eng
Выпуск #3/2016
С.Ванг, Й.Ишии
Спектроскопия ЯМР твердого тела на ядрах 13С и 1H для исследования белков и других систем. применение сверхскоростного вращения образцов под магическим углом при частотах от 80–100 кГц и выше
Спектроскопия ЯМР твердого тела на ядрах 13С и 1H для исследования белков и других систем. применение сверхскоростного вращения образцов под магическим углом при частотах от 80–100 кГц и выше
Просмотры: 2151
Рассматриваются новые возможности для изучения белков методом твердотельного ЯМР при сверхскоростном вращении образцов под магическим углом с частотами от 80–100 кГц и выше в магнитных полях высокой напряженности. Продемонстрирована применимость метода для анализа структуры боковых цепей белков, взятых в наномольных количествах.
Теги: proteins studies solid-state nmr ultra-fast mas исследование белков сверхскоростное вращение образцов под магическим углом ямр твердого тела
ВВЕДЕНИЕ
Хотя ЯМР-спектроскопию в целом часто считают развитой областью науки, современные достижения в спектроскопии ТТЯМР высокого разрешения позволили кардинально расширить возможности этого метода. Впервые твердотельный ЯМР был реализован около 40 лет назад Шефером и Стейскалом для определения характеристик полимеров и других органических систем. В первых экспериментах использовалась схема КП-ВМУ с частотой вращения образцов 3 кГц [1]. В течение последних десяти лет доступные пределы частоты вращения резко возросли с 30 до более чем 100 кГц [2–6]. Это стало возможным благодаря совершенствованию оборудования для высокоскоростного ВМУ. Первоначально существовали методические проблемы, связанные с ограничением объема образцов (≤ 1 мкл) из-за малой величины диаметра ротора ВМУ (≤ 1 мм), однако успехи в разработке способов увеличения чувствительности позволили превратить ТТЯМР со сверхскоростным ВМУ с частотами от 80 кГц и выше в магнитном поле ультравысокой напряженности в практический инструмент структурной биологии. В числе используемых приемов – инверсное детектирование 1H [7–10], накопление данных в присутствии парамагнетика (РАСС) [4] и ряд других, включая мечение изотопами [11, 12]. С помощью этих методов были достигнуты параметры, позволяющие на практике анализировать белки методом 3D ТТЯМР.
Данное исследование демонстрирует, как при использовании ТТЯМР со сверхскоростным ВМУ видоизменяются основные элементы метода КП-ВМУ, такие как КП и 1H-развязка. Кроме того, по результатам, полученным при измерении 1H с кросс-поляризацией 13C для оценки распределения сигналов от боковых цепей белка, полностью стереоспецифически меченого дейтерием (SAIL*), показывается возможность применения твердотельного ЯМР для микроанализа белков.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
На рис.1 показаны три ротора для ВМУ диаметром 0,75 мм, 1 мм, 2,5 мм, которые использовались в данной работе. А для соотнесения их размеров и оценки объема образцов в экспериментах, описанных в данной статье, рядом помещена монета в один цент. Несмотря на то что наибольший из изображенных роторов и ранее применялся для сверхскоростного ВМУ при частоте около 30 кГц, легко понять первоначальный скепсис многих специалистов в области ЯМР-спектроскопии относительно целесообразности таких крошечных устройств для исследований белков методом многомерного ТТЯМР.
На рис.2 показано сравнение импульсных последовательностей для схемы КП-ВМУ при сверхскоростном ВМУ (а) и в стандартных условиях (б). В стандартной схеме (б) сигналы 13C регистрируются во время развязки от 1Н с высоким уровнем мощности после переноса поляризации от ядер 1Н к 13С посредством кросс-поляризации. Для ВЧ-развязки высокой мощности обычно требуется частота нутации протонов в пределах 60–100 кГц, которая превышает диапазон величин констант дипольного взаимодействия 1Н – 13С (10–40 кГц). В типовой схеме кросс-поляризации с линейно изменяющейся (или адиабатной) амплитудой [11, 12] напряженность ВЧ-поля развертывается таким образом, чтобы обеспечить соответствие условию
<νh> – <νC> = nνr, (1)
где <νh> и <νC> обозначают, соответственно, средние частоты нутации ВЧ-полей 1Н и 13С, νr представляет собой частоту вращения, а n = ±1 или ±2. Напротив, в импульсной последовательности для сверхскоростного ВМУ, показанной в (а), сигналы 13С получены в условиях развязки от 1Н с малым уровнем мощности при частотах около 10 кГц [3, 6, 8, 15], поскольку данный метод позволяет устранить значительную часть уширения линий, связанных с дипольным взаимодействием 13С – 1Н.
Поскольку тепло, генерируемое ВЧ-полем, пропорционально квадрату его напряженности, нагрев образца в данной схеме пренебрежимо мал по сравнению с тем, который имеет место при стандартной 1Н ВЧ-развязке высокой мощности. Кроме того, последовательность с развязкой низкой мощности также минимизирует опасность электрического пробоя в датчике, что было обычным явлением в экспериментах ТТЯМР. Но что еще более важно, схема с развязкой низкой мощности позволяет проводить эксперименты КП-ВМУ с высокой частотой повторения, которая соответствует малым значениям Т1 для 1Н некоторых белков, гидратированных или содержащих парамагнитные метки по схеме РАСС [4, 16]. При сверхскоростном ВМУ в стандартных условиях для кросс-поляризации, описываемых уравнением (1), требуется ВЧ-излучение очень высокой мощности, для которого значения νH и νC превышают 100 кГц. Поэтому в схеме (а) использовалась импульсная последовательность двуквантовой кросс-поляризации (DQ-КП) [3, 4], отвечающая выражению:
<νH> + <νC> = |n|νR. (2)
Выбор значения |n| = 1, как правило, обеспечивает более низкий уровень ВЧ-мощности, поскольку и νH, и νC меньше, чем νR. Несмотря на общепринятое мнение о трудностях КП при быстром ВМУ, эффективность кросс-поляризации по схеме DQ-КП при скоростях вращения 80–100 кГц оказывается сравнимой с полученной при вращении образцов под магическим углом в стандартных условиях [3, 12]. Однако следует тщательно подходить к настройке параметров КП, поскольку существуют различные условия, в которых она недостаточно эффективна. Например, при значениях вращательного резонанса <νH> ~ νR/2 за время контакта происходит быстрое гашение поляризации спина 1Н. Устранить подобные "ловушки" несложно – путем тщательной оптимизации при двумерном поиске максимальной эффективности КП по параметрам <νH> и <νC>. В настоящее время модифицированная схема КП-ВМУ с развязкой низкой мощности широко применяется в качестве стандартной импульсной последовательности для белков и других органических молекул в условиях сверхскоростного вращения образцов под магическим углом.
На рис.3 показан одномерный 13C КП-ВМУ спектр L-аланина, полностью меченого изотопами 13C и 15N (U-13C, 15N L-Ala). Здесь вариант (а) соответствует схеме с развязкой низкой мощности с использованием метода сверхскоростного вращения образца под магическим углом при частоте 100 кГц и в статическом поле В0 17,6 Тл (частота 1Н ЯМР составляет 750,1 МГц). Результаты были получены с использованием нового КП-ВМУ датчика JEOL с диаметром ротора 0,75 мм на спектрометре с частотой 750 МГц, установленном в Университете штата Иллинойс в Чикаго. В варианте (б) использовалась стандартная схема с ВМУ при частоте 20 кГц в поле В0 9,4 Тл (частота 1Н ЯМР составляет 400,2 МГц). Очевидно, что спектральное разрешение в варианте (а) выше, чем в (б), полученном в условиях развязки большой мощности в поле меньшей напряженности. Следует отметить, что развязка от протонов малой мощности при частоте около 10 кГц позволяет успешно устранить остаточные дипольные взаимодействия даже в поле высокой напряженности, как в случае (а), в то время как в варианте (б), полученном при помощи 1Н развязки высокой мощности при частоте 85 кГц, уширение все еще наблюдается.
Еще одним существенным различием между сверхскоростным и стандартным методами ВМУ является используемое количество образца. В первом случае при частоте вращения 80–100 кГц оно чисто технически ограничено массой менее 1 мг. В частности, в варианте (а) в ротор ВМУ диаметром 0,75 мм поместили только 0,3 мг U-13C, 15N L-аланина объемом 0,3 мкл, в то время как в варианте (б) ротор диаметром 2,5 мм был заполнен смесью 5,9 мг меченой аминокислоты и 5,9 мг адамантана. Несмотря на 20-кратную разницу в весе образца, чувствительность в варианте (а) составила приблизительно половину аналогичного показателя в (б). Следует отметить, что в обоих экспериментах (а и б) использовалось одинаковое число сканирований – 4, задержка перед повторением (3 с) и время регистрации (36 мс). Таким образом, чувствительность в пересчете на количество образца (удельная чувствительность) в варианте (а) оказалась приблизительно в 10 раз выше по сравнению с (б), который был получен на основе стандартного подхода в ТТЯМР, использующего пониженную напряженность поля. По предварительным оценкам подобный результат также отчасти обусловлен эффективностью схемотехники 0,75-мм датчика JEOL, что, в свою очередь, указывает на необходимость дальнейшего совершенствования этих устройств, предназначенных для исследования биологических молекул методами твердотельной ЯМР в поле ультравысокой напряженности.
Рассмотрим теперь пример применения 2D–3D ТТЯМР для микроанализа образца белка. Обычно его требуется порядка 0,3–1 мкмоль для исследования стандартным методом твердотельного ЯМР на ядрах 13С. В данном случае мы предприняли попытку повысить чувствительность за счет сочетания ТТЯМР на ядрах 1Н и метода SAIL. Такой подход первоначально применялся в ЯМР-спектроскопии растворов больших белков для подавления уширения линий, обусловленного геминальным 1Н–1Н дипольным и скалярным взаимодействиями. Это достигалось за счет того, что все СН2-группы в белке были замещены группами CHD, а группы СН3 – группами CHD2 [17]. В данной работе стереоселективное внедрение дейтериевой метки в SAIL-белках использовалось для увеличения разрешения по протонам и повышения чувствительности ТТЯМР со сверхскоростным ВМУ за счет эффективного устранения сильного геминального диполярного взаимодействия 1Н–1Н.
На рис.4а показан двумерный 1H / 13C корреляционный спектр химических сдвигов на ядрах 1Н, полученный методом твердотельного ЯМР для SAIL-убиквитина, в который был включен 7 SAIL L-изолейцин (Ile). Несмотря на ограниченное количество образца, которое составляло всего около 55 нмоль (около 0,5 мг), был получен спектр превосходного качества, причем на это потребовалось менее 5 мин. Ширина линии 1Н при использовании взвешивающей функции и без нее составила, соответственно, 0,14–0,25 м.д. и 0,10–0,22 м.д. Интересно, что улучшившееся спектральное разрешение химических сдвигов протонов позволило выделить отдельные сигналы в группе сигналов CHD2, которые не могут быть удовлетворительно разделены по шкале химических сдвигов 13С. Исходя из того, что с достигнутым уровнем чувствительности данный 2D ЯМР спектр высокого разрешения 55 нмоль белка был получен приблизительно за 5 мин, можно рассчитывать, что для аналогичного анализа ~ 10 нмоль этого вещества будет достаточно всего нескольких часов.
Для сопоставления на рис.4б представлен 2D 13C / 1H корреляционный спектр на ядрах 13С для аналогичного образца SAIL-убиквитина, полученный в ходе эксперимента той же длительности. По сравнению с двумерным спектром на ядрах 1Н (рис.4а), в данном случае чувствительность оказалась в 5,4–9,7 раз ниже при значительно худшем соотношении сигнал / шум. Это хорошо видно из сравнения сечений, соответствующих пикам, обозначенным стрелками (в-ж).
Также было установлено, что по сравнению с одномерной 13С КП-ВМУ (рис.4в) в 2D-спектре на ядрах 1Н (рис.4г, д) имеет место увеличение чувствительности в отношении к разрешенным сигналам 13CHD при 24,5 м.д. и 13CHD2 при 7,9 м.д. (оранжевые стрелки). Оно составило, соответственно, 2,1 и 5,0. По-видимому, это первая демонстрация того, что двумерный корреляционный спектр 1H / 13C на ядрах 1Н, полученный методом ТТЯМР образца белка, гораздо более чувствителен, чем прямое одномерное детектирование 13С. Иначе говоря, ни в одном из проведенных ранее исследований не было установлено, что метод непрямого детектирования 1Н по сравнению со стандартным прямым детектированием 13С имеет преимущество, состоящее в одновременном повышении чувствительности и разрешения.
Приведенные выше результаты также свидетельствуют о том, что большинство стандартных спектров 2D и 3D ТТЯМР, полученных на ядрах 13С и содержащих сигналы боковых цепей, могут со значительным увеличением разрешения и чувствительности быть заменены, соответственно, 3D- и 4D-спектрами твердотельного ЯМР на ядрах 1Н. Подтверждением этого является то, что для данного образца убиквитина 3D 1H/13C/13C корреляционный спектр химических сдвигов может быть зарегистрирован в течение 2,5 ч с близким к полному разделением сигналов остатка 7 L-изолейцина (Ile) [12]. Соответственно, для 10 нмоль этого белка (~ 90 мкг) разделение сигналов боковой цепи при 3D ТТЯМР является достижимым в течение приблизительно трех дней.
Отдельно хотелось бы подчеркнуть важность оптимизации конструкции датчиков и ее эффективность. На рис.5 показан двумерный корреляционный спектр 1H/13C для того же самого образца SAIL-убиквитина. Он был получен в статическом магнитном поле 18,8 Тл (частота 1Н ЯМР составляет 800 МГц) с помощью 1-мм ротора, принадлежащего к первому поколению датчиков КП-ВМУ с двойным резонансом. На тот момент компания JEOL не осознавала критичность контроля температуры при сверхскоростном ВМУ. Поэтому группа специалистов Иллинойского университета в Чикаго спроектировала температурный регулятор, закрепляемый на верхней части магнита и поддерживающий температурный режим. Полученные величины соотношения сигнал / шум и разрешения были сравнимы с аналогичными показателями представленными на рис.4а, но при этом значительно увеличилось время эксперимента (до ~ 50 мин). По результатам испытаний был разработан новый 1-мм датчик с четырехкратным резонансом, который использовался для получения спектров, показанных на рис.3. Группа разработчиков датчика JEOL значительно улучшила в нем эффективность 1Н ВЧ-канала, а также оснастила специальным встроенным в датчик воздушным каналом для контроля температуры и 2Н-каналом для 2Н развязки.
На рис.6 показано сравнение спектров 13С КП-ВМУ алифатического участка для SAIL L-изолейцина с 2Н развязкой (а) и без нее (б). Очевидно, что чувствительность и разрешение сигналов CDH и CD2H значительно улучшены 2Н развязкой. На основе успешного применения 1-мм датчика с четырехкратным резонансом был разработан аналогичный, диаметром 0,75 мм, который также использовался для получения спектров на рис.3. Ожидается, что дальнейшее совершенствование конструкции датчика, оснащенного микрокатушкой и модулем сверхскоростного ВМУ, приведет к 2–3-кратному увеличению удельной чувствительности по сравнению с текущими показателями. В течение нескольких следующих лет также потребуется приложить серьезные усилия по разработке датчиков для ТТЯМР в поле сверхвысокой напряженности при частоте 1Н-ЯМР более 1 ГГц.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Сравнение спектра 13C КП-ВМУ для L-аланина, полностью меченного изотопами 13C и 15N, проводилось по схеме развязки низкой мощности с ВМУ с частотой 100 кГц в статическом поле 17,6 Тл (рис.3а) и по схеме с использованием развязки высокой мощности с ВМУ при частоте 20 кГц в поле с 9,4 Тл (рис.3б). Данные в варианте (а) были получены при помощи нового 0,75-мм датчика JEOL для КП-ВМУ с четырехкратным резонансом, а в варианте (б) – при помощи модифицированного 2,5-мм датчика для КП-ВМУ с тройным резонансом и ротором Varian 2,5 мм. В варианте (а) сигналы 13C сформированы с помощью адиабатической последовательности двуквантовой кросс-поляризации, в которой напряженность ВЧ-поля для 1Н была установлена на уровне около 25 кГц, в то время как напряженность ВЧ-поля для 13С линейно изменялась от 55 до 95 кГц. Сигналы 13С были получены при помощи 1Н развязки низкой мощности SPINAL-64 при частоте 10 кГц. В варианте (б) сигналы 13C формировались с помощью адиабатической последовательности КП, в которой напряженность ВЧ-поля для 1Н была установлена на уровне около 75 кГц, в то время как напряженность ВЧ-поля для 13С линейно изменялась от 40 до 70 кГц. Сигналы 1Н развязки высокой мощности были получены методом двух импульсов с фазовой модуляцией (ТРРМ) при частоте 85 кГц. Спектр обрабатывался без использования каких-либо взвешивающих функций. Количество образца составляло в варианте (а) – 0,3 мг, в варианте (б) – 5,9 мг в смеси с 5,9 мг адамантана.
Сравнение двумерного спектра 13C / 1H на ядрах 1Н, двумерного спектра 13C / 1H на ядрах 13С и одномерного спектра 13С КП-ВМУ для ~ 5 мг микрокристаллического образца SAIL-убиквитина проводили при частоте вращения 80 кГц. Данные были получены с помощью 1-мм датчика JEOL с четырехкратным резонансом при частоте 750 МГц. Все спектры были обработаны при помощи синусоидальных взвешивающих функций со сдвигом 45° и 60° для 1Н и 13С соответственно. При отсутствии взвешивающих функций ширина линии 1Н и 13С составила 0,10–0,22 м.д. и 0,66–0,94 м.д. соответственно. Каждый спектр записывали в течение приблизительно 5 мин. Импульсные последовательности, использованные для записи спектров, и параметры преобразования данных взяты из работы [12].
Запись двумерного спектра 13C/1H на ядрах 1Н образца SAIL-убиквитина (~ 0,5 мг) с использованием 1-мм датчика первого поколения для КП-ВМУ с двойным резонансом при частоте ВМУ 80 кГц сделана на ЯМР-спектрометре с частотой 800 МГц. Условия проведения эксперимента аналогичны описанным выше, за исключением длительности эксперимента (около 50 мин) и отсутствия 2Н развязки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Основой для существенного расширения информативности и применимости ТТЯМР в исследованиях биомолекул является совершенствование конструкции приборов и развитие методов, позволяющих достичь значительно более высоких значений чувствительности и разрешения. В данной работе мы продемонстрировали 10-кратное увеличение чувствительности в 2D–3D экспериментах на ядрах 1Н по сравнению с аналогичными на ядрах 13С. Такой результат был получен за счет комплексного применения детектирования 1Н, схемы SAIL и сверхскоростного ВМУ с частотой 80 кГц. Не менее важным выводом также является то, что было ясно показано преимущество инверсного детектирования 1Н в сравнении со стандартным методом прямого детектирования 13С. Благодаря этому впервые удалось одновременно повысить и чувствительность, и разрешение ТТЯМР до уровня, с которого становится реальным переход к анализу белков, взятых в наномолярных и субнаномолярных количествах, путем использования, в частности, парамагнитных меток [4, 18], модифицированных схем переноса поляризации [19], а также неоднородных образцов [20]. Так в наших недавних исследованиях достигнутый предел чувствительности в микроанализе структуры белка GB1 уже составил 1 нмоль [21].
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают благодарность д-ру С.Партасарати (S.Parthasarathy) из Иллинойского университета в Чикаго за его вклад в данную работу. Также мы благодарны д-рам Й.Эндо (Y.Endo), Т.Немото (T.Nemoto), Й.Нишияма (Y.Nishiyama) и Й.Ишии (Y.Ishii) из компании JEOL Resonance за их усилия в разработке 1-мм и 0,75-мм датчиков КП-ВМУ, использовавшихся в данном исследовании. Образец SAIL убиквитина был предоставлен проф. М.Каиношо (M.Kainosho) из университета Tokyo Metropolitan. Основная поддержка данного исследования была оказана Национальным научным фондом США (U.S. National Science Foundation) (CHE 957793 и CHE 1310363), а также программой Dreyfus Foundation Teacher-Scholar Award для Йошитака Ишии. Приборное оборудование для 750 МГц ЯМР-спектроскопии твердых тел в Иллинойском университете в Чикаго приобретено при поддержке гранта NIH HEI (1S10 RR025105).
ЛИТЕРАТУРА
1.Schaefer J., Stejskal, E.O. – J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 1031.
2.Nishiyama Y. et al. – J. Magn. Reson., 2011, 208, 44.
3.Parathasarathy S., Nishiyama Y., Ishii Y. – Acc. Chem. Res., 2013, 46, 2127.
4.Wickramasinghe N.P. et al. – Nature Methods 2009, 6, 215.
5.Laage S., Sachleben J.R., Steuernagel S., Pierattelli R., Pintacuda G., Emsley L. – J. Magn. Reson., 2009, 196, 133.
6.Ernst M., Meier M.A., Tuherm T., Samoson A., Meier B.H. – J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 4764.
7.Ishii Y., Tycko R. – J. Magn. Reson., 2000, 142, 199.
8.Ishii Y., Yesinowski J.P., Tycko R. – J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 2921.
9.Zhou D.H., Shah G., Cormos M., Mullen C., Sandoz D., Rienstra C.M. – J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 11791.
10.Marchetti A. et al. – Angew. Chem. Int. Edit. 2012, 51, 10756.
11.Chevelkov V., Rehbein K., Diehl A., Reif B. – Angew. Chem. Int. Edit., 2006, 45, 3878.
12.Wang S. et al. – Plos One, 2015, 10, e0122714.
13.Metz G., Wu X., Smith S.O. – J. Magn. Reson., 1994, 110, 219.
14.Hediger S., Meier B.H., Ernst R.R. – Chem. Phys. Lett., 1995, 240, 449.
15.Kotecha M., Wickramasinghe N.P., Ishii Y. – Magn. Reson. Chem., 2007, 45, S221.
16.Wickramasinghe N.P., Kotecha M., Samoson A., Past J., Ishii Y. – J. Magn. Reson., 2007, 184, 350.
17.Kainosho M., Torizawa T., Iwashita Y., Terauchi T., Ono A.M., Guntert P. – Nature, 2006, 440, 52.
18.Nadaud P.S., Helmus J.J., Sengupta I., Jaroniec C.P. – J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 9561.
19.Althaus S.M., Mao K., Stringer J.A., Kobayashi T., Pruski M. – Solid State Nucl. Magn. Reson., 2014, 57–58, 17.
20.Suiter C.L. et al. – J. Biomol. NMR, 2014, 59, 57.
21.Wickramasinghe A., Wang S., Matsuda I., Nishiyama Y., Nemoto T., Endo Y., Ishii Y. – Solid State Nucl. Magn. Reson., 2015, в печати: http://dx.doi.org/10.1016/j.ssnmr.2015.10.002i.
* Stereo-array-isotope labeled.
* Solid-state NMR (SSNMR).
** Magic-angle spinning (MAS).
*** Cross-polarization MAS (CP-MAS).
Хотя ЯМР-спектроскопию в целом часто считают развитой областью науки, современные достижения в спектроскопии ТТЯМР высокого разрешения позволили кардинально расширить возможности этого метода. Впервые твердотельный ЯМР был реализован около 40 лет назад Шефером и Стейскалом для определения характеристик полимеров и других органических систем. В первых экспериментах использовалась схема КП-ВМУ с частотой вращения образцов 3 кГц [1]. В течение последних десяти лет доступные пределы частоты вращения резко возросли с 30 до более чем 100 кГц [2–6]. Это стало возможным благодаря совершенствованию оборудования для высокоскоростного ВМУ. Первоначально существовали методические проблемы, связанные с ограничением объема образцов (≤ 1 мкл) из-за малой величины диаметра ротора ВМУ (≤ 1 мм), однако успехи в разработке способов увеличения чувствительности позволили превратить ТТЯМР со сверхскоростным ВМУ с частотами от 80 кГц и выше в магнитном поле ультравысокой напряженности в практический инструмент структурной биологии. В числе используемых приемов – инверсное детектирование 1H [7–10], накопление данных в присутствии парамагнетика (РАСС) [4] и ряд других, включая мечение изотопами [11, 12]. С помощью этих методов были достигнуты параметры, позволяющие на практике анализировать белки методом 3D ТТЯМР.
Данное исследование демонстрирует, как при использовании ТТЯМР со сверхскоростным ВМУ видоизменяются основные элементы метода КП-ВМУ, такие как КП и 1H-развязка. Кроме того, по результатам, полученным при измерении 1H с кросс-поляризацией 13C для оценки распределения сигналов от боковых цепей белка, полностью стереоспецифически меченого дейтерием (SAIL*), показывается возможность применения твердотельного ЯМР для микроанализа белков.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
На рис.1 показаны три ротора для ВМУ диаметром 0,75 мм, 1 мм, 2,5 мм, которые использовались в данной работе. А для соотнесения их размеров и оценки объема образцов в экспериментах, описанных в данной статье, рядом помещена монета в один цент. Несмотря на то что наибольший из изображенных роторов и ранее применялся для сверхскоростного ВМУ при частоте около 30 кГц, легко понять первоначальный скепсис многих специалистов в области ЯМР-спектроскопии относительно целесообразности таких крошечных устройств для исследований белков методом многомерного ТТЯМР.
На рис.2 показано сравнение импульсных последовательностей для схемы КП-ВМУ при сверхскоростном ВМУ (а) и в стандартных условиях (б). В стандартной схеме (б) сигналы 13C регистрируются во время развязки от 1Н с высоким уровнем мощности после переноса поляризации от ядер 1Н к 13С посредством кросс-поляризации. Для ВЧ-развязки высокой мощности обычно требуется частота нутации протонов в пределах 60–100 кГц, которая превышает диапазон величин констант дипольного взаимодействия 1Н – 13С (10–40 кГц). В типовой схеме кросс-поляризации с линейно изменяющейся (или адиабатной) амплитудой [11, 12] напряженность ВЧ-поля развертывается таким образом, чтобы обеспечить соответствие условию
<νh> – <νC> = nνr, (1)
где <νh> и <νC> обозначают, соответственно, средние частоты нутации ВЧ-полей 1Н и 13С, νr представляет собой частоту вращения, а n = ±1 или ±2. Напротив, в импульсной последовательности для сверхскоростного ВМУ, показанной в (а), сигналы 13С получены в условиях развязки от 1Н с малым уровнем мощности при частотах около 10 кГц [3, 6, 8, 15], поскольку данный метод позволяет устранить значительную часть уширения линий, связанных с дипольным взаимодействием 13С – 1Н.
Поскольку тепло, генерируемое ВЧ-полем, пропорционально квадрату его напряженности, нагрев образца в данной схеме пренебрежимо мал по сравнению с тем, который имеет место при стандартной 1Н ВЧ-развязке высокой мощности. Кроме того, последовательность с развязкой низкой мощности также минимизирует опасность электрического пробоя в датчике, что было обычным явлением в экспериментах ТТЯМР. Но что еще более важно, схема с развязкой низкой мощности позволяет проводить эксперименты КП-ВМУ с высокой частотой повторения, которая соответствует малым значениям Т1 для 1Н некоторых белков, гидратированных или содержащих парамагнитные метки по схеме РАСС [4, 16]. При сверхскоростном ВМУ в стандартных условиях для кросс-поляризации, описываемых уравнением (1), требуется ВЧ-излучение очень высокой мощности, для которого значения νH и νC превышают 100 кГц. Поэтому в схеме (а) использовалась импульсная последовательность двуквантовой кросс-поляризации (DQ-КП) [3, 4], отвечающая выражению:
<νH> + <νC> = |n|νR. (2)
Выбор значения |n| = 1, как правило, обеспечивает более низкий уровень ВЧ-мощности, поскольку и νH, и νC меньше, чем νR. Несмотря на общепринятое мнение о трудностях КП при быстром ВМУ, эффективность кросс-поляризации по схеме DQ-КП при скоростях вращения 80–100 кГц оказывается сравнимой с полученной при вращении образцов под магическим углом в стандартных условиях [3, 12]. Однако следует тщательно подходить к настройке параметров КП, поскольку существуют различные условия, в которых она недостаточно эффективна. Например, при значениях вращательного резонанса <νH> ~ νR/2 за время контакта происходит быстрое гашение поляризации спина 1Н. Устранить подобные "ловушки" несложно – путем тщательной оптимизации при двумерном поиске максимальной эффективности КП по параметрам <νH> и <νC>. В настоящее время модифицированная схема КП-ВМУ с развязкой низкой мощности широко применяется в качестве стандартной импульсной последовательности для белков и других органических молекул в условиях сверхскоростного вращения образцов под магическим углом.
На рис.3 показан одномерный 13C КП-ВМУ спектр L-аланина, полностью меченого изотопами 13C и 15N (U-13C, 15N L-Ala). Здесь вариант (а) соответствует схеме с развязкой низкой мощности с использованием метода сверхскоростного вращения образца под магическим углом при частоте 100 кГц и в статическом поле В0 17,6 Тл (частота 1Н ЯМР составляет 750,1 МГц). Результаты были получены с использованием нового КП-ВМУ датчика JEOL с диаметром ротора 0,75 мм на спектрометре с частотой 750 МГц, установленном в Университете штата Иллинойс в Чикаго. В варианте (б) использовалась стандартная схема с ВМУ при частоте 20 кГц в поле В0 9,4 Тл (частота 1Н ЯМР составляет 400,2 МГц). Очевидно, что спектральное разрешение в варианте (а) выше, чем в (б), полученном в условиях развязки большой мощности в поле меньшей напряженности. Следует отметить, что развязка от протонов малой мощности при частоте около 10 кГц позволяет успешно устранить остаточные дипольные взаимодействия даже в поле высокой напряженности, как в случае (а), в то время как в варианте (б), полученном при помощи 1Н развязки высокой мощности при частоте 85 кГц, уширение все еще наблюдается.
Еще одним существенным различием между сверхскоростным и стандартным методами ВМУ является используемое количество образца. В первом случае при частоте вращения 80–100 кГц оно чисто технически ограничено массой менее 1 мг. В частности, в варианте (а) в ротор ВМУ диаметром 0,75 мм поместили только 0,3 мг U-13C, 15N L-аланина объемом 0,3 мкл, в то время как в варианте (б) ротор диаметром 2,5 мм был заполнен смесью 5,9 мг меченой аминокислоты и 5,9 мг адамантана. Несмотря на 20-кратную разницу в весе образца, чувствительность в варианте (а) составила приблизительно половину аналогичного показателя в (б). Следует отметить, что в обоих экспериментах (а и б) использовалось одинаковое число сканирований – 4, задержка перед повторением (3 с) и время регистрации (36 мс). Таким образом, чувствительность в пересчете на количество образца (удельная чувствительность) в варианте (а) оказалась приблизительно в 10 раз выше по сравнению с (б), который был получен на основе стандартного подхода в ТТЯМР, использующего пониженную напряженность поля. По предварительным оценкам подобный результат также отчасти обусловлен эффективностью схемотехники 0,75-мм датчика JEOL, что, в свою очередь, указывает на необходимость дальнейшего совершенствования этих устройств, предназначенных для исследования биологических молекул методами твердотельной ЯМР в поле ультравысокой напряженности.
Рассмотрим теперь пример применения 2D–3D ТТЯМР для микроанализа образца белка. Обычно его требуется порядка 0,3–1 мкмоль для исследования стандартным методом твердотельного ЯМР на ядрах 13С. В данном случае мы предприняли попытку повысить чувствительность за счет сочетания ТТЯМР на ядрах 1Н и метода SAIL. Такой подход первоначально применялся в ЯМР-спектроскопии растворов больших белков для подавления уширения линий, обусловленного геминальным 1Н–1Н дипольным и скалярным взаимодействиями. Это достигалось за счет того, что все СН2-группы в белке были замещены группами CHD, а группы СН3 – группами CHD2 [17]. В данной работе стереоселективное внедрение дейтериевой метки в SAIL-белках использовалось для увеличения разрешения по протонам и повышения чувствительности ТТЯМР со сверхскоростным ВМУ за счет эффективного устранения сильного геминального диполярного взаимодействия 1Н–1Н.
На рис.4а показан двумерный 1H / 13C корреляционный спектр химических сдвигов на ядрах 1Н, полученный методом твердотельного ЯМР для SAIL-убиквитина, в который был включен 7 SAIL L-изолейцин (Ile). Несмотря на ограниченное количество образца, которое составляло всего около 55 нмоль (около 0,5 мг), был получен спектр превосходного качества, причем на это потребовалось менее 5 мин. Ширина линии 1Н при использовании взвешивающей функции и без нее составила, соответственно, 0,14–0,25 м.д. и 0,10–0,22 м.д. Интересно, что улучшившееся спектральное разрешение химических сдвигов протонов позволило выделить отдельные сигналы в группе сигналов CHD2, которые не могут быть удовлетворительно разделены по шкале химических сдвигов 13С. Исходя из того, что с достигнутым уровнем чувствительности данный 2D ЯМР спектр высокого разрешения 55 нмоль белка был получен приблизительно за 5 мин, можно рассчитывать, что для аналогичного анализа ~ 10 нмоль этого вещества будет достаточно всего нескольких часов.
Для сопоставления на рис.4б представлен 2D 13C / 1H корреляционный спектр на ядрах 13С для аналогичного образца SAIL-убиквитина, полученный в ходе эксперимента той же длительности. По сравнению с двумерным спектром на ядрах 1Н (рис.4а), в данном случае чувствительность оказалась в 5,4–9,7 раз ниже при значительно худшем соотношении сигнал / шум. Это хорошо видно из сравнения сечений, соответствующих пикам, обозначенным стрелками (в-ж).
Также было установлено, что по сравнению с одномерной 13С КП-ВМУ (рис.4в) в 2D-спектре на ядрах 1Н (рис.4г, д) имеет место увеличение чувствительности в отношении к разрешенным сигналам 13CHD при 24,5 м.д. и 13CHD2 при 7,9 м.д. (оранжевые стрелки). Оно составило, соответственно, 2,1 и 5,0. По-видимому, это первая демонстрация того, что двумерный корреляционный спектр 1H / 13C на ядрах 1Н, полученный методом ТТЯМР образца белка, гораздо более чувствителен, чем прямое одномерное детектирование 13С. Иначе говоря, ни в одном из проведенных ранее исследований не было установлено, что метод непрямого детектирования 1Н по сравнению со стандартным прямым детектированием 13С имеет преимущество, состоящее в одновременном повышении чувствительности и разрешения.
Приведенные выше результаты также свидетельствуют о том, что большинство стандартных спектров 2D и 3D ТТЯМР, полученных на ядрах 13С и содержащих сигналы боковых цепей, могут со значительным увеличением разрешения и чувствительности быть заменены, соответственно, 3D- и 4D-спектрами твердотельного ЯМР на ядрах 1Н. Подтверждением этого является то, что для данного образца убиквитина 3D 1H/13C/13C корреляционный спектр химических сдвигов может быть зарегистрирован в течение 2,5 ч с близким к полному разделением сигналов остатка 7 L-изолейцина (Ile) [12]. Соответственно, для 10 нмоль этого белка (~ 90 мкг) разделение сигналов боковой цепи при 3D ТТЯМР является достижимым в течение приблизительно трех дней.
Отдельно хотелось бы подчеркнуть важность оптимизации конструкции датчиков и ее эффективность. На рис.5 показан двумерный корреляционный спектр 1H/13C для того же самого образца SAIL-убиквитина. Он был получен в статическом магнитном поле 18,8 Тл (частота 1Н ЯМР составляет 800 МГц) с помощью 1-мм ротора, принадлежащего к первому поколению датчиков КП-ВМУ с двойным резонансом. На тот момент компания JEOL не осознавала критичность контроля температуры при сверхскоростном ВМУ. Поэтому группа специалистов Иллинойского университета в Чикаго спроектировала температурный регулятор, закрепляемый на верхней части магнита и поддерживающий температурный режим. Полученные величины соотношения сигнал / шум и разрешения были сравнимы с аналогичными показателями представленными на рис.4а, но при этом значительно увеличилось время эксперимента (до ~ 50 мин). По результатам испытаний был разработан новый 1-мм датчик с четырехкратным резонансом, который использовался для получения спектров, показанных на рис.3. Группа разработчиков датчика JEOL значительно улучшила в нем эффективность 1Н ВЧ-канала, а также оснастила специальным встроенным в датчик воздушным каналом для контроля температуры и 2Н-каналом для 2Н развязки.
На рис.6 показано сравнение спектров 13С КП-ВМУ алифатического участка для SAIL L-изолейцина с 2Н развязкой (а) и без нее (б). Очевидно, что чувствительность и разрешение сигналов CDH и CD2H значительно улучшены 2Н развязкой. На основе успешного применения 1-мм датчика с четырехкратным резонансом был разработан аналогичный, диаметром 0,75 мм, который также использовался для получения спектров на рис.3. Ожидается, что дальнейшее совершенствование конструкции датчика, оснащенного микрокатушкой и модулем сверхскоростного ВМУ, приведет к 2–3-кратному увеличению удельной чувствительности по сравнению с текущими показателями. В течение нескольких следующих лет также потребуется приложить серьезные усилия по разработке датчиков для ТТЯМР в поле сверхвысокой напряженности при частоте 1Н-ЯМР более 1 ГГц.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Сравнение спектра 13C КП-ВМУ для L-аланина, полностью меченного изотопами 13C и 15N, проводилось по схеме развязки низкой мощности с ВМУ с частотой 100 кГц в статическом поле 17,6 Тл (рис.3а) и по схеме с использованием развязки высокой мощности с ВМУ при частоте 20 кГц в поле с 9,4 Тл (рис.3б). Данные в варианте (а) были получены при помощи нового 0,75-мм датчика JEOL для КП-ВМУ с четырехкратным резонансом, а в варианте (б) – при помощи модифицированного 2,5-мм датчика для КП-ВМУ с тройным резонансом и ротором Varian 2,5 мм. В варианте (а) сигналы 13C сформированы с помощью адиабатической последовательности двуквантовой кросс-поляризации, в которой напряженность ВЧ-поля для 1Н была установлена на уровне около 25 кГц, в то время как напряженность ВЧ-поля для 13С линейно изменялась от 55 до 95 кГц. Сигналы 13С были получены при помощи 1Н развязки низкой мощности SPINAL-64 при частоте 10 кГц. В варианте (б) сигналы 13C формировались с помощью адиабатической последовательности КП, в которой напряженность ВЧ-поля для 1Н была установлена на уровне около 75 кГц, в то время как напряженность ВЧ-поля для 13С линейно изменялась от 40 до 70 кГц. Сигналы 1Н развязки высокой мощности были получены методом двух импульсов с фазовой модуляцией (ТРРМ) при частоте 85 кГц. Спектр обрабатывался без использования каких-либо взвешивающих функций. Количество образца составляло в варианте (а) – 0,3 мг, в варианте (б) – 5,9 мг в смеси с 5,9 мг адамантана.
Сравнение двумерного спектра 13C / 1H на ядрах 1Н, двумерного спектра 13C / 1H на ядрах 13С и одномерного спектра 13С КП-ВМУ для ~ 5 мг микрокристаллического образца SAIL-убиквитина проводили при частоте вращения 80 кГц. Данные были получены с помощью 1-мм датчика JEOL с четырехкратным резонансом при частоте 750 МГц. Все спектры были обработаны при помощи синусоидальных взвешивающих функций со сдвигом 45° и 60° для 1Н и 13С соответственно. При отсутствии взвешивающих функций ширина линии 1Н и 13С составила 0,10–0,22 м.д. и 0,66–0,94 м.д. соответственно. Каждый спектр записывали в течение приблизительно 5 мин. Импульсные последовательности, использованные для записи спектров, и параметры преобразования данных взяты из работы [12].
Запись двумерного спектра 13C/1H на ядрах 1Н образца SAIL-убиквитина (~ 0,5 мг) с использованием 1-мм датчика первого поколения для КП-ВМУ с двойным резонансом при частоте ВМУ 80 кГц сделана на ЯМР-спектрометре с частотой 800 МГц. Условия проведения эксперимента аналогичны описанным выше, за исключением длительности эксперимента (около 50 мин) и отсутствия 2Н развязки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Основой для существенного расширения информативности и применимости ТТЯМР в исследованиях биомолекул является совершенствование конструкции приборов и развитие методов, позволяющих достичь значительно более высоких значений чувствительности и разрешения. В данной работе мы продемонстрировали 10-кратное увеличение чувствительности в 2D–3D экспериментах на ядрах 1Н по сравнению с аналогичными на ядрах 13С. Такой результат был получен за счет комплексного применения детектирования 1Н, схемы SAIL и сверхскоростного ВМУ с частотой 80 кГц. Не менее важным выводом также является то, что было ясно показано преимущество инверсного детектирования 1Н в сравнении со стандартным методом прямого детектирования 13С. Благодаря этому впервые удалось одновременно повысить и чувствительность, и разрешение ТТЯМР до уровня, с которого становится реальным переход к анализу белков, взятых в наномолярных и субнаномолярных количествах, путем использования, в частности, парамагнитных меток [4, 18], модифицированных схем переноса поляризации [19], а также неоднородных образцов [20]. Так в наших недавних исследованиях достигнутый предел чувствительности в микроанализе структуры белка GB1 уже составил 1 нмоль [21].
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают благодарность д-ру С.Партасарати (S.Parthasarathy) из Иллинойского университета в Чикаго за его вклад в данную работу. Также мы благодарны д-рам Й.Эндо (Y.Endo), Т.Немото (T.Nemoto), Й.Нишияма (Y.Nishiyama) и Й.Ишии (Y.Ishii) из компании JEOL Resonance за их усилия в разработке 1-мм и 0,75-мм датчиков КП-ВМУ, использовавшихся в данном исследовании. Образец SAIL убиквитина был предоставлен проф. М.Каиношо (M.Kainosho) из университета Tokyo Metropolitan. Основная поддержка данного исследования была оказана Национальным научным фондом США (U.S. National Science Foundation) (CHE 957793 и CHE 1310363), а также программой Dreyfus Foundation Teacher-Scholar Award для Йошитака Ишии. Приборное оборудование для 750 МГц ЯМР-спектроскопии твердых тел в Иллинойском университете в Чикаго приобретено при поддержке гранта NIH HEI (1S10 RR025105).
ЛИТЕРАТУРА
1.Schaefer J., Stejskal, E.O. – J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 1031.
2.Nishiyama Y. et al. – J. Magn. Reson., 2011, 208, 44.
3.Parathasarathy S., Nishiyama Y., Ishii Y. – Acc. Chem. Res., 2013, 46, 2127.
4.Wickramasinghe N.P. et al. – Nature Methods 2009, 6, 215.
5.Laage S., Sachleben J.R., Steuernagel S., Pierattelli R., Pintacuda G., Emsley L. – J. Magn. Reson., 2009, 196, 133.
6.Ernst M., Meier M.A., Tuherm T., Samoson A., Meier B.H. – J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 4764.
7.Ishii Y., Tycko R. – J. Magn. Reson., 2000, 142, 199.
8.Ishii Y., Yesinowski J.P., Tycko R. – J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 2921.
9.Zhou D.H., Shah G., Cormos M., Mullen C., Sandoz D., Rienstra C.M. – J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 11791.
10.Marchetti A. et al. – Angew. Chem. Int. Edit. 2012, 51, 10756.
11.Chevelkov V., Rehbein K., Diehl A., Reif B. – Angew. Chem. Int. Edit., 2006, 45, 3878.
12.Wang S. et al. – Plos One, 2015, 10, e0122714.
13.Metz G., Wu X., Smith S.O. – J. Magn. Reson., 1994, 110, 219.
14.Hediger S., Meier B.H., Ernst R.R. – Chem. Phys. Lett., 1995, 240, 449.
15.Kotecha M., Wickramasinghe N.P., Ishii Y. – Magn. Reson. Chem., 2007, 45, S221.
16.Wickramasinghe N.P., Kotecha M., Samoson A., Past J., Ishii Y. – J. Magn. Reson., 2007, 184, 350.
17.Kainosho M., Torizawa T., Iwashita Y., Terauchi T., Ono A.M., Guntert P. – Nature, 2006, 440, 52.
18.Nadaud P.S., Helmus J.J., Sengupta I., Jaroniec C.P. – J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 9561.
19.Althaus S.M., Mao K., Stringer J.A., Kobayashi T., Pruski M. – Solid State Nucl. Magn. Reson., 2014, 57–58, 17.
20.Suiter C.L. et al. – J. Biomol. NMR, 2014, 59, 57.
21.Wickramasinghe A., Wang S., Matsuda I., Nishiyama Y., Nemoto T., Endo Y., Ishii Y. – Solid State Nucl. Magn. Reson., 2015, в печати: http://dx.doi.org/10.1016/j.ssnmr.2015.10.002i.
* Stereo-array-isotope labeled.
* Solid-state NMR (SSNMR).
** Magic-angle spinning (MAS).
*** Cross-polarization MAS (CP-MAS).
Отзывы читателей
