eng
Выпуск #1/2016
Ю.Стебунов, А.Арсенин
Новые перспективы для фармакологии – биосенсоры на основе оксида графена
Новые перспективы для фармакологии – биосенсоры на основе оксида графена
Просмотры: 4301
В последние годы безмаркерные биосенсоры на основе фотонных и плазмонных волноведущих систем существенно повлияли на процесс разработки лекарственных средств. С их помощью анализ взаимодействия кандидатов в лекарственное средство с различными мишенями позволяет получить данные об их эффективности и токсичности, а в перспективе заменит испытания лекарственных препаратов на людях и животных. Главное препятствие на пути полноценного внедрения сенсорных чипов в качестве аналитического инструмента в лаборатории биохимиков и фармацевтов – недостаточная чувствительность. Предложено решение проблемы – применение новых двумерных наноматериалов, таких как графен и его химические производные, обладающих уникальными физико-химическими свойствами. Представлены результаты первых исследований, обсуждается возможность многократного использования биосенсоров.
ВВЕДЕНИЕ
Безмаркерные биосенсоры позволяют исследовать взаимодействие различных биологически важных молекулярных объектов, таких как нуклеиновые кислоты, белки, включая антитела и мембранные белки, вирусы и бактерии [1]. В отличие от других биохимических методов, применяемых в фармакологии, нет необходимости использовать флуоресцентные или радиологические метки, что упрощает проведение исследований, а также снижает вероятность получения ошибочных данных из-за влияния меток на прохождение биомолекулярных реакций. Принцип действия значительной части безмаркерных биосенсоров основан на оптическом явлении поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (рис.1) [2]. Поверхностные плазмоны, то есть поверхностные электромагнитные волны, возникают на границе раздела металла и диэлектрика, причем условия возбуждения чрезвычайно чувствительны к оптическим свойствами среды вблизи металла. В результате этого возбуждения становится возможным в реальном времени наблюдать за проходящими на поверхности биохимическими реакциями, определяя с высокой точностью изменения показателя преломления этой среды.
Основная область применения биосенсоров на основе ППР – фармакологические исследования. Изучение кинетики реакций лиганда (кандидата в лекарственное средство) с различными мишенями позволяет получить данные о его фармакокинетических и фармакодинамических свойствах [3]. На данный момент биосенсоры на основе поверхностного плазмонного резонанса включены в регламенты по исследованию лекарственных препаратов европейской (European Medicines Agency) и американской (Food and Drug Administration) организаций, занимающихся надзором за качеством лекарственных средств [4–7]. Однако сегодня для полноценного внедрения безмаркерных биосенсоров в процесс разработки лекарств необходимо добиться увеличения чувствительности метода, так как с его помощью невозможно изучать взаимодействие крупных молекулярных мишеней с низкомолекулярными лигандами. Примером такого взаимодействия служит активация рецепторов, сопряженных с G-белками, которые являются мишенью для 40% выпускаемых на рынке лекарств.
Повысить эффективность биологических сенсоров можно с помощью двумерных наноматериалов (таких как графен и его производные) в детектирующих интерфейсах, предназначенных для связывания исследуемых мишеней с поверхностью биосенсора. Графен – аллотропная модификация углерода, состоящая из составленных в гексагональную двумерную решетку атомов углерода в состоянии sp2-гибридизации, что может быть использовано для иммобилизации биологических мишеней за счет стэкинг-взаимодействия [8]. Окисленная форма графена – оксид графена – содержит различные кислородсодержащие группы: эпоксидные, карбоксильные, гидроксильные и другие. Это позволяет осуществить ковалентную иммобилизацию исследуемых мишеней на его поверхность, а также делает оксид графена растворимым в воде и более удобным в использовании. Более того, оксид графена проще получать, а изменяя содержание функциональных групп при помощи термического, химического или сольвотермального восстановления, можно выбрать оптимальные для биодетектирования оптические свойства.
В работе рассмотрены запатентованные высокочувствительные биосенсорные чипы со связующим слоем, выполненным из оксида графена [9–10] (рис.2). Теоретически и экспериментально определены оптимальные условия для создания связующих слоев из оксида графена, а также изучены их оптические и структурные свойства. Чипы на основе оксида графена созданы с использованием водного раствора чешуек оксида графена, в котором содержание однослойных чешуек превышает 80% от общего их числа. Для оценки чувствительности биодетектирования с использованием связующих слоев из оксида графена, на его поверхность были иммобилизованы молекулы стрептавидина. В результате получен биосенсорный чип, избирательно взаимодействующий с соединениями, имеющими биотиновый остаток (рис.3). Стрептавидиновые биосенсорные чипы на основе гидрогельных связующих слоев предлагаются различными компаниями, производящими безмаркерные биосенсоры для анализа широкого класса биохимических взаимодействий. В данной работе при помощи чипов на основе стрептавидина и оксида графена была исследована реакция гибридизации ДНК. Чувствительность таких чипов по сравнению с чипами на основе графена и карбоксиметилированного декстрана выше. Также исследована возможность многократного использования предложенных биосенсорных чипов.
ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТОНКИХ ПЛЕНОК ОКСИДА ГРАФЕНА
Для исследования оптических и структурных свойств тонкую пленку из оксида графена напыляли на поверхность стеклянной подложки из водного раствора чешуек оксида графена. Для напыления использовали 0,78 мл раствора оксида графена концентрацией 0,5 мг/мл. Характерный диаметр чешуек 0,3–0,7 мкм, при этом содержание углерода – 79% и кислорода – 20%. На рис.4а представлена полученная с помощью атомно-силовой микроскопии топография поверхности пленки оксида графена. Анализ показал, что толщина пленки оксида графена равна 23 нм, а шероховатость поверхности составляет 4,7 нм. Далее пленку исследовали методом спектроскопической эллипсометрии, полученные значения действительной и мнимой части показателя преломления пленок, приведены на рис.4б. Измерения проводили при длине волны оптического излучения 635 нм, используемого в коммерческом биосенсоре BiOptix 104SA (BiOptix Diagnostics, США). Получено, что у пленок из оксида графена мнимая часть показателя преломления в шесть раз меньше, чем у графена. Это свидетельствует о меньшем поглощении энергии поверхностного плазмона связующим слоем и более высокой чувствительности биодетектирования.
Для исследования влияния тонких пленок оксида графена на эффективность возбуждения поверхностного плазмонного резонанса выполнено моделирование многослойной структуры, включающей в себя следующие слои: боросиликатное стекло с показателем преломления 1,723, золотую пленку толщиной 32 нм и пленку из оксида графена, толщина которой варьировалась в диапазоне 1–30 нм. Проведено сравнение оптических свойств связующих слоев из оксида графена с оптическими свойствами графена и карбоксиметилированного декстрана.
Чувствительность биосенсоров, в которых используется ППР, возбуждаемый по схеме Кретчмана, определяли по следующей формуле:
(1)
где P – резонансный угол, C – концентрация исследуемого вещества, Δn – соответствующее изменение показателя преломления вблизи поверхности чипа, которое в моделировании принято равным 0,005. При этом чувствительность разделяется на две составляющие: чувствительность к изменению показателя преломления SRI и эффективность E. При этом эффективность определяется свойствами детектирующей поверхности, типом детектируемых биологических объектов и пропорциональна количеству центров связывания на детектирующей поверхности E ~ NB.
На рис.4в показан сдвиг кривых поверхностного плазмонного резонанса при изменении показателя преломления детектируемой среды с 1,33 на 1,335, полученный для трех сенсорных чипов: золотого, покрытого монослойным графеном толщиной 0,34 нм и покрытого оксидом графена толщиной 1 нм, что соответствует одному слою. Согласно уравнению (1) сдвиг резонансного угла пропорционален чувствительности к изменению показателя преломления. На рис.4г показана чувствительность SRI для золотых сенсорных чипов, покрытых графеном и оксидом графена в зависимости от толщины углеродных слоев. При этом пунктиром показана чувствительность золотого чипа без покрытия SRI = 76,6°. Максимум чувствительности сенсорного чипа на основе графена наблюдается при толщине графена 7 нм и равен 101°, что на 32% выше чувствительности золотого чипа без покрытия. Для оксида графена получаем, соответственно, максимум SRI, равный 92° при толщине оксида графена 14 нм, что на 20% выше чувствительности чистого золотого сенсорного чипа. При этом чувствительность сенсорного чипа на графене быстро падает при толщине слоя выше 10 нм. Глубина проникновения поля поверхностного плазмона в раствор, определяющая область рядом с поверхностью сенсорного чипа, в которой детектируются явления биохимических взаимодействий, составляет 490 нм. Таким образом, использование оксида графена, у которого оптическое поглощение меньше, чем у графена, позволяет создавать связующие слои с большим числом центров связывания, и, следовательно, повысить эффективность биодетектирования и его чувствительность.
АНАЛИЗ БИОХИМИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ЧИПОВ
На основе чипов со связующими слоями из оксида графена создан протокол анализа биохимических взаимодействий, при котором один из объектов имеет биотиновый остаток. Для этого на поверхность сенсорного чипа, включающего связующий слой из оксида графена толщиной 8,8 нм, напыленный на поверхность золотой пленки толщиной 32 нм, был конформно и однородно иммобилизован слой молекул стрептавидина (SA). Для сравнительного анализа подготовлены образцы, в которых молекулы стрептавидина были закреплены на поверхности коммерческого сенсорного чипа, состоящей из слоя карбоксиметилированного декстрана толщиной 100 нм, а также на поверхность сенсорного золотого чипа с перенесенной при помощи полимерной матрицы пленкой однослойного графена [12]. Молекулы стрептавидина были иммобилизованы на полимерный чип при помощи процедуры аминосвязывания, приводящей к ковалентному взаимодействию. Для этого предварительно провели активацию карбоксильных групп карбоксиметилированного декстрана промыванием сенсорных чипов в проточной ячейке раствором 0,4 M 1-этил-3-
(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и 0,1 M N-гидроксисукцинимида (NHS) в буфере на основе 0,1 М 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты при рН 6,0. Не задействованные в иммобилизации стрептавидина карбоксильные группы были деактивированы 1 М раствором этаноламина (EA). Во всех экспериментах использовался проточный 0,1 М натрий-фосфатный буфер (PBS). На поверхность чипов со связующими слоями из оксида графена и монослойного графена молекулы SA иммобилизировали за счет стэкинг-взаимодействия.
Отклик биосенсора при адсорбции стрептавидина на поверхность карбоксиметилированного декстрана составил 1270 RU* (рис.5а). При адсорбции стрептавидина на поверхность однослойного графена в ходе четырех последовательных инжекций получены следующие изменения уровней сигнала: 500 RU, 220 RU, 120 RU и 140 RU, результирующее изменение сигнала биосенсора составило 980 RU (рис.5б). В свою очередь четыре последовательные инжекции раствора стрептавидина над поверхностью сенсорного чипа на основе связующего слоя из оксида графена привели к изменениям сигнала равным 160 RU, 840 RU, 400 RU и 350 RU соответственно (рис.5б). Результирующее изменение сигнала при иммобилизации стрептавидина на поверхность пленки из оксида графена – 3190 RU. Поскольку изменение сигнала биосенсора пропорционально числу адсорбированных молекул, которое, в свою очередь, пропорционально эффективности биодетектирования E, получаем, что эффективность сенсорного чипа на основе оксида графена в 2,5 раза выше, чем у коммерческого сенсорного чипа на основе карбоксиметилированного декстрана, и в 3,25 раз выше, чем у сенсорного чипа на основе однослойного графена. Согласно уравнению (1), чувствительность сенсорных чипов на основе оксида графена выше в 2,9 раза, чем у коммерческих чипов на основе карбоксиметилированного декстрана и в 3,7 раз, чем у чипов на основе однослойного графена.
Необходимое свойство биосенсора – специфичность по отношению к детектируемым веществам. Сенсорные чипы на основе оксида графена с иммобилизованным на его поверхность стрептавидином специфичны по отношению к биотинилированным биомолекулам. Для исследования специфичности над поверхностью сенсорного чипа на основе оксида графена и стрептавидина проведены три последовательные инжекции олигонуклеотидов D2, D1 и опять D2 (рис.5в). При этом только олигонуклео-тид D1 является биотинилированным, а олигонуклеотид D2 комплементарен к D1, и, следовательно, может вместе с ним участвовать в реакции гибридизации.
Одной из ключевых характеристик чипов является возможность их многократного использования, так как это значительно упрощает и ускоряет проведение исследований. В рассматриваемом протоколе анализа реакции гибридизации ДНК проводили регенерацию сенсорного чипа 20 мМ раствором гидроксида натрия (NaOH), инжекция которого разрушала водородные связи между комплементарными цепочками олигонуклеотидов. На рис.5г показана сенсограмма, иллюстрирующая три последовательных инжекции олигонуклеотида D2, сопровождаемого инжекцией регенерирующего раствора. Количество адсорбированных олигонуклеотидов в последовательных инжекциях характеризуется разностью сигналов на сенсограмме: 240 RU, 195 RU и 175 RU соответственно, что говорит о повторяемости откликов биосенсора в интервале 10–25%.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Использование тонких пленок из оксида графена в качестве связующих слоев для биосенсорных чипов позволяет повысить чувствительность биодетектирования по сравнению с коммерческими чипами на основе полимерных слоев. На примере исследования реакции гибридизации ДНК продемонстрирован трехкратный прирост чувствительности по сравнению с коммерческими сенсорными чипами на основе карбоксиметилированного декстрана. При этом чипы на основе оксида графена проявили свойства биоспецифичности по отношению к детектируемым соединениям и показали возможность их многократного использования.
Отметим высокую технологичность оксида графена для создания биосенсоров. Применение водного раствора чешуек графена упрощает и удешевляет процесс образования сенсорных чипов, что выгодно для массового производства. Кроме того, созданные сенсорные чипы совместимы с имеющимися коммерческими биосенсорами и для них подходят те же протоколы биодетектирования.
Применение наноструктурированных связующих слоев из оксида графена приводит к значительному увеличению площади поверхности, доступной для иммобилизации исследуемых биологических объектов. Это, в свою очередь, позволит достичь прироста чувствительности в десятки и сотни раз и сделает возможным фармакологические исследования лекарственных препаратов, основанных на низкомолекулярных соединениях. В последние годы открыты другие двумерные наноматериалы, такие как нитрид бора, дисуль-
фид вольфрама, дисульфид молибдена и другие. Они обладают отличными от углеродных наноматериалов оптическими и химическими свойствами и помогут создать оптимальные связующие слои для биосенсорных чипов.
В качестве примера низкомолекулярных соединений можно привести препараты, воздействующие на рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCR), которые на данный момент являются мишенью для 40% выпускаемых на рынке лекарств. Благодаря очевидным преимуществам, новые биосенсоры постепенно будут включены в регламенты доклинических исследований препаратов различных типов, вытеснив другие методы, используемые сегодня в фармакологических исследованиях. Разработка лекарств станет быстрее и дешевле, а возможность количественной оценки эффективности и токсичности при помощи биосенсоров позволит с необходимой точностью предсказывать возникновение побочных действий.
ЛИТЕРАТУРА
1.Fan X., White I.M., Shopova S.I., Zhu H., Suter J.D., Sun Y. Sensitive Optical Biosensors for Unlabeled Targets: A Review // Anal. Chim. Acta 2008, 620, 8–26.
2.Schasfoort R.B.M. and Tudos A.J. Handbook of Surface Plasmon Resonance: The Royal Society of Chemistry, Cambridge. 2008.
3.Cooper M.A. Optical biosensors in drug discvery // Nat. Rev. 2002, 1, 515–528.
4.FDA Guidance for Industry. Assay development for immunogenicity testing of therapeutic proteins. 2009.
5.FDA Guidance for Industry Quality Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Protein Product. 2012.
6.Guideline on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006, Jan 2007.
7.Guideline on immunogenicity assessment of monoclonal antibodies intended for in vivo clinical use. EMA/CHMP/BMWP/86289/2010, May 2012.
8.Morales-Narváez E., Merkoçi A. Graphene Oxide as an Optical Biosensing Platform // Adv. Mater. 2012, 24(25), 3298–3308.
9.Stebunov Y., Arsenin A. Biological Sensor and Method of Its Manufacture, RU Appl. No.: 2013107267; WO/2014/129933 International Application No. PCT/RU2013/001100 (Aug 2014), US Patent Application no. 2015/0301039.
10.Stebunov Y.V., Aftenieva O.A., Arsenin A.V., Volkov V.S. Highly sensitive and selective sensor chips with graphene-oxide linking layer // ACS Appl. Mat. Interfaces 2015, 7, 21727–21734.
11.Bruna M., Borini S. Optical Constants of Graphene Layers in the Visible Range // Appl. Phys. Lett. 2009, 94(3), 031901.
12.Li X., Zhu Y., Cai W., Borysiak M., Han B., Chen D., Piner R.D., Colombo L., Ruoff R.S. Transfer of Large-Area Graphene Films for High-Performance Transparent Conductive Electrodes // Nano Lett. 2009, 9, 4359–4363.
13.
* RU – resonance unit. Связывание одного пикограмма белка с поверхностью в 1 мм2 вызывает сдвиг в 1 RU на регистрируемой сенсограмме, что соответствует сдвигу угла, при котором наблюдается максимум плазмонного резонанса, на 0,0001° (Прим. ред.)
* ФГБНУ "Всероссийский Научно-исследовательский Институт Фитопатологии"
** АНО "Аналитика и Высокие Технологии"
Безмаркерные биосенсоры позволяют исследовать взаимодействие различных биологически важных молекулярных объектов, таких как нуклеиновые кислоты, белки, включая антитела и мембранные белки, вирусы и бактерии [1]. В отличие от других биохимических методов, применяемых в фармакологии, нет необходимости использовать флуоресцентные или радиологические метки, что упрощает проведение исследований, а также снижает вероятность получения ошибочных данных из-за влияния меток на прохождение биомолекулярных реакций. Принцип действия значительной части безмаркерных биосенсоров основан на оптическом явлении поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (рис.1) [2]. Поверхностные плазмоны, то есть поверхностные электромагнитные волны, возникают на границе раздела металла и диэлектрика, причем условия возбуждения чрезвычайно чувствительны к оптическим свойствами среды вблизи металла. В результате этого возбуждения становится возможным в реальном времени наблюдать за проходящими на поверхности биохимическими реакциями, определяя с высокой точностью изменения показателя преломления этой среды.
Основная область применения биосенсоров на основе ППР – фармакологические исследования. Изучение кинетики реакций лиганда (кандидата в лекарственное средство) с различными мишенями позволяет получить данные о его фармакокинетических и фармакодинамических свойствах [3]. На данный момент биосенсоры на основе поверхностного плазмонного резонанса включены в регламенты по исследованию лекарственных препаратов европейской (European Medicines Agency) и американской (Food and Drug Administration) организаций, занимающихся надзором за качеством лекарственных средств [4–7]. Однако сегодня для полноценного внедрения безмаркерных биосенсоров в процесс разработки лекарств необходимо добиться увеличения чувствительности метода, так как с его помощью невозможно изучать взаимодействие крупных молекулярных мишеней с низкомолекулярными лигандами. Примером такого взаимодействия служит активация рецепторов, сопряженных с G-белками, которые являются мишенью для 40% выпускаемых на рынке лекарств.
Повысить эффективность биологических сенсоров можно с помощью двумерных наноматериалов (таких как графен и его производные) в детектирующих интерфейсах, предназначенных для связывания исследуемых мишеней с поверхностью биосенсора. Графен – аллотропная модификация углерода, состоящая из составленных в гексагональную двумерную решетку атомов углерода в состоянии sp2-гибридизации, что может быть использовано для иммобилизации биологических мишеней за счет стэкинг-взаимодействия [8]. Окисленная форма графена – оксид графена – содержит различные кислородсодержащие группы: эпоксидные, карбоксильные, гидроксильные и другие. Это позволяет осуществить ковалентную иммобилизацию исследуемых мишеней на его поверхность, а также делает оксид графена растворимым в воде и более удобным в использовании. Более того, оксид графена проще получать, а изменяя содержание функциональных групп при помощи термического, химического или сольвотермального восстановления, можно выбрать оптимальные для биодетектирования оптические свойства.
В работе рассмотрены запатентованные высокочувствительные биосенсорные чипы со связующим слоем, выполненным из оксида графена [9–10] (рис.2). Теоретически и экспериментально определены оптимальные условия для создания связующих слоев из оксида графена, а также изучены их оптические и структурные свойства. Чипы на основе оксида графена созданы с использованием водного раствора чешуек оксида графена, в котором содержание однослойных чешуек превышает 80% от общего их числа. Для оценки чувствительности биодетектирования с использованием связующих слоев из оксида графена, на его поверхность были иммобилизованы молекулы стрептавидина. В результате получен биосенсорный чип, избирательно взаимодействующий с соединениями, имеющими биотиновый остаток (рис.3). Стрептавидиновые биосенсорные чипы на основе гидрогельных связующих слоев предлагаются различными компаниями, производящими безмаркерные биосенсоры для анализа широкого класса биохимических взаимодействий. В данной работе при помощи чипов на основе стрептавидина и оксида графена была исследована реакция гибридизации ДНК. Чувствительность таких чипов по сравнению с чипами на основе графена и карбоксиметилированного декстрана выше. Также исследована возможность многократного использования предложенных биосенсорных чипов.
ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТОНКИХ ПЛЕНОК ОКСИДА ГРАФЕНА
Для исследования оптических и структурных свойств тонкую пленку из оксида графена напыляли на поверхность стеклянной подложки из водного раствора чешуек оксида графена. Для напыления использовали 0,78 мл раствора оксида графена концентрацией 0,5 мг/мл. Характерный диаметр чешуек 0,3–0,7 мкм, при этом содержание углерода – 79% и кислорода – 20%. На рис.4а представлена полученная с помощью атомно-силовой микроскопии топография поверхности пленки оксида графена. Анализ показал, что толщина пленки оксида графена равна 23 нм, а шероховатость поверхности составляет 4,7 нм. Далее пленку исследовали методом спектроскопической эллипсометрии, полученные значения действительной и мнимой части показателя преломления пленок, приведены на рис.4б. Измерения проводили при длине волны оптического излучения 635 нм, используемого в коммерческом биосенсоре BiOptix 104SA (BiOptix Diagnostics, США). Получено, что у пленок из оксида графена мнимая часть показателя преломления в шесть раз меньше, чем у графена. Это свидетельствует о меньшем поглощении энергии поверхностного плазмона связующим слоем и более высокой чувствительности биодетектирования.
Для исследования влияния тонких пленок оксида графена на эффективность возбуждения поверхностного плазмонного резонанса выполнено моделирование многослойной структуры, включающей в себя следующие слои: боросиликатное стекло с показателем преломления 1,723, золотую пленку толщиной 32 нм и пленку из оксида графена, толщина которой варьировалась в диапазоне 1–30 нм. Проведено сравнение оптических свойств связующих слоев из оксида графена с оптическими свойствами графена и карбоксиметилированного декстрана.
Чувствительность биосенсоров, в которых используется ППР, возбуждаемый по схеме Кретчмана, определяли по следующей формуле:
(1)
где P – резонансный угол, C – концентрация исследуемого вещества, Δn – соответствующее изменение показателя преломления вблизи поверхности чипа, которое в моделировании принято равным 0,005. При этом чувствительность разделяется на две составляющие: чувствительность к изменению показателя преломления SRI и эффективность E. При этом эффективность определяется свойствами детектирующей поверхности, типом детектируемых биологических объектов и пропорциональна количеству центров связывания на детектирующей поверхности E ~ NB.
На рис.4в показан сдвиг кривых поверхностного плазмонного резонанса при изменении показателя преломления детектируемой среды с 1,33 на 1,335, полученный для трех сенсорных чипов: золотого, покрытого монослойным графеном толщиной 0,34 нм и покрытого оксидом графена толщиной 1 нм, что соответствует одному слою. Согласно уравнению (1) сдвиг резонансного угла пропорционален чувствительности к изменению показателя преломления. На рис.4г показана чувствительность SRI для золотых сенсорных чипов, покрытых графеном и оксидом графена в зависимости от толщины углеродных слоев. При этом пунктиром показана чувствительность золотого чипа без покрытия SRI = 76,6°. Максимум чувствительности сенсорного чипа на основе графена наблюдается при толщине графена 7 нм и равен 101°, что на 32% выше чувствительности золотого чипа без покрытия. Для оксида графена получаем, соответственно, максимум SRI, равный 92° при толщине оксида графена 14 нм, что на 20% выше чувствительности чистого золотого сенсорного чипа. При этом чувствительность сенсорного чипа на графене быстро падает при толщине слоя выше 10 нм. Глубина проникновения поля поверхностного плазмона в раствор, определяющая область рядом с поверхностью сенсорного чипа, в которой детектируются явления биохимических взаимодействий, составляет 490 нм. Таким образом, использование оксида графена, у которого оптическое поглощение меньше, чем у графена, позволяет создавать связующие слои с большим числом центров связывания, и, следовательно, повысить эффективность биодетектирования и его чувствительность.
АНАЛИЗ БИОХИМИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ЧИПОВ
На основе чипов со связующими слоями из оксида графена создан протокол анализа биохимических взаимодействий, при котором один из объектов имеет биотиновый остаток. Для этого на поверхность сенсорного чипа, включающего связующий слой из оксида графена толщиной 8,8 нм, напыленный на поверхность золотой пленки толщиной 32 нм, был конформно и однородно иммобилизован слой молекул стрептавидина (SA). Для сравнительного анализа подготовлены образцы, в которых молекулы стрептавидина были закреплены на поверхности коммерческого сенсорного чипа, состоящей из слоя карбоксиметилированного декстрана толщиной 100 нм, а также на поверхность сенсорного золотого чипа с перенесенной при помощи полимерной матрицы пленкой однослойного графена [12]. Молекулы стрептавидина были иммобилизованы на полимерный чип при помощи процедуры аминосвязывания, приводящей к ковалентному взаимодействию. Для этого предварительно провели активацию карбоксильных групп карбоксиметилированного декстрана промыванием сенсорных чипов в проточной ячейке раствором 0,4 M 1-этил-3-
(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и 0,1 M N-гидроксисукцинимида (NHS) в буфере на основе 0,1 М 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты при рН 6,0. Не задействованные в иммобилизации стрептавидина карбоксильные группы были деактивированы 1 М раствором этаноламина (EA). Во всех экспериментах использовался проточный 0,1 М натрий-фосфатный буфер (PBS). На поверхность чипов со связующими слоями из оксида графена и монослойного графена молекулы SA иммобилизировали за счет стэкинг-взаимодействия.
Отклик биосенсора при адсорбции стрептавидина на поверхность карбоксиметилированного декстрана составил 1270 RU* (рис.5а). При адсорбции стрептавидина на поверхность однослойного графена в ходе четырех последовательных инжекций получены следующие изменения уровней сигнала: 500 RU, 220 RU, 120 RU и 140 RU, результирующее изменение сигнала биосенсора составило 980 RU (рис.5б). В свою очередь четыре последовательные инжекции раствора стрептавидина над поверхностью сенсорного чипа на основе связующего слоя из оксида графена привели к изменениям сигнала равным 160 RU, 840 RU, 400 RU и 350 RU соответственно (рис.5б). Результирующее изменение сигнала при иммобилизации стрептавидина на поверхность пленки из оксида графена – 3190 RU. Поскольку изменение сигнала биосенсора пропорционально числу адсорбированных молекул, которое, в свою очередь, пропорционально эффективности биодетектирования E, получаем, что эффективность сенсорного чипа на основе оксида графена в 2,5 раза выше, чем у коммерческого сенсорного чипа на основе карбоксиметилированного декстрана, и в 3,25 раз выше, чем у сенсорного чипа на основе однослойного графена. Согласно уравнению (1), чувствительность сенсорных чипов на основе оксида графена выше в 2,9 раза, чем у коммерческих чипов на основе карбоксиметилированного декстрана и в 3,7 раз, чем у чипов на основе однослойного графена.
Необходимое свойство биосенсора – специфичность по отношению к детектируемым веществам. Сенсорные чипы на основе оксида графена с иммобилизованным на его поверхность стрептавидином специфичны по отношению к биотинилированным биомолекулам. Для исследования специфичности над поверхностью сенсорного чипа на основе оксида графена и стрептавидина проведены три последовательные инжекции олигонуклеотидов D2, D1 и опять D2 (рис.5в). При этом только олигонуклео-тид D1 является биотинилированным, а олигонуклеотид D2 комплементарен к D1, и, следовательно, может вместе с ним участвовать в реакции гибридизации.
Одной из ключевых характеристик чипов является возможность их многократного использования, так как это значительно упрощает и ускоряет проведение исследований. В рассматриваемом протоколе анализа реакции гибридизации ДНК проводили регенерацию сенсорного чипа 20 мМ раствором гидроксида натрия (NaOH), инжекция которого разрушала водородные связи между комплементарными цепочками олигонуклеотидов. На рис.5г показана сенсограмма, иллюстрирующая три последовательных инжекции олигонуклеотида D2, сопровождаемого инжекцией регенерирующего раствора. Количество адсорбированных олигонуклеотидов в последовательных инжекциях характеризуется разностью сигналов на сенсограмме: 240 RU, 195 RU и 175 RU соответственно, что говорит о повторяемости откликов биосенсора в интервале 10–25%.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Использование тонких пленок из оксида графена в качестве связующих слоев для биосенсорных чипов позволяет повысить чувствительность биодетектирования по сравнению с коммерческими чипами на основе полимерных слоев. На примере исследования реакции гибридизации ДНК продемонстрирован трехкратный прирост чувствительности по сравнению с коммерческими сенсорными чипами на основе карбоксиметилированного декстрана. При этом чипы на основе оксида графена проявили свойства биоспецифичности по отношению к детектируемым соединениям и показали возможность их многократного использования.
Отметим высокую технологичность оксида графена для создания биосенсоров. Применение водного раствора чешуек графена упрощает и удешевляет процесс образования сенсорных чипов, что выгодно для массового производства. Кроме того, созданные сенсорные чипы совместимы с имеющимися коммерческими биосенсорами и для них подходят те же протоколы биодетектирования.
Применение наноструктурированных связующих слоев из оксида графена приводит к значительному увеличению площади поверхности, доступной для иммобилизации исследуемых биологических объектов. Это, в свою очередь, позволит достичь прироста чувствительности в десятки и сотни раз и сделает возможным фармакологические исследования лекарственных препаратов, основанных на низкомолекулярных соединениях. В последние годы открыты другие двумерные наноматериалы, такие как нитрид бора, дисуль-
фид вольфрама, дисульфид молибдена и другие. Они обладают отличными от углеродных наноматериалов оптическими и химическими свойствами и помогут создать оптимальные связующие слои для биосенсорных чипов.
В качестве примера низкомолекулярных соединений можно привести препараты, воздействующие на рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCR), которые на данный момент являются мишенью для 40% выпускаемых на рынке лекарств. Благодаря очевидным преимуществам, новые биосенсоры постепенно будут включены в регламенты доклинических исследований препаратов различных типов, вытеснив другие методы, используемые сегодня в фармакологических исследованиях. Разработка лекарств станет быстрее и дешевле, а возможность количественной оценки эффективности и токсичности при помощи биосенсоров позволит с необходимой точностью предсказывать возникновение побочных действий.
ЛИТЕРАТУРА
1.Fan X., White I.M., Shopova S.I., Zhu H., Suter J.D., Sun Y. Sensitive Optical Biosensors for Unlabeled Targets: A Review // Anal. Chim. Acta 2008, 620, 8–26.
2.Schasfoort R.B.M. and Tudos A.J. Handbook of Surface Plasmon Resonance: The Royal Society of Chemistry, Cambridge. 2008.
3.Cooper M.A. Optical biosensors in drug discvery // Nat. Rev. 2002, 1, 515–528.
4.FDA Guidance for Industry. Assay development for immunogenicity testing of therapeutic proteins. 2009.
5.FDA Guidance for Industry Quality Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Protein Product. 2012.
6.Guideline on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006, Jan 2007.
7.Guideline on immunogenicity assessment of monoclonal antibodies intended for in vivo clinical use. EMA/CHMP/BMWP/86289/2010, May 2012.
8.Morales-Narváez E., Merkoçi A. Graphene Oxide as an Optical Biosensing Platform // Adv. Mater. 2012, 24(25), 3298–3308.
9.Stebunov Y., Arsenin A. Biological Sensor and Method of Its Manufacture, RU Appl. No.: 2013107267; WO/2014/129933 International Application No. PCT/RU2013/001100 (Aug 2014), US Patent Application no. 2015/0301039.
10.Stebunov Y.V., Aftenieva O.A., Arsenin A.V., Volkov V.S. Highly sensitive and selective sensor chips with graphene-oxide linking layer // ACS Appl. Mat. Interfaces 2015, 7, 21727–21734.
11.Bruna M., Borini S. Optical Constants of Graphene Layers in the Visible Range // Appl. Phys. Lett. 2009, 94(3), 031901.
12.Li X., Zhu Y., Cai W., Borysiak M., Han B., Chen D., Piner R.D., Colombo L., Ruoff R.S. Transfer of Large-Area Graphene Films for High-Performance Transparent Conductive Electrodes // Nano Lett. 2009, 9, 4359–4363.
13.
* RU – resonance unit. Связывание одного пикограмма белка с поверхностью в 1 мм2 вызывает сдвиг в 1 RU на регистрируемой сенсограмме, что соответствует сдвигу угла, при котором наблюдается максимум плазмонного резонанса, на 0,0001° (Прим. ред.)
* ФГБНУ "Всероссийский Научно-исследовательский Институт Фитопатологии"
** АНО "Аналитика и Высокие Технологии"
Отзывы читателей
