eng
Выпуск #6/2015
Х.Вюнше, Д.Зиверс
БЕЗМАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ БЕЛКА МЕТОДОМ БИОСЛОЙНОЙ ИНТЕРФЕРОМЕТРИИ
БЕЗМАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ БЕЛКА МЕТОДОМ БИОСЛОЙНОЙ ИНТЕРФЕРОМЕТРИИ
Просмотры: 3918
Анализ белка требует технологий, в которых можно обойтись без агентов-детекторов. Все шире применяются системы без использования микрофлюидики, обеспечивающие простоту в обращении, более высокую скорость измерений и значительно больший набор данных. Один из эффективных методов анализа белка в режиме реального времени основан на явлении интерференции света и называется "биослойная интерферометрия". Устройства, работающие по этому принципу, позволяют быстро в комплексе решать задачи по исследованию вирусов и вакцин, взаимодействия РНК и ДНК, белково-липидного взаимодействия, характеризации антител и фрагментов антител, созданию новых лекарственных препаратов и др.
Теги: bio-layer interferometry markerlabel-free assay protein-lipid interaction безмаркерный анализ белково-липидное взаимодействие биослойная интерферометрия
В основе метода биослойной интерферометрии (BLI) лежит явление интерференции световых волн. Оптоволоконный BLI-биодатчик представляет собой цилиндр, на его торец наносится биосовместимый слой, к которому могут прикрепляться молекулы белка (рис.1). По оптоволокну направляют пучок белого света к биосовместимому слою, часть света отражается от его поверхности (Х на рис.2а), а часть проходит в глубину слоя и отражается от его нижней поверхности (Y на рис.2а). Две отраженные от разных поверхностей волны проходят до точки наблюдения разные расстояния и, накладываясь, интерферируют. Если фиксировать интенсивность света каждой длины волны на выходе из биодатчика, то получится так называемый интерференционный профиль (график зависимости интенсивности света от длины волны), – синусоида, минимумы которой соответствуют результату наложения двух волн, пришедших в точку наблюдения в противофазе, а максимумы возникают при наложении волн, приходящих в точку наблюдения в фазе. По мере того, как молекулы белка прикрепляются к торцу биодатчика, увеличивается разность хода между интерферирующими волнами за счет расширения биослоя (рис.2б). В результате интерференционный профиль смещается в область длинных волн, то есть вправо. Чем больше молекул прикрепляется к торцу датчика, тем сильнее смещение. Поскольку процесс связывания молекул с биоповерхностью динамический, то есть прикрепленные молекулы диссоциируют и вновь попадают в раствор, а другие прикрепляются, то интерференционный профиль смещается влево, когда преобладают по скорости процессы диссоциации, или вправо, когда преобладают процессы ассоциации (рис.3). График зависимости сдвига от времени представляет классическую кривую диссоциации, из которой можно определить скорость ассоциации или диссоциации (ka, kd), константу аффинности (KD) и др. (рис.4).
Портфолио приборов Fortebio
Технология BLI с 2005 года используется в приборах компании Fortebio, предприятия группы Pall Life Sciences. Системы Pall-Fortebio-Octet (рис.5) применяются для безмаркерного анализа биомолекулярных взаимодействий в режиме реального времени с высокой производительностью. Например, система Octet может произвести специфичный количественный анализ белка в 96 образцах менее чем за 30 мин.
Данные системы позволяют исследователям выполнять анализы, традиционно проводимые с помощью ИФА (иммуносорбентный ферментный анализ), ВЭЖХ или SPR (поверхностный плазмонный резонанс). Измерение образцов происходит параллельно, используются регенерируемые биодатчики без маркирующих веществ или микрофлюидных компонентов. Платформа состоит из 8- или 16-канальных инструментов, совместимых с 96- или 384-луночными планшетами. Они позволяют использовать меньшее количество захваченных молекул и снизить затраты на проводимые исследования. Системы Octet легко перемещаются, обеспечивая эффективную работу лаборатории.
С 2012 года семейство устройств дополняет удобная одноканальная система Pall-Fortebio-BLItz (рис.6) для обработки небольшого числа проб. Используя только маленькую каплю, она производит быстрый количественный и кинетический анализ белка, а также анализ аффинности взаимодействия протеина. Высокочувствительная система разработана для тех, кто работает с белками, а особенно для тех, кто проводит количественный анализ, отслеживает выделение или проводит инженерные исследования белка. Для определения требуется в 15–20 раз меньше образца по сравнению с безмаркерным SPR или ИФА с использованием микропланшета.
Все системы Fortebio применяют в режиме реального времени для проведения количественного анализа белка, определения аффинности и кинетического анализа в простом формате Drop-Read-Done (образец, анализ, результат). Они отличаются простотой в управлении, высокой скоростью и экономичностью. Устройства незаменимы на многих этапах исследования белка, например, при анализе хроматографических фракций, осуществлении контроля качества, при анализе экспрессии белка.
Платформа Pall-Fortebio благодаря производительности рабочего цикла позволяет легко и быстро составить характеристику нового кандидата в лекарственные препараты в области изыскания и разработок новых лекарственных веществ, в то время как занимающие много времени традиционные методики ограничены по пропускной способности проб и связаны с высокими затратами.
Безмаркерный
количественный анализ
Распространенные процедуры анализа при разработке и производстве антител – скрининг гибридомных супернатантов с помощью методик ИФА, иммуногистохимическое исследование или Вестерн-блот. Так, например, количественный анализ IgG человека в супернатантах единичной колонии Wells позволяет отобрать клеточные линии с наибольшей скоростью выработки антител. Такое определение концентрации, для которого ранее не было экономичной методики, можно выполнить с помощью быстрого двухминутного протокола Pall-Fortebio-Octet. Прибор с помощью специальных биодатчиков антител человека Fab-CH1, работающих по принципу Dip and Read (погружайте и читайте), и стандартного ряда IgG осуществляет количественный анализ. Все подтипы человеческого IgG распознаются, в то время как легкие цепи IgG или человеческий Fc-фрагмент тяжелой цепи не связываются.
Экспресс-анализ концентрации антител также является важным критерием при анализе хроматографических фракций, реагентов клеточных культур или факторов роста. До появления платформы Pall-Fortebio для определения концентрации антител была необходима аффинная очистка.
В зависимости от конкретного применения предлагаются разные биодатчики для количественного анализа IgG. Кроме датчиков для определения белка A, белка G и белка L, существуют разные модификации для анализа специфических белков человека и мыши. Кроме этого, многие наборы и методики позволяют определить антитела с низкой аффинностью (сродством) к лекарственным препаратам (ADA), остаточные белки клетки-хозяина (Host Cell Protein), а также остаточный белок A.
Количественный анализ индивидуальных аналитов возможен при иммобилизации пользователем отобранных им лигандов с помощью биодатчика стрептовидина (SA) или аминореактивного биодатчика (AR2G). Таким образом, протоколы ИФА можно заменить на более эффективные методы BLI для определения концентрации с помощью системы Pall-Fortebio. Необходимые в методиках ИФА частые этапы очистки в этом случае не требуются. Анализ позволяет получить более точный (вариационный коэффициент < 10%) и быстрый результат. Кроме этого, с помощью анализа Pall-Fortebio можно тестировать необработанные пробы при их минимальной подготовке.
Безмаркерный
кинетический анализ
Растущий спрос на высококачественные антитела с высокой специфичностью требует оптимизации традиционных гибридомных технологических процессов. Для такой оптимизации необходимы методы скрининга, более информативно на ранней стадии характеризирующие взаимодействие антител и антигенов. При этом использование методики ИФА как классического метода конечных точек дает ограниченную информацию, которая способствует идентификации антител с высокой аффинностью связывания. Кроме того, существует риск нежелательного связывания агентов-детекторов. Антитела с низкой аффинностью связывания к тому же могут удаляться в ходе необходимой очистки, что делает невозможным их определение с помощью ИФА.
В этом свете наиболее предпочтительным является безмаркерный скрининг, так как он позволяет получить детальные кинетические данные о взаимодействии антител и антигенов в режиме реального времени, обеспечивая достоверное определение аффинности связывания антитела для соответствующего антигена. В отличие от методик ИФА, которые дают только приблизительное значение констант аффинности (KD), безмаркерный скрининг позволяет определять константы аффинности и константы скорости ассоциации и диссоциации (ka, kd). Это важно, поскольку различным скоростям ассоциации и диссоциации может соответствовать одна и та же константа аффинности (см. рис.4). Кроме того, новую технологию с успехом можно использовать для отображения или биннинга эпитопов из образцов, не прошедших подготовку или очистку. Сравнительный анализ выявляет пары IgG, связывающиеся с одним и тем же эпитопом одного антигена (рис.7).
Заключение
В платформе Pall-Fortebio применяются системы без микрофлюидики, в которых биодатчики непосредственно погружают в образец и используют для высокоэффективного безмаркерного параллельного скрининга взаимодействия антител и целевых антигенов в сложных образцах, не прошедших специальную подготовку. Это снижает стоимость, а также затраты труда и времени, тем более что анализ осуществляется непосредственно в среде или лизате без предварительной очистки.
Портфолио приборов Fortebio
Технология BLI с 2005 года используется в приборах компании Fortebio, предприятия группы Pall Life Sciences. Системы Pall-Fortebio-Octet (рис.5) применяются для безмаркерного анализа биомолекулярных взаимодействий в режиме реального времени с высокой производительностью. Например, система Octet может произвести специфичный количественный анализ белка в 96 образцах менее чем за 30 мин.
Данные системы позволяют исследователям выполнять анализы, традиционно проводимые с помощью ИФА (иммуносорбентный ферментный анализ), ВЭЖХ или SPR (поверхностный плазмонный резонанс). Измерение образцов происходит параллельно, используются регенерируемые биодатчики без маркирующих веществ или микрофлюидных компонентов. Платформа состоит из 8- или 16-канальных инструментов, совместимых с 96- или 384-луночными планшетами. Они позволяют использовать меньшее количество захваченных молекул и снизить затраты на проводимые исследования. Системы Octet легко перемещаются, обеспечивая эффективную работу лаборатории.
С 2012 года семейство устройств дополняет удобная одноканальная система Pall-Fortebio-BLItz (рис.6) для обработки небольшого числа проб. Используя только маленькую каплю, она производит быстрый количественный и кинетический анализ белка, а также анализ аффинности взаимодействия протеина. Высокочувствительная система разработана для тех, кто работает с белками, а особенно для тех, кто проводит количественный анализ, отслеживает выделение или проводит инженерные исследования белка. Для определения требуется в 15–20 раз меньше образца по сравнению с безмаркерным SPR или ИФА с использованием микропланшета.
Все системы Fortebio применяют в режиме реального времени для проведения количественного анализа белка, определения аффинности и кинетического анализа в простом формате Drop-Read-Done (образец, анализ, результат). Они отличаются простотой в управлении, высокой скоростью и экономичностью. Устройства незаменимы на многих этапах исследования белка, например, при анализе хроматографических фракций, осуществлении контроля качества, при анализе экспрессии белка.
Платформа Pall-Fortebio благодаря производительности рабочего цикла позволяет легко и быстро составить характеристику нового кандидата в лекарственные препараты в области изыскания и разработок новых лекарственных веществ, в то время как занимающие много времени традиционные методики ограничены по пропускной способности проб и связаны с высокими затратами.
Безмаркерный
количественный анализ
Распространенные процедуры анализа при разработке и производстве антител – скрининг гибридомных супернатантов с помощью методик ИФА, иммуногистохимическое исследование или Вестерн-блот. Так, например, количественный анализ IgG человека в супернатантах единичной колонии Wells позволяет отобрать клеточные линии с наибольшей скоростью выработки антител. Такое определение концентрации, для которого ранее не было экономичной методики, можно выполнить с помощью быстрого двухминутного протокола Pall-Fortebio-Octet. Прибор с помощью специальных биодатчиков антител человека Fab-CH1, работающих по принципу Dip and Read (погружайте и читайте), и стандартного ряда IgG осуществляет количественный анализ. Все подтипы человеческого IgG распознаются, в то время как легкие цепи IgG или человеческий Fc-фрагмент тяжелой цепи не связываются.
Экспресс-анализ концентрации антител также является важным критерием при анализе хроматографических фракций, реагентов клеточных культур или факторов роста. До появления платформы Pall-Fortebio для определения концентрации антител была необходима аффинная очистка.
В зависимости от конкретного применения предлагаются разные биодатчики для количественного анализа IgG. Кроме датчиков для определения белка A, белка G и белка L, существуют разные модификации для анализа специфических белков человека и мыши. Кроме этого, многие наборы и методики позволяют определить антитела с низкой аффинностью (сродством) к лекарственным препаратам (ADA), остаточные белки клетки-хозяина (Host Cell Protein), а также остаточный белок A.
Количественный анализ индивидуальных аналитов возможен при иммобилизации пользователем отобранных им лигандов с помощью биодатчика стрептовидина (SA) или аминореактивного биодатчика (AR2G). Таким образом, протоколы ИФА можно заменить на более эффективные методы BLI для определения концентрации с помощью системы Pall-Fortebio. Необходимые в методиках ИФА частые этапы очистки в этом случае не требуются. Анализ позволяет получить более точный (вариационный коэффициент < 10%) и быстрый результат. Кроме этого, с помощью анализа Pall-Fortebio можно тестировать необработанные пробы при их минимальной подготовке.
Безмаркерный
кинетический анализ
Растущий спрос на высококачественные антитела с высокой специфичностью требует оптимизации традиционных гибридомных технологических процессов. Для такой оптимизации необходимы методы скрининга, более информативно на ранней стадии характеризирующие взаимодействие антител и антигенов. При этом использование методики ИФА как классического метода конечных точек дает ограниченную информацию, которая способствует идентификации антител с высокой аффинностью связывания. Кроме того, существует риск нежелательного связывания агентов-детекторов. Антитела с низкой аффинностью связывания к тому же могут удаляться в ходе необходимой очистки, что делает невозможным их определение с помощью ИФА.
В этом свете наиболее предпочтительным является безмаркерный скрининг, так как он позволяет получить детальные кинетические данные о взаимодействии антител и антигенов в режиме реального времени, обеспечивая достоверное определение аффинности связывания антитела для соответствующего антигена. В отличие от методик ИФА, которые дают только приблизительное значение констант аффинности (KD), безмаркерный скрининг позволяет определять константы аффинности и константы скорости ассоциации и диссоциации (ka, kd). Это важно, поскольку различным скоростям ассоциации и диссоциации может соответствовать одна и та же константа аффинности (см. рис.4). Кроме того, новую технологию с успехом можно использовать для отображения или биннинга эпитопов из образцов, не прошедших подготовку или очистку. Сравнительный анализ выявляет пары IgG, связывающиеся с одним и тем же эпитопом одного антигена (рис.7).
Заключение
В платформе Pall-Fortebio применяются системы без микрофлюидики, в которых биодатчики непосредственно погружают в образец и используют для высокоэффективного безмаркерного параллельного скрининга взаимодействия антител и целевых антигенов в сложных образцах, не прошедших специальную подготовку. Это снижает стоимость, а также затраты труда и времени, тем более что анализ осуществляется непосредственно в среде или лизате без предварительной очистки.
Отзывы читателей
