 мкл деионизованной воды, 400 мкл полученного раствора вносили в патрон ISOLUTE SLE+ и инкубировали в течение 5 мин. Затем промывали патрон избытком дихлорметана, высушивали элюат в токе азота, сухой остаток растворяли в 100 мкл смеси вода/метанол (1 : 1).
Условия хроматографического разделения и масс-спектрометрического анализа приведены в табл.4.
Для увеличения точности и воспроизводимости анализа использовали метод MRM Synchronisation, при котором время регистрации MRM-переходов для каждого целевого компонента синхронизировано со временем элюирования последнего (рис.5).
На рис.6 представлены типичные хроматографические пики некоторых стероидов, полученные в режиме регистрации MRM, а в табл.5 результаты анализа.
Определение количественного содержания катехоламинов в плазме крови
Катехоламины, адреналин, норадреналин и дофамин синтезируются в мозговом веществе надпочечников, в симпатической нервной системе и в мозге человека и животных. Они выполняют важную функцию медиаторов и нейрогормонов, а уровень их количественного содержания в биологических жидкостях (крови и моче) может служить диагностическим признаком развития ряда заболеваний (феохромоцитома, карциноид, нейробластома, дисфункция симпатической нервной системы и др.) На сегодняшний день стандартным методом определения концентрации катехоламинов и их метаболитов в плазме крови является высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с электрохимическим детектированием. При этом ряд проблем существенно осложняет анализ. Например, чрезвычайно слабое удерживание катехоламинов (особенно норадреналина) на стандартных хроматографических колонках с обращенной фазой, сильное влияние матричного эффекта и, соответственно, низкая селективность электрохимических детекторов, сложность в разделении изобарных соединений (адреналина и норметанефрина) и др. Специалисты Shimadzu разработали в 2015 году высокопроизводительный метод количественного определения катехоламинов в плазме / моче. Этот метод предусматривает использование специализированной хроматографической колонки, неподвижная фаза которой помимо традиционных октадецильных групп содержит еще ионы металлов.
Для количественного определения катехоламинов в плазме крови с высокой чувствительностью и точностью необходимо минимизировать влияние мешающих компонентов матрицы, например, белков. При этом процедура пробоподготовки в условиях клинической лаборатории должна позволять одновременно обрабатывать большое число образцов, быть максимально простой и обладать потенциалом для автоматизации. В работе для подготовки проб плазмы (протокол приведен в табл.6) использовали картриджи для твердофазной экстракции Evolute Express WCX в формате 96-луночных планшетов и автоматизированную станцию для пробоподготовки Extrahera (все производства Biotage, США).
На рис.7 приведен пример быстрого (< 5 мин) хроматографического разделения трех катехоламинов на колонке Shim-Pack MAqC-ODS I. Условия разделения представлены в табл.7. Видно, что катионообменные свойства колонки позволяют эффективно разделить до базовой линии все целевые компоненты, включая норадреналин.
При количественном анализе реальных образцов плазмы крови следует учитывать, что в них изначально содержится определенное количество эндогенных катехоламинов. Для оценки их влияния проведен эксперимент, в котором сравнивали калибровочные кривые, полученные при использовании двух типов образцов плазмы: предварительно очищенных и заведомо не содержащих катехоламинов ("чистых") образцов и реальных проб, полученных от доноров. Концентрацию катехоламинов в образцах обеих серий варьировали путем добавления дейтерированных катехоламинов. Результаты эксперимента, представленные в табл.8, показали, что присутствие эндогенных катехоламинов практически не влияет на количественные характеристики анализа.
Дейтерированные соединения удобно использовать в качестве внутренних стандартов при количественном анализе, поскольку (см. рис.8), их хроматографические сигналы не контаминируются пиками эндогенных катехоламинов в реальных образцах плазмы.
В табл.9 приведены результаты количественного анализа модельных образцов, приготовленных из реальных проб плазмы. В качестве внутренних стандартов использовали соответствующие дейтерированные катехоламины, а концентрацию нативных катехоламинов варьировали путем добавления определенного количества чистого препарата. Концентрацию эндогенных катехоламинов вычисляли по соотношению площадей пиков катехоламина и соответствующего внутреннего стандарта в "холостом" образце.
Разумеется, в рамках одной статьи невозможно охватить весь спектр практических решений Shimadzu с использованием жидкостных тандемных масс-спектрометров для современных клинических лабораторий. За рамками статьи остались следующие методические разработки:
•количественное определение 25-OH витамина D2/D3 в плазме и сыворотке крови;
•количественное определение метилмалоновой кислоты в сыворотке и плазме крови;
•количественное определение 33 бензодиазепинов в сыворотке крови;
•количественное определение этилглюкуронида и этилсульфата в плазме и сыворотке крови и моче;
•количественное определение метилмалоновой, 3-OH пропионовой, янтарной и фумарилацетоуксусной кислот в сухом пятне крови;
•количественное определение гомоцистеина в плазме крови;
•количественное определение аденозиндезаминазы (ADA) в моче;
•количественное определение аминокислот и ацилкарнитинов в сухом пятне крови (Neonatal Solutions);
•количественное определение дельта-9-тетрагидроканнабинола и его метаболитов в цельной крови, плазме и моче;
•быстрое полуколичественное определение более 500 запрещенных и сильнодействующих средств и их метаболитов в сыворотке крови (Rapid Tox Screening Package) и др.
Совершенствование модельного ряда оборудования и сотрудничество компании с рядом ведущих европейских, японских и североамериканских производителей реагентов и наборов для клинической диагностики позволяют постоянно расширять область применения масс-спектрометров в медицине. Жидкостные хромато-масс-спектрометры Shimadzu сертифицированы как устройства для лабораторной диагностики (IVD) и имеют регистрационные удостоверения на медицинские изделия Росздравназора РФ.
* Данные любезно предоставлены Сильвией Бёхер (RECIPE Chemicals+Instruments) и Аней Грюнинг (Shimadzu Europa).
Отзывы читателей
