eng
Выпуск #3/2016
В.Шумянцева, Т.Булко, А.Кузиков, Л.Сиголаева
Биосенсорный анализ белков. молекулярно-импринтированный поли-о-фенилендиамин в качестве аналога антител в электроанализе миоглобина
Биосенсорный анализ белков. молекулярно-импринтированный поли-о-фенилендиамин в качестве аналога антител в электроанализе миоглобина
Просмотры: 2494
Технология молекулярного импринтинга в биосенсорном анализе предложена как альтернатива природным аффинным реагентам – антителам для определения белка-кардиомаркера миоглобина. Разработан метод электроанализа миоглобина с использованием графитовых электродов, модифицированных молекулярно-импринтированным полимером на основе орто-фенилендиамина на поверхности многостеночных углеродных нанотрубок.
Ранняя диагностика соматических, психических и психосоматических заболеваний является актуальной задачей для профилактики заболеваний, точного выбора методов и средств лечения, а также мониторинга эффективности лекарственной терапии. Анализ и количественное определение белков-маркеров заболеваний требует создания высокоселективных и высокочувствительных сенсорных систем, способных регистрировать единичные молекулы и их функционально-значимые комплексы. В этом направлении разрабатываются биосенсоры, в которых рецепторный слой включает специфические распознающие компоненты.
Благодаря высокой аффинности и специфичности антитела стали одним из инструментов и диагностических средств в области молекулярной биологии, в терапевтическом мониторинге, биохимии и в биосенсорном анализе. Они широко используются в диагностике различных патологий, включая онкологические, сердечно-сосудистые, хронические воспалительные, инфекционные заболевания. Тем не менее, их применение существенно ограничено. Белки семейства иммуноглобулинов характеризуются большими размерами и состоят из нескольких доменов, сформированных за счет внутридоменных дисульфидных связей и модифицированных путем гликозилирования. Поэтому производство полноразмерных биомолекул возможно только в дорогостоящих системах экспрессии, таких, как клетки млекопитающих или насекомых. Применение биореагентов в анализе имеет ряд сложностей: они дороги, неустойчивы при изменении температуры и при химических модификациях. Кроме того, поликлональные антитела не могут быть получены для токсичных и ядовитых соединений. Получение антител с использованием животных осложнено этическими вопросами, а развитие синтетических вакцин пока не достигло широкого практического применения.
Решение проблемы синтеза специфических связывающих структур состоит в конструировании альтернативных молекул, обладающих способностью к высокоаффинному связыванию лиганда, но лишенных перечисленных выше недостатков. Для этого разрабатываются различные подходы, такие как получение альтернативных каркасных белков (АКБ), представляющих собой модифицированные природные полипептиды или их фрагменты [1], синтез нуклеотидных аналогов антител – аптамеров и сомамеров [2]. Однако и АКБ, и аптамеры являются природными полимерами, поэтому их стабильность может снижаться за счет чувствительности к протеазам (белки), нуклеазам (олигонуклеотиды).
В связи с этим сегодня развивается новое направление – создание сенсоров на основе синтетических биомимических (или "биоподражательных") материалов, осуществляющих, как и биореагенты, селективное комплементарное связывание определяемых веществ по принципу "ключ-замок". Такими биомимическими материалами, обладающими молекулярной памятью, являются полимеры с молекулярными отпечатками, или молекулярно-импринтированные полимеры (МИП, от англ. molecularly imprinted polymers). Стадии получения МИП: электрополимеризация смеси мономер (о-фенилендиамин) /
темплат (миоглобин), удаление молекулы–темплата для образования специфических полостей, связывание с аналитом, содержащим миоглобин, проведение анализа для регистрации миоглобина (рис.1).
По сравнению с биореагентами, МИП обладают такими полезными свойствами, как простота получения, низкая стоимость, устойчивость к химическим и физическим воздействиям и возможность продолжительного хранения и многократного использования после регенерации.
Впервые молекулярный импринтинг был предложен советским ученым М.В.Поляковым в 1931 году [3]: получены силикагели, обладающие специфической адсорбционной способностью. Создание полимеров с "молекулярной памятью" – быстро развивающаяся область современной науки. Методы получения полимерных аналогов антител (молекулярно-импринтированные полимеры, МИП) для низкомолекулярных соединений с массой <1500 Да, таких как пестициды, лекарственные препараты, биологически активные соединения, разработаны и применяются в сенсорном анализе, для разделения, концентрирования, очистки, при моделировании каталитических процессов, для адресной доставки лекарственных препаратов, в материаловедении [4].
С развитием биосенсорных нанотехнологий возрос интерес к получению полимеров с молекулярной памятью в качестве биораспознающих элементов для макромолекул. Впервые импринтинг для белковых молекул разработан в 1985 году [5]. Сегодня активно развивается синтез МИП для высокомолекулярных структур – белков-маркеров заболеваний, бактериальных клеток, вирусов, ДНК. Задачи разработки биосенсорных методов и создания устройств на их основе могут быть успешно решены с развитием именно МИП-технологий в качестве замены антителам, альтернативным каркасным белкам и аптамерам, благодаря их стабильности, способности химического синтеза в различных форматах, например, с помощью электросинтеза, а также возможностью получения как объемных (3D, bulk polymerization), так и плоскостных (2D, surface molecular imprinting) конструкций [6–9].
Отметим, что МИП для макромолекул находят применение не только в биосенсорном анализе, но и как искусственные ферменты для твердофазной экстракции, биоразделения, аффинной детоксикации, а также для удаления мажорных белков из биологических жидкостей. Создана специализированная база данных, посвященная молекулярно-импринтированным полимерам. Сайт http://www.mipdatabase.com позволяет вести поиск молекул-шаблонов, мономеров, посвященных МИП патентов, конференций, а также диссертационных работ, монографий и книг.
Из анализа печатных работ 2010–2014 годов можно сделать вывод о почти десятикратном росте публикаций о создании МИП-сенсоров за 5 лет. Этот факт подчеркивает актуальность и востребованность проводимых исследований в области создания молекулярно-импринтированных полимеров. "Новинки" в МИП-технологиях также публикуются на сайте http://www.mipdatabase.com.
Наиболее часто используемые функциональные мономеры представлены различными акрилатами, на втором месте – токопроводящие полимеры. Кроме МИП для анализа белковых молекул, низкомолекулярных биологически активных соединений, таких как гормоны (тестостерон), нейротрансмиттеры (адреналин, гистамин), моносахариды (глюкоза), активно развивается направление МИП-сенсоров для бактерий и вирусов. Для анализа бактериальных клеток созданы МИП-сенсоры, позволяющие различать грамположительные (Bacillus subtilis, Staphylococcus аureus) и грамотрицательные линии (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa). Для анализа ДНК разрабатываются МИП-сенсоры, имитирующие взаимодействие гетероциклических оснований по принципу пар Уотсона–Крика (А – Т, Г – Ц). Интересны работы по моделированию активных центров ферментов с помощью создания МИП [10]. Например, разработан полимерный аналог активного центра тирозиназы для анализа фенола и допамина. Молекулярно-импринтированные полимеры, содержащие простетические группы, например, гем служат аналогом гемопротеинов и катализируют свойственные им реакции [11].
Для повышения чувствительности биосенсорного анализа (предела определяемых концентраций) синтетические биораспознающие молекулы на основе полимеров могут быть сопряжены с наноматериалами, такими как наночастицы золота, углеродные многостеночные нанотрубки, графен и оксид графена. Среди методов анализа на основе МИП развиваются микрогравиметрия и наногравиметрия (QCM), оптические сенсоры с использованием флуоресценции, а также поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Связывающая способность МИП для макромолекул тестируется также с помощью атомной силовой (AFM) и сканирующей электронной микроскопии (SEM).
Электроанализ – один из наиболее чувствительных методов при создании сенсорных систем медицинского назначения. Причем разработаны как аналитические приборы потенциостаты/гальваностаты для научных исследований (фирмы Metrohm Autolab, Ivium, Нидерланды) (рис.2); так и портативные микропотенциостаты для работы в "полевых" условиях" (фирма Dropsens, www.dropsens.com).
В качестве сенсорного элемента перспективно использование трехконтактных "печатных" электродов (screen-printed electrodes) (рис.3). Размеры таких электродов 1 × 3 см, с диаметром рабочего (индикаторного электрода) 2–5 мм. Их получают методом трафаретной печати при последовательном нанесении на пластиковую или керамическую основу проводящих слоев и изоляции. Электроды такого типа – одноразовые, они удобны при контакте с биологическими образцами, так как не требуют регенерации сенсора. Это важно при работе с биологическими жидкостями – кровью, плазмой, сывороткой пациентов с различными заболеваниями. Печатные электроды выпускаются несколькими фирмами-производителями, в том числе иностранными (www.dropsens.com) и отечественными (ООО "Колорэлектроникс", Россия, http://www.colorel.ru).
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) – одна из основных проблем российского и международного здравоохранения. Они представляют реальную угрозу здоровью и сокращают продолжительность жизни человека. Согласно данным Федеральной службы государственной статистики (www.gks.ru) ССЗ занимают первое место среди причин смерти населения в России и Западной Европе (www.ehnheart.org). Поэтому очень актуальна проблема разработки и создания аналитических тест-систем на основе анализа специфических белков-маркеров для ранней диагностики инфаркта миокарда [12, 13].
Миоглобин – низкомолекулярный гемопротеин (17,8 кДа), являющийся тканеспецифическим маркером острого инфаркта миокарда (ОИМ). Концентрация миоглобина в крови увеличивается спустя 1–3 ч после наступления некроза миокарда, поэтому увеличение концентрации миоглобина – критерий острой фазы ИМ. "Пороговая" концентрация кардиомиоглобина в крови, превышение которой свидетельствует об ИМ, варьируется в достаточно широких пределах от 70–90 нг/мл (4–5 нМ) до 200 нг/мл (11 нМ) и, по всей видимости, зависит от индивидуальных особенностей организма. Однако большинство исследователей ориентируются на средние значения этого показателя – около 100 нг/мл (6 нМ). Концентрация миоглобина при развитии ИМ может превышать в 4−10 раз пороговые значения. По уровню кардиомиоглобина в крови можно судить об обширности инфаркта на ранней стадии его развития, что важно для выбора оптимального лечения больных.
Для регистрации миоглобина применяют различные подходы с использованием методов масс-спектрометрии, жидкостной хроматографии, колориметрии, плазмонного поверхностного резонанса, электроанализа. Биораспознающим элементом, как правило, являются антитела, специфичные к миоглобину. Технология молекулярного импринтинга в биосенсорном анализе – альтернатива природным аффинным реагентам – антителам [14].
Ранее в наших исследованиях был разработан электрохимический метод прямой регистрации миоглобина в водных буферных растворах и в плазме крови здоровых доноров и пациентов, страдающих острым инфарктом миокарда, на основе моноклональных антител к миоглобину. Сенсоры имели диапазон рабочих концентраций от 0,56 до 100 нМ (10 ÷ 1780 нг/мл) с пределом определяемых концентраций 0,56 нМ (10 нг/мл) [15].
МИП-сенсоры на основе о-фенилендиамина имеют более широкий диапазон определяемых концентраций: от 1 нМ до 10 мкМ, с нижним пределом обнаружения 0,5 нМ, сравнимым по чувствительности с предложенными ранее иммуносенсорами. МИП получают электрополимеризацией непосредственно на поверхности индикаторного электрода. Для повышения чувствительности электрохимического анализа разработан метод, основанный на конъюгировании МИП с углеродными многостеночными нанотрубками (УНТ). Углеродные нанотрубки обладают рядом уникальных свойств, таких как высокая электропроводность и способность к переносу электронов, большая площадь поверхности (удельная поверхность УНТ >600 м2/г, а удельная поверхность активированного угля – 20–50 м2/г), высокие механические свойства, химическая инертность, термическая стабильность, а также биосовместимость.
Миоглобин содержит электроактивную группу – гем. Редокс-активность иона железа гема служит электрохимическим маркером гемопротеинов и дает возможность их прямого определения электрохимическими методами. Миоглобин регистрировали по пику восстановления Fe3+ гемопротеина в диапазоне потенциалов от –0,4 до –0,6 В методом квадратно-волновой вольтамперометрии (КВВА) и дифференциально импульсной вольтамперометрии (ДИВА) (рис.4). Анализ в присутствии кислорода позволяет регистрировать электрокаталитические свойства миоглобина как металлопротеина, что приводит к усилению сигнала сенсора. Технология молекулярного импринтинга в биосенсорном анализе была использована в качестве альтернативы природным аффинным реагентам и проявила высокую чувствительность: 1,5 · 10–2 А/нмоль миоглобина и широкий диапазон определяемых концентраций с помощью УНТ/МИП-сенсоров: 1 · 10–11 ÷ 1 · 10–6 М, предел обнаружения миоглобина составил 0,5 · 10–11 М (S/N = 3). Такой диапазон позволяет применить полученные сенсорные системы для анализа плазмы крови пациентов с ОИМ.
Для анализа проб с помощью электродов, модифицированных МИП, были собраны образцы плазмы крови здоровых доноров и больных ОИМ. Концентрация миоглобина определена независимым методом с помощью промышленно выпускаемого анализатора RAMP (Response Biomedical Corp., Канада). Для проведения электроанализа на МИП / УНТ-электрод наносили по 2 мкл плазмы (инкубация 15 мин, 37oC, затем стадия отмывки неспецифически связавшихся молекул в течение 15 мин). На основе анализа двух электрохимических параметров: интенсивности восстановительного пика и площади восстановительного пика миоглобина, регистрируемой методом дифференциальной импульсной вольтамперометрии УНТ / МИП-электродов, проведена 2D-классификация плазм здоровых доноров и пациентов с ОИМ (рис.5).
В результате обработки электрохимических параметров получены два кластера: здоровые доноры (1) и больные ОИМ (2). Такая классификация позволяет более точно отнести образцы к "зоне риска". Кроме того, проанализированы образцы плазмы крови здоровых добровольцев, концентрация миоглобина в которых была неизвестна. Используя 2D-классификацию, такие пробы относятся к "зоне здоровья".
Диагностическая чувствительность метода, рассчитанная как отношение числа больных с ОИМ, имеющих положительный результат по методу с использованием МИП, к общему количеству больных с ОИМ, составила 90%. Диагностическая специфичность метода, рассчитанная как отношение числа здоровых доноров (пациентов без ОИМ), имеющих отрицательный результат теста, к числу всех протестированных здоровых доноров (пациентов без ОИМ), составила 80%.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о применимости разработанной методики на основе полимерных аналогов антител для анализа миоглобина в плазме крови больных ОИМ.
Преимуществами полимеров с молекулярными отпечатками является их стабильность, экономичность синтеза, а также возможность использования различных современных методов анализа биологических молекул в низких концентрациях. Однако, в разработке МИП остается еще много нерешенных проблем, связанных со специфичностью биораспознавания, с методами удаления молекулы-шаблона при сохранении структуры полимера, с чувствительностью анализа.
Исследования выполнены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках соглашения № 14.576.21.0045 (уникальный идентификатор RFMEFI57614X0045).
ЛИТЕРАТУРА
1.Петровская Л.Е., Шингарова Д.А., Долгих М.П., Кирпичников М.П. Альтернативные каркасные белки // Биоорганическая химия. 2011. Т. 37. С. 581–591.
2.Radko S., Rakhmetova S., Bodoev N., Archakov A. Aptamers as affinity reagents for clinical proteomics // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2007. V. 1. С. 198–209.
3.Поляков М.В. Адсорбционные свойства силикагеля и его структура // ЖФХ. 1931. Т. 2. Вып. 6. С. 799–805.
1.Гендриксон О.Д., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Молекулярно-импринтированные полимеры и их применение в биохимическом анализе // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 149–192.
2.Glad M., Norrilow O., Selllengren B., Siegbahn N., Mosbach K. Use of silane monomers for molecular imprinting and enzyme entrapment in polysiloxane-coated porous silica // J.Chromatogr. A. 1985. V. 347. C. 11–23.
3.Iskierko Z., Sharma P.S., Bartold K., Pietrzyk-Le A., Noworyta K., Kutner W. Molecularly imprinted polymers for separating and sensing of macromolecular compounds and microorganisms // Biotechnology Advances. 2016. V. 34. P. 30–46.
4.Erdőssy J., Horváth V., Yarman A., Scheller F.W., Gyurcsányi R.E. Electrosynthesized molecularly imprinted polymers for protein recognition // Trends in Analytical Chemistry, 2016, in press.
5.MA Xiong-Hui, LI Jian-Ping, WANG Chao, XU Guo-Bao. A Review on Bio-macromolecular Imprinted Sensors and Their Applications // Chinese Journal of Analytical Chemistry. 2016. V. 44. 1. P. 152–159.
6.Шумянцева В.В., Булко Т.В., Байчоров И.Х., Арчаков А.И. Полимерные антитела (МИП) в электроанализе белков // Биомедицинская химия. 2015. Т. 61. № 3. С. 325–331.
7.Li S., Zhu V., Whitcombe M.J., Piletsky S.A., Turner A.P.F. Molecularly Imprinted Catalysts Principles, Syntheses, and Applications. Catalytically Active MIP Architectures, 1 – Molecularly Imprinted Polymers for Enzyme-like Catalysis: Principle, Design, and Applications. 2016. P. 1–17.
5.Dechtrirat D., Yarman A., Peng L., Lettau K., Wollenberger U., Mosbach K., Scheller FW. 2-Molecularly Imprinted Catalysts Principles, Syntheses, and Applications. Catalytically Active MIP Architectures. 2016. P. 19–34.
6.McDonnell B., Hearty S., Leonard P., O’Kennedy R. Cardiac biomarkers and the case for point-of-care testing // Clin. Biochem. 2009. V. 42. P. 549–561.
7.Hasanzadeh M., Shadjou N., Eskandani M., Guardia M., Omidinia E. Electrochemical nano-immunosensing of effective cardiac biomarkers for acute myocardial infarction // Trends in Analytical chemistry. 2013. V. 49. P. 20–30.
8.Шумянцева В.В., Булко Т.В., Сиголаева Л.В., Кузиков А.В., Шатская М.А., Арчаков А.И. Электросинтез и характеристика связывающей способности молекулярно-импринтированного поли-о-фенилендиамина в качестве аналога антител при электроанализе миоглобина // Доклады Академии наук. 2015. Т. 464. № 1. С. 111–114.
9.Шумянцева В.В., Булко Т.В., Вагин М.Ю., Супрун Е.В., Арчаков А.И. Электрохимический иммуноанализ кардиомиоглобина // Биомедицинская химия. 2010. Т. 56. Вып. 6. С. 758–768.
Благодаря высокой аффинности и специфичности антитела стали одним из инструментов и диагностических средств в области молекулярной биологии, в терапевтическом мониторинге, биохимии и в биосенсорном анализе. Они широко используются в диагностике различных патологий, включая онкологические, сердечно-сосудистые, хронические воспалительные, инфекционные заболевания. Тем не менее, их применение существенно ограничено. Белки семейства иммуноглобулинов характеризуются большими размерами и состоят из нескольких доменов, сформированных за счет внутридоменных дисульфидных связей и модифицированных путем гликозилирования. Поэтому производство полноразмерных биомолекул возможно только в дорогостоящих системах экспрессии, таких, как клетки млекопитающих или насекомых. Применение биореагентов в анализе имеет ряд сложностей: они дороги, неустойчивы при изменении температуры и при химических модификациях. Кроме того, поликлональные антитела не могут быть получены для токсичных и ядовитых соединений. Получение антител с использованием животных осложнено этическими вопросами, а развитие синтетических вакцин пока не достигло широкого практического применения.
Решение проблемы синтеза специфических связывающих структур состоит в конструировании альтернативных молекул, обладающих способностью к высокоаффинному связыванию лиганда, но лишенных перечисленных выше недостатков. Для этого разрабатываются различные подходы, такие как получение альтернативных каркасных белков (АКБ), представляющих собой модифицированные природные полипептиды или их фрагменты [1], синтез нуклеотидных аналогов антител – аптамеров и сомамеров [2]. Однако и АКБ, и аптамеры являются природными полимерами, поэтому их стабильность может снижаться за счет чувствительности к протеазам (белки), нуклеазам (олигонуклеотиды).
В связи с этим сегодня развивается новое направление – создание сенсоров на основе синтетических биомимических (или "биоподражательных") материалов, осуществляющих, как и биореагенты, селективное комплементарное связывание определяемых веществ по принципу "ключ-замок". Такими биомимическими материалами, обладающими молекулярной памятью, являются полимеры с молекулярными отпечатками, или молекулярно-импринтированные полимеры (МИП, от англ. molecularly imprinted polymers). Стадии получения МИП: электрополимеризация смеси мономер (о-фенилендиамин) /
темплат (миоглобин), удаление молекулы–темплата для образования специфических полостей, связывание с аналитом, содержащим миоглобин, проведение анализа для регистрации миоглобина (рис.1).
По сравнению с биореагентами, МИП обладают такими полезными свойствами, как простота получения, низкая стоимость, устойчивость к химическим и физическим воздействиям и возможность продолжительного хранения и многократного использования после регенерации.
Впервые молекулярный импринтинг был предложен советским ученым М.В.Поляковым в 1931 году [3]: получены силикагели, обладающие специфической адсорбционной способностью. Создание полимеров с "молекулярной памятью" – быстро развивающаяся область современной науки. Методы получения полимерных аналогов антител (молекулярно-импринтированные полимеры, МИП) для низкомолекулярных соединений с массой <1500 Да, таких как пестициды, лекарственные препараты, биологически активные соединения, разработаны и применяются в сенсорном анализе, для разделения, концентрирования, очистки, при моделировании каталитических процессов, для адресной доставки лекарственных препаратов, в материаловедении [4].
С развитием биосенсорных нанотехнологий возрос интерес к получению полимеров с молекулярной памятью в качестве биораспознающих элементов для макромолекул. Впервые импринтинг для белковых молекул разработан в 1985 году [5]. Сегодня активно развивается синтез МИП для высокомолекулярных структур – белков-маркеров заболеваний, бактериальных клеток, вирусов, ДНК. Задачи разработки биосенсорных методов и создания устройств на их основе могут быть успешно решены с развитием именно МИП-технологий в качестве замены антителам, альтернативным каркасным белкам и аптамерам, благодаря их стабильности, способности химического синтеза в различных форматах, например, с помощью электросинтеза, а также возможностью получения как объемных (3D, bulk polymerization), так и плоскостных (2D, surface molecular imprinting) конструкций [6–9].
Отметим, что МИП для макромолекул находят применение не только в биосенсорном анализе, но и как искусственные ферменты для твердофазной экстракции, биоразделения, аффинной детоксикации, а также для удаления мажорных белков из биологических жидкостей. Создана специализированная база данных, посвященная молекулярно-импринтированным полимерам. Сайт http://www.mipdatabase.com позволяет вести поиск молекул-шаблонов, мономеров, посвященных МИП патентов, конференций, а также диссертационных работ, монографий и книг.
Из анализа печатных работ 2010–2014 годов можно сделать вывод о почти десятикратном росте публикаций о создании МИП-сенсоров за 5 лет. Этот факт подчеркивает актуальность и востребованность проводимых исследований в области создания молекулярно-импринтированных полимеров. "Новинки" в МИП-технологиях также публикуются на сайте http://www.mipdatabase.com.
Наиболее часто используемые функциональные мономеры представлены различными акрилатами, на втором месте – токопроводящие полимеры. Кроме МИП для анализа белковых молекул, низкомолекулярных биологически активных соединений, таких как гормоны (тестостерон), нейротрансмиттеры (адреналин, гистамин), моносахариды (глюкоза), активно развивается направление МИП-сенсоров для бактерий и вирусов. Для анализа бактериальных клеток созданы МИП-сенсоры, позволяющие различать грамположительные (Bacillus subtilis, Staphylococcus аureus) и грамотрицательные линии (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa). Для анализа ДНК разрабатываются МИП-сенсоры, имитирующие взаимодействие гетероциклических оснований по принципу пар Уотсона–Крика (А – Т, Г – Ц). Интересны работы по моделированию активных центров ферментов с помощью создания МИП [10]. Например, разработан полимерный аналог активного центра тирозиназы для анализа фенола и допамина. Молекулярно-импринтированные полимеры, содержащие простетические группы, например, гем служат аналогом гемопротеинов и катализируют свойственные им реакции [11].
Для повышения чувствительности биосенсорного анализа (предела определяемых концентраций) синтетические биораспознающие молекулы на основе полимеров могут быть сопряжены с наноматериалами, такими как наночастицы золота, углеродные многостеночные нанотрубки, графен и оксид графена. Среди методов анализа на основе МИП развиваются микрогравиметрия и наногравиметрия (QCM), оптические сенсоры с использованием флуоресценции, а также поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Связывающая способность МИП для макромолекул тестируется также с помощью атомной силовой (AFM) и сканирующей электронной микроскопии (SEM).
Электроанализ – один из наиболее чувствительных методов при создании сенсорных систем медицинского назначения. Причем разработаны как аналитические приборы потенциостаты/гальваностаты для научных исследований (фирмы Metrohm Autolab, Ivium, Нидерланды) (рис.2); так и портативные микропотенциостаты для работы в "полевых" условиях" (фирма Dropsens, www.dropsens.com).
В качестве сенсорного элемента перспективно использование трехконтактных "печатных" электродов (screen-printed electrodes) (рис.3). Размеры таких электродов 1 × 3 см, с диаметром рабочего (индикаторного электрода) 2–5 мм. Их получают методом трафаретной печати при последовательном нанесении на пластиковую или керамическую основу проводящих слоев и изоляции. Электроды такого типа – одноразовые, они удобны при контакте с биологическими образцами, так как не требуют регенерации сенсора. Это важно при работе с биологическими жидкостями – кровью, плазмой, сывороткой пациентов с различными заболеваниями. Печатные электроды выпускаются несколькими фирмами-производителями, в том числе иностранными (www.dropsens.com) и отечественными (ООО "Колорэлектроникс", Россия, http://www.colorel.ru).
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) – одна из основных проблем российского и международного здравоохранения. Они представляют реальную угрозу здоровью и сокращают продолжительность жизни человека. Согласно данным Федеральной службы государственной статистики (www.gks.ru) ССЗ занимают первое место среди причин смерти населения в России и Западной Европе (www.ehnheart.org). Поэтому очень актуальна проблема разработки и создания аналитических тест-систем на основе анализа специфических белков-маркеров для ранней диагностики инфаркта миокарда [12, 13].
Миоглобин – низкомолекулярный гемопротеин (17,8 кДа), являющийся тканеспецифическим маркером острого инфаркта миокарда (ОИМ). Концентрация миоглобина в крови увеличивается спустя 1–3 ч после наступления некроза миокарда, поэтому увеличение концентрации миоглобина – критерий острой фазы ИМ. "Пороговая" концентрация кардиомиоглобина в крови, превышение которой свидетельствует об ИМ, варьируется в достаточно широких пределах от 70–90 нг/мл (4–5 нМ) до 200 нг/мл (11 нМ) и, по всей видимости, зависит от индивидуальных особенностей организма. Однако большинство исследователей ориентируются на средние значения этого показателя – около 100 нг/мл (6 нМ). Концентрация миоглобина при развитии ИМ может превышать в 4−10 раз пороговые значения. По уровню кардиомиоглобина в крови можно судить об обширности инфаркта на ранней стадии его развития, что важно для выбора оптимального лечения больных.
Для регистрации миоглобина применяют различные подходы с использованием методов масс-спектрометрии, жидкостной хроматографии, колориметрии, плазмонного поверхностного резонанса, электроанализа. Биораспознающим элементом, как правило, являются антитела, специфичные к миоглобину. Технология молекулярного импринтинга в биосенсорном анализе – альтернатива природным аффинным реагентам – антителам [14].
Ранее в наших исследованиях был разработан электрохимический метод прямой регистрации миоглобина в водных буферных растворах и в плазме крови здоровых доноров и пациентов, страдающих острым инфарктом миокарда, на основе моноклональных антител к миоглобину. Сенсоры имели диапазон рабочих концентраций от 0,56 до 100 нМ (10 ÷ 1780 нг/мл) с пределом определяемых концентраций 0,56 нМ (10 нг/мл) [15].
МИП-сенсоры на основе о-фенилендиамина имеют более широкий диапазон определяемых концентраций: от 1 нМ до 10 мкМ, с нижним пределом обнаружения 0,5 нМ, сравнимым по чувствительности с предложенными ранее иммуносенсорами. МИП получают электрополимеризацией непосредственно на поверхности индикаторного электрода. Для повышения чувствительности электрохимического анализа разработан метод, основанный на конъюгировании МИП с углеродными многостеночными нанотрубками (УНТ). Углеродные нанотрубки обладают рядом уникальных свойств, таких как высокая электропроводность и способность к переносу электронов, большая площадь поверхности (удельная поверхность УНТ >600 м2/г, а удельная поверхность активированного угля – 20–50 м2/г), высокие механические свойства, химическая инертность, термическая стабильность, а также биосовместимость.
Миоглобин содержит электроактивную группу – гем. Редокс-активность иона железа гема служит электрохимическим маркером гемопротеинов и дает возможность их прямого определения электрохимическими методами. Миоглобин регистрировали по пику восстановления Fe3+ гемопротеина в диапазоне потенциалов от –0,4 до –0,6 В методом квадратно-волновой вольтамперометрии (КВВА) и дифференциально импульсной вольтамперометрии (ДИВА) (рис.4). Анализ в присутствии кислорода позволяет регистрировать электрокаталитические свойства миоглобина как металлопротеина, что приводит к усилению сигнала сенсора. Технология молекулярного импринтинга в биосенсорном анализе была использована в качестве альтернативы природным аффинным реагентам и проявила высокую чувствительность: 1,5 · 10–2 А/нмоль миоглобина и широкий диапазон определяемых концентраций с помощью УНТ/МИП-сенсоров: 1 · 10–11 ÷ 1 · 10–6 М, предел обнаружения миоглобина составил 0,5 · 10–11 М (S/N = 3). Такой диапазон позволяет применить полученные сенсорные системы для анализа плазмы крови пациентов с ОИМ.
Для анализа проб с помощью электродов, модифицированных МИП, были собраны образцы плазмы крови здоровых доноров и больных ОИМ. Концентрация миоглобина определена независимым методом с помощью промышленно выпускаемого анализатора RAMP (Response Biomedical Corp., Канада). Для проведения электроанализа на МИП / УНТ-электрод наносили по 2 мкл плазмы (инкубация 15 мин, 37oC, затем стадия отмывки неспецифически связавшихся молекул в течение 15 мин). На основе анализа двух электрохимических параметров: интенсивности восстановительного пика и площади восстановительного пика миоглобина, регистрируемой методом дифференциальной импульсной вольтамперометрии УНТ / МИП-электродов, проведена 2D-классификация плазм здоровых доноров и пациентов с ОИМ (рис.5).
В результате обработки электрохимических параметров получены два кластера: здоровые доноры (1) и больные ОИМ (2). Такая классификация позволяет более точно отнести образцы к "зоне риска". Кроме того, проанализированы образцы плазмы крови здоровых добровольцев, концентрация миоглобина в которых была неизвестна. Используя 2D-классификацию, такие пробы относятся к "зоне здоровья".
Диагностическая чувствительность метода, рассчитанная как отношение числа больных с ОИМ, имеющих положительный результат по методу с использованием МИП, к общему количеству больных с ОИМ, составила 90%. Диагностическая специфичность метода, рассчитанная как отношение числа здоровых доноров (пациентов без ОИМ), имеющих отрицательный результат теста, к числу всех протестированных здоровых доноров (пациентов без ОИМ), составила 80%.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о применимости разработанной методики на основе полимерных аналогов антител для анализа миоглобина в плазме крови больных ОИМ.
Преимуществами полимеров с молекулярными отпечатками является их стабильность, экономичность синтеза, а также возможность использования различных современных методов анализа биологических молекул в низких концентрациях. Однако, в разработке МИП остается еще много нерешенных проблем, связанных со специфичностью биораспознавания, с методами удаления молекулы-шаблона при сохранении структуры полимера, с чувствительностью анализа.
Исследования выполнены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках соглашения № 14.576.21.0045 (уникальный идентификатор RFMEFI57614X0045).
ЛИТЕРАТУРА
1.Петровская Л.Е., Шингарова Д.А., Долгих М.П., Кирпичников М.П. Альтернативные каркасные белки // Биоорганическая химия. 2011. Т. 37. С. 581–591.
2.Radko S., Rakhmetova S., Bodoev N., Archakov A. Aptamers as affinity reagents for clinical proteomics // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2007. V. 1. С. 198–209.
3.Поляков М.В. Адсорбционные свойства силикагеля и его структура // ЖФХ. 1931. Т. 2. Вып. 6. С. 799–805.
1.Гендриксон О.Д., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Молекулярно-импринтированные полимеры и их применение в биохимическом анализе // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 149–192.
2.Glad M., Norrilow O., Selllengren B., Siegbahn N., Mosbach K. Use of silane monomers for molecular imprinting and enzyme entrapment in polysiloxane-coated porous silica // J.Chromatogr. A. 1985. V. 347. C. 11–23.
3.Iskierko Z., Sharma P.S., Bartold K., Pietrzyk-Le A., Noworyta K., Kutner W. Molecularly imprinted polymers for separating and sensing of macromolecular compounds and microorganisms // Biotechnology Advances. 2016. V. 34. P. 30–46.
4.Erdőssy J., Horváth V., Yarman A., Scheller F.W., Gyurcsányi R.E. Electrosynthesized molecularly imprinted polymers for protein recognition // Trends in Analytical Chemistry, 2016, in press.
5.MA Xiong-Hui, LI Jian-Ping, WANG Chao, XU Guo-Bao. A Review on Bio-macromolecular Imprinted Sensors and Their Applications // Chinese Journal of Analytical Chemistry. 2016. V. 44. 1. P. 152–159.
6.Шумянцева В.В., Булко Т.В., Байчоров И.Х., Арчаков А.И. Полимерные антитела (МИП) в электроанализе белков // Биомедицинская химия. 2015. Т. 61. № 3. С. 325–331.
7.Li S., Zhu V., Whitcombe M.J., Piletsky S.A., Turner A.P.F. Molecularly Imprinted Catalysts Principles, Syntheses, and Applications. Catalytically Active MIP Architectures, 1 – Molecularly Imprinted Polymers for Enzyme-like Catalysis: Principle, Design, and Applications. 2016. P. 1–17.
5.Dechtrirat D., Yarman A., Peng L., Lettau K., Wollenberger U., Mosbach K., Scheller FW. 2-Molecularly Imprinted Catalysts Principles, Syntheses, and Applications. Catalytically Active MIP Architectures. 2016. P. 19–34.
6.McDonnell B., Hearty S., Leonard P., O’Kennedy R. Cardiac biomarkers and the case for point-of-care testing // Clin. Biochem. 2009. V. 42. P. 549–561.
7.Hasanzadeh M., Shadjou N., Eskandani M., Guardia M., Omidinia E. Electrochemical nano-immunosensing of effective cardiac biomarkers for acute myocardial infarction // Trends in Analytical chemistry. 2013. V. 49. P. 20–30.
8.Шумянцева В.В., Булко Т.В., Сиголаева Л.В., Кузиков А.В., Шатская М.А., Арчаков А.И. Электросинтез и характеристика связывающей способности молекулярно-импринтированного поли-о-фенилендиамина в качестве аналога антител при электроанализе миоглобина // Доклады Академии наук. 2015. Т. 464. № 1. С. 111–114.
9.Шумянцева В.В., Булко Т.В., Вагин М.Ю., Супрун Е.В., Арчаков А.И. Электрохимический иммуноанализ кардиомиоглобина // Биомедицинская химия. 2010. Т. 56. Вып. 6. С. 758–768.
Отзывы читателей
