eng
Выпуск #4/2016
А.Яшин
Определение биомаркеров методом ВЭЖХ с амперометрическим детектированием
Определение биомаркеров методом ВЭЖХ с амперометрическим детектированием
Просмотры: 2816
Хроматография сегодня занимает лидирующие позиции среди аналитических методов. По последним данным более 60% всех химических анализов в мире выполняются хроматографически. Чаще всего применяется ВЭЖХ, например, для контроля загрязнений окружающей среды, пищевых продуктов,
в фармацевтике, медицине, биологии,
в судмедэкспертизе и др. В кратком обзоре рассмотрены уникальные возможности ВЭЖХ
с амперометрическим детектором в медицине для определения специфических биомаркеров заболеваний и окислительного стресса
с диагностическими целями.
в фармацевтике, медицине, биологии,
в судмедэкспертизе и др. В кратком обзоре рассмотрены уникальные возможности ВЭЖХ
с амперометрическим детектором в медицине для определения специфических биомаркеров заболеваний и окислительного стресса
с диагностическими целями.
Теги: a marker of oxidative stress amperometric detector hplc liquid chromatography амперометрический детектор вэжх жидкостная хроматография маркер окислительного стресса
Амперометрическое (электрохимическое) детектирование в ВЭЖХ благодаря низкому пределу детектирования и высокой селективности наиболее подходит для определения микропримесей маркеров заболеваний и окислительного стресса в биологических жидкостях человека. Кроме того, оно имеет предел обнаружения на порядок ниже, чем спектрофотометрическое. Амперометрический и кулонометрический детекторы при разных потенциалах так же, как и спектрофотометрический на диодной матрице и масс-спектрометрический, могут быть использованы для идентификации неизвестных соединений, то есть в качестве 3D-детекторов. По сравнению с другими (особенно масс-спектрометрическими) детекторами амперометрические значительно дешевле. Исключительные возможности амперометрического детектора позволяют напрямую определять в биологических жидкостях катехоламины (адреналин, норадреналин, дофамин), их предшественников (леводопа и др.) и метаболиты (гомованилиновая и ванилилминдальная кислоты), серотонин, гомоцистеин, цистеин, цистин, глутатионы, убихинол, убихинон, измененные нуклеозиды, липоевую, мочевую кислоты, витамины С, Е, эстрадиол и др.
Амперометрическое детектирование используется в окислительном режиме со стеклоуглеродом в качестве рабочего электрода при постоянном потенциале [2]. Применяется оно и в импульсном режиме, в частности для прямого определения аминокислот и сахаров [2]. А в восстановительном режиме его используют значительно реже. Амперометрический детектор определяет полифенолы, тиолы, ароматические амины, соединения с сопряженными двойными связями.
Перечислим основные достоинства амперометрического детектора [2]:
• низкий предел обнаружения, то есть высокая чувствительность;
• высокая селективность к соединениям, имеющим гидроксильную или аминную группы в бензольном кольце, а также к тиолам;
• возможность превращения амперометрического детектирования в 3D при регистрации при разных потенциалах;
• возможность напрямую (без дериватизации) определять аминокислоты и сахара в импульсном режиме в щелочной среде;
• малый объем ячейки детектора, позволяющий применять его в капиллярном, микро- и даже нанорежимах;
• низкая стоимость.
В последнее десятилетие большой интерес вызывает определение маркеров многих заболеваний с целью их ранней диагностики. Начали выходить специализированные журналы по этим вопросам: Journal of Biomarkers, Journal of Molecular Biomarkers
and Diagnosis и др. Перечень основных маркеров, определяемых амперометрическим детектором в биологических жидкостях напрямую без концентрирования и дериватизации, приведен в таблице.
Рассмотрим подробнее наиболее важные применения ВЭЖХ с амперометрическим детектором для определения маркеров заболеваний.
Катехоламины выполняют биологическую функцию краткосрочной адаптации и регулируют многие процессы метаболизма, включая реакцию гидродинамического артериального давления, а также передачу нервного сигнала в синапсах симпатической нервной системы. В первом случае катехоламины могут рассматриваться как гормоны, во втором случае – как нейромедиаторы. Клинический интерес к уровню катехоламинов в биологических жидкостях связан с проблемой физиологии адаптивных сигналов стресса (точность оценки заболевания и прогноз).
Типичная реакция на стресс – активация синтеза и повышение содержания в крови катехоламинов. Под влиянием стресса они выделяются в кровь и мобилизуют организм для активной мышечной деятельности, как при внешней, так и внутренней угрозе, связанной с различными болезнями. Определение катехоламинов является тестом дифференциальной диагностики симптоматических форм артериальной гипертонии, особенно при наличии феохромацитомы или нейробластомы.
Важную роль катехоламины играют также в поддержании биологической функции гомеостаза (постоянства состава внутренней среды и устойчивости основных физиологических функций). Для оценки состояния организма определяют содержание катехоламинов (адреналина, норадреналина, дофамина), их предшественников и метаболитов в биологических жидкостях (плазма крови, моча, слюна).
Нейробластома – наиболее часто встречающаяся опухоль у детей, это вторая причина смертности в возрасте до 5 лет. При ранней диагностике нейробластомы на первой стадии возможно полное излечение. Даже при диагностировании второй стадии болезни процент излечения детей составляет около 90%. Очень важно обследовать детей до одного года. В высокоразвитых странах (США, Канаде, Франции, Японии) производится скрининг детей до 5 лет. В нашей стране чаще всего диагностируют нейробластому на 3–4 стадии, когда полное излечение затруднено и требует больших финансовых затрат.
Ранняя диагностика нейробластомы возможна по содержанию ее биохимических маркеров в моче – ванилилминдальной (ВМК) и гомованилиновой (ГВК) кислот: у 90% больных их концентрация возрастает. Достоверность диагноза увеличивается, если одновременно измерять и ванилилактоновую (ВЛ) кислоту. Определение этих маркеров проводят с помощью ВЭЖХ с амперометрическим детектором. Время разделения около 10 мин на колонке в обращенно-фазовом варианте с ион-парными элюентами [9]. Жидкостный хроматограф с амперометрическим детектором в окислительном режиме позволяет надежно определять примеси ВМК, ГВК и ВЛ
в моче без дериватизации и концентрирования.
Очень большое диагностическое значение имеет определение серотонина и его метаболита. Серотонин влияет на ритм сердца, сон, секс, терморегуляцию, а также на синтез мелатонина, психические заболевания, такие как депрессия, шизофрения. По метаболиту серотонина 5-гидроксииндол уксусной кислоты (5-HIAA) можно диагностировать карциноидные синдромы (см.: Харт К. Секреты серотонина. Минск, 1998. 315 с.).
Не так давно установлена связь между повышенным содержанием гомоцистеина в крови человека и ростом числа коронарных заболеваний. Кардиологические пациенты с наиболее высоким уровнем гомоцистеина погибают раньше, чем больные с низким содержанием гомоцистеина в плазме. Гомоцистеин – мощный стимул развития атеросклероза, это главный маркер для оценки атерогенного риска. Если уровень циркулирующего в крови гомоцистеина превышает 8–10 мкмоль/л, то высок риск тромбоза и сердечно-сосудистых заболеваний независимо от других показателей. В норме содержание гомоцистеина порядка 9,6 мкмоль/л, с возрастом его содержание увеличивается. При концентрации гомоцистеина 15 мкмоль/л опасность в 100 раз больше, чем при высоком холестерине. Смертельно опасное содержание – свыше 50 мкмоль/л.
Негативное действие гомоцистеина заклю-чается в том, что он поражает сосудистую стенку артерий. При поражении коронарных артерий сердца происходит сужение сосудов, возникает недостаточность кровообращения, что в конечном итоге может привести к инфаркту миокарда. Поражение сосудов головного мозга может вызвать инсульт. Многие исследователи приходят к заключению, что основной виновник сердечно-сосудистых заболеваний в большей мере гомоцистеин, а не холестерин. Поэтому необходим экспрессный, достоверный и сравнительно простой метод анализа гомоцистеина. Для определения гомоцистеина (и сопутствующих цистеина и метионина) применяют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). На сегодняшний момент опубликовано более 600 статей по анализу гомоцистеина методом ВЭЖХ, а в 1997 году вышла книга К.С.МакКалли "Гомоцистеиновая революция". В качестве детектирующих систем используют спектрофотометрические, флуоресцентные и амперометрические. Первые две требуют предварительной дериватизации, а амперометрический детектор определяет гомоцистеин напрямую без дериватизации [14].
В плазме крови гомоцистеин присутствует в виде свободного, симметричного дисульфида и ассиметричных дисульфидов, связанных через дисульфидную связь с белком (80–85%). Следовательно, общее для всех аналитических методик состоит в переводе всех связанных форм гомоцистеина в свободный с помощью восстанавливающих агентов. Находят применение следующие восстановители: боргидриды натрия и калия, водорастворимые фосфины, такие как трибутилфосфин, трис-(2-карбоксилэтилфосфин), трифенилфосфин, а также дитиотриетол, который работает в широком диапазоне температур. Для приготовления калибровочных растворов можно использовать чистый гомоцистеин фирмы Sigma. Для оценки правильности измерений гомоцистеина в плазме крови применяют контрольные растворы гомоцистеина "Ликвичек гомоцистеин" фирмы Bio-Rad
с концентрациями: 10 мкмоль/л (7,5–12,5 мкмоль/л) и 45 мкмоль/л (36–54 мкмоль/л).
Сегодня в нашей стране и за рубежом интенсивно ведутся исследования по разработке методов и приборов для диагностики окислительного стресса. При неблагоприятных условиях (плохая экология, облучение, стресс, загрязненная и некачественная пища, некоторые болезни, курение, алкоголизм, наркомания и пр.) в биологических жидкостях может возрастать концентрация высокореакционных кислородных и азотных соединений, включая и свободные радикалы (супероксидный радикал кислорода, гидроксид-радикал, пероксинитрит и др.). Свободные радикалы в допустимых концентрациях необходимы для некоторых биологических процессов, а также для нормальной функции иммунной системы и ее компонентов. Однако их избыточное содержание приводит к развитию патологических изменений в организме человека. Такое состояние называют окислительным (оксидантным) стрессом. Подавляющее большинство теорий старения также основаны на свободнорадикальном окислении. Многочисленные научные публикации подтверждают, что большинство тяжелых болезней вызывается окислительным стрессом: атеросклероз, онкологические, нарушения мозгового кровообращения, сахарный диабет, воспалительные, ревматоидные, нейродегенеративные (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, шизофрения, аутизм). Поэтому исключительно важно диагностировать начало развития окислительного стресса, пока он не перерос в серьезное заболевание. Окислительный стресс может быть быстро определен путем измерения общего антиоксидантного статуса, то есть суммарного содержания антиоксидантов в организме человека. Для более достоверного детального анализа необходимо оценивать окислительный стресс по специальным маркерам, которые появляются в биологических жидкостях при окислении липидов, белков, углеводов и молекул ДНК.
Современные жидкостные хроматографы с амперометрическим и спектрофотометрическим детекторами с изократическим и градиентным насосами позволяют определять основные маркеры окислительного стресса. Маркеры окисления белков, липидов, молекул ДНК в разных биологических жидкостях (плазма или сыворотка крови, моча, слюна, конденсат выдыхаемого воздуха) детектируются на уровне 10–10 – 10–9 г/см3. На жидкостных хроматографах отработаны методические рекомендации по определению наиболее представительных маркеров окислительного стресса: тирозина, 3.4-DOPA, м-тирозина, о-тирозина, 3-хлортирозина, 3-нитротирозина, малонового диальдегида, 8-гидрокси-2ґ-дезокси-гуанозина, цистеина, глутатиона, мочевой кислоты [2, 19, 20]. На таких хроматографах можно измерять окислительно-восстановительный по-
тенциал биологических жидкостей по соотношению восстановленных и окисленных форм биологически активных молекул, в частности, глутатиона (GSH и GSSG), мочевой кислоты, цистеина к цистину, убихинола к убихинону, нитрита к нитрату и др. Это позволит с большой достоверностью оценить состояние здоровья человека, так как практически нет болезней, при которых бы окислительно-восстановительный баланс не нарушался [19, 20].
Массовое внедрение таких хроматографов позволит выявлять начало развития опасных болезней на самой ранней стадии и, используя антиоксидантную терапию, на основании нашего банка данных содержания антиоксидантов в пищевых продуктах, напитках, лекарствах, витаминах, БАДах, экстрактах лекарственных трав (всего более 1 400 продуктов), не допустить дальнейшего их развития. Благодаря этому могут значительно сократиться затраты на лечение, увеличиться продолжительность жизни и снизиться смертность населения Российской Федерации.
Обследования по раннему выявлению окислительного стресса можно организовать не только в больницах, диагностических центрах, но и в профилакториях, санаториях, домах отдыха и других оздоровительных учреждениях. Стоимость таких обследований будет доступна большинству населения нашей страны. Выявление окислительного стресса (предшественника болезней) и его устранение – это шаг к новой профилактической медицине.
Кроме приведенных маркеров, амперометрическим детектором можно измерять в биологических жидкостях большинство наркотиков и наркотических средств [34, 35], лекарств [36–38], а также биологически активные соединения: иодид [39], холестерин [40], никотин [41], сорбитол [42] и др. При исследовании биодоступности природных антиоксидантов определяют содержание флавоноидов и фенольных кислот в плазме человека [43].
***
Таким образом, ВЭЖХ с амперометрическим детектированием имеет большие перспективы в клинических и терапевтических анализах. Определение катехоламинов уже проводят в некоторых медицинских учреждениях. В Нижегородском диагностическом центре в лаборатории, руководимой Т.А.Басалгиной, для диагностики ферохромацитомы – рака надпочечников – регулярно проводят измерения катехоламинов в суточной моче методом ВЭЖХ с амперометрическим детектированием. Проведено более 12 тыс. анализов. Также регулярно проводятся анализы катехоламинов методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором в биохимической лаборатории Российского кардиологического научно-производственного комплекса
(зав. лаб., д.м.н. проф. В.Н.Титов).
Гомоцистеин определяется только в некоторых частных медицинских центрах. Клинические анализы маркеров окислительного стресса в медицинских учреждениях не проводятся, некоторые маркеры определяются только в исследовательских целях.
Изучение окислительного стресса и связь его с разными заболеваниями, определение маркеров окислительного стресса, антиоксидантная терапия для подавления окислительного стресса – это актуальные научные медицинские темы. В ближайшие годы следует ожидать новых достижений в этих направлениях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Яшин Я., Веденин А., Яшин А. 60 лет хроматографическому приборостроению // Аналитика. 2016. № 2. С. 84–98.
2. Яшин А.Я. Амперометрическое детектирование в ВЭЖХ и проточно-инжекционных системах. Обзор // Зав.Лаб. 2012. Т. 78. № 2. С. 4–15.
3. Rozet E., Morello R., Lecomte F., Martin G.B., Chiap P., Crommen J., Boos K.S., Hubert Ph. Performances of a multidimensional on-line SPE-LC-ECD method for the determination of three major catecholamines in native human urine: Validation, risk and uncertainty assessments // Journal of Chromatography B. 2006. V. 844. P. 251–260.
4. Jing F.-C., Chen H., Li C.-L. Rapid Determination of Dopamine and Its Metabolites During in vivo Cerebral Microdialysis by Routine High Performance Liquid Chromatography With Electrochemical Detection // Biomedical and Environmental Sciences. 2007. V. 20. P. 317–320.
5. Głуd B.K., Stańczak K.I., Woźniak A., Pakszys W.
Determination of a catecholamines and the total antioxidant potential of blood plasma by use of an improved RPHPLC-ED assay // Acta Chromatographica. 2004. V. 14. P. 142–148.
6. Patel B.A., Arundell M., Parker K.H., Yeoman M.S., O’Hare D. Simple and rapid determination of serotonin and catecholamines in biological tissue using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2005. V. 818. P. 269–276.
7. Карцова А.А., Сидорова А.А., Казаков В.А., Бессонова Е.А., Яшин А.Я. Определение катехоламинов методом капиллярного электрофореза и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией // Журнал аналитической химии. 2004. Т. 59. № 8. С. 826–831.
8. Karimi M., Carl J.L., Loftin S., Perlmutter J.S. Modified high-performance liquid chromatography with electrochemical detection method for plasma measurement of levodopa, 3-O-methyldopa, dopamine, carbidopa and 3,4-dihydroxyphenyl acetic acid // Journal of Chromatography B. 2006. V. 836. P. 120–123.
9. Mathien P., Greffe J., Philip T., Chanvin F. Using HPLC in early detection of neuroblastoma. Mass screening for childhood cancer // Peak. 1991. № 3. P. 10–11.
10. Parrott S., Lambos-Senas L., Sentenac S., Denoroy L., Renaud B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2007. V. 850. P. 303–309.
11. Hubbard K.E., Wells A., Owens T., Tagen M., Fraga C.H., Stewart C.F. Determination of dopamine, serotonin, and their metabolites in pediatric cerebrospinal fluid by isocratic high performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection // Biomedical chromatography. 2010. V. 24. P. 626–631.
12. Lee M.-S., Cheng F.-C. Determination of Plasma Serotonin and 5-Hydroxyindoleacetic Acid in Healthy Subjects and Cancer Patients // Clinical Chemistry. 2000. V. 46. P. 422–423.
13. Agui L., Pena-Farfal C., Yanez-Sedeno P., Pingarron J.M.
Electrochemical determination of homocysteine at a gold nanoparticle-modified electrode // Talanta. 2007. V. 72. P. 412–420.
14. Малинка М.К., Полуэктова М.В., Яшин А.Я Определение гомоцистеина в плазме методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т. 7. Вып. 1. С. 60–65.
15. Hiraku Y.; Murata M., Kawanishi S. Determination of intracellular glutathione and thiols by high performance liquid chromatography with a gold electrode at the femtomole level: comparison with a spectroscopic assay // Biochim. Biophys. Acta 2002. 1570. 47−52.
16. White P.C., Lawrence N.S., Davis J., Compton R.G.
Electrochemical determination of thiols-a perspective // Electroanalysis. 2002. V. 14. P. 89–98.
17. Petrlova J. Mikelova R., Stejskal K., Kleckerova A., Zitka O., Petrek J., Havel L., Zehnalek J., Adam V., Trnkova L. Simultaneous determination of eight biologically active thiol compounds using gradient elution-liquid chromatography with Coul-Array detection // J. Sep. Sci. 2006. № 29. P. 1 166−1 173.
18. Ashfag S., Abramson J. L., Jones D.P., Rhodes S.D. et al. The relationship between plasma levels of oxidized and reduced thiols and early atherosclerosis in healthy adults // J. Am. Coll.Cardiol. 2006. V. 47. P. 1 005–1 007.
19. Яшин Я.И., Яшин А.Я. ВЭЖХ маркеров окислительного стресса // Аналитика. 2011. № 1.
С. 34–43.
20. Яшин Я.И., Яшин А.Я., Черноусова Н.И., Федина П.А. Диагностика окислительного стресса – предшественника опасных болезней и преждевременного старения и антиоксидантная терапия // В кн.: "Anti-age medicine: наука оставаться молодым" / Колл. ав. под ред. А.И.Труханова. М.: Асвомед, 2012. С. 455–489.
21. Spadaro A., Bousquet E., Santagati N.A., Vittorio F., Ronsisvalle G. Simple analysis of glutathione in human colon carcinoma cells and epidermoid human larynx carcinoma cells by HPLC with electrochemical detection // Chromatographia. 2005. 62. 11−15.
22. Park H.J., Mah E., Bruno R.S. Validation of high-performance liquid chromatography-boron-doped diamond detection for assessing hepatic glutathione redox status // Anal. Biochem. 2010. 407. 151−159.
23. Forman H.J., Zhang H., Rinna A. Glutathione. Overview of its protective roles , measurement and biosynthesis // Mol. Aspects Med. 2009. V. 30. P. 1–12.
24. Revelo I.A., Piedate J.A.P., Oliveira-Brett A.M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-0xo-7,8-dihidroguanine and 8-oxo-7,8-dihidroguanosine in the presence of uric acid // Talanta. 2004. V. 63. P. 323–331.
25. Kasai H. A new automated method to analyze urinary 8-hydroxydeoxyguanosine by a HPLC-electrochemical detector system // J. Radiat. Res. (Tokyo). 2003. V. 44. P. 185–189.
26. Domiyan A.M., Peraica M. Determination of 8-hydroxi-2-deoxyguanosine in urine using HPLC with electrochemical detection // Archives of industrial hygiene and toxicology. 2008. V. 59. P. 277–282.
27. Есипов Д.С., Сидоренко Е.В., Есипова О.В., Горбачева Т.А., Невредимова Т.С., Крушинский А.Л., Кузенков В.С., Реутов В.П. Определение отношения 8-оксо-2-дезоксигуанозина к 2-дезоксигуанозину в ДНК с помощью ВЭЖХ с амперометрической детекцией // Вестник МИТХТ. 2010. Т. 5. С. 62–68.
28. Williamson K.S., Hensley K., Floyd R.A. HPLC with electrochemical detection analysis of 3-nitrotyrosine in human plasma. In Methods in biological oxidative stress / Ed. Hensley K. // Humana Press. 2003. P. 151–160.
29. Acworth I.N., Ullucci P.A., Gamache P.H. Determination of oxidized and reduced COQ10 and COQ9 in human plasma-serum HPLC-ECD. In Advanced protocols in oxidative stress / Ed. D.Armstrong. N.Y. // Humana press, 2008.
30. Khan A., Khan M., Igbal Z., Ahmad L., Shah Y., Watson D.S. Determination of lipoic acid in human plasma by HPLC-ECD using liquid-liquid and solid-phase extraction: Method development, validation and optimization of experimental parameters // Journal of Chromatography B. 2010. V. 878. P. 2 782–2 788.
31. Khan A., Khan M.I., Iqbal Z., Shah Y., Ahmad L. et al.
A new HPLC method for the simultaneous determination of ascorbic acid and aminothiols in human plasma and erythrocytes using electrochemical detection // Talanta. 2011. V. 84. P. 789–801.
32. Roy S., Venojarvi M., Khanna S., Sen C.K. Simultaneous detection of tocopherols and tocotrienols in biological samples using HPLC-coulometric electrode array // Methods ensymol. 2002. V. 352. P. 326–332.
33. Yamada H., Yoshizawa H., Hayase T. Sensitive determination method of estradiol in plasma using HPLC with electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2002. V. 775. P. 209–2 13.
34. Mashayekhi S.O., Ghandforoush-Sattari M., Hain R.D.W. Rapid and sensitive quantitation of morphine using HPLC with electrochemical detection. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 2008. V. 33. P. 419–427.
35. Backofen U., Matysik F.M., Lunte C.E. Determination of cannabinoids in hair with electrochemical detection // Journal of Chromatography A. 2002. V. 942. P. 259–269.
36. Chinami C., Giuliani V., Menarini A. et al. Electrochemical detection of tobramycin or gentamicin according to the European Pharmacopoeia analytical method // Journal of Chromatography A. 2007. V. 1 139. P. 53–56.
37. Catlow J.T., Barton R.D., Clements M., Gillespie T.A., Goodwin M., Swanson S.P. Analysis of olanzapine in human plasma utilizing reversed-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 1995. V. 668. P. 85–90.
38. Prabakar B.J.R., Narayanan S.S. Amperometric determination of paracetomol by a surface modified cobalt hexacyanoferrate graphite wax composite electrode // Talanta. 2007. V. 72. P. 1 818–1 827.
39. Blazewicz A., Orlicz-szczesna G., Szczesny P., Prystupa A., Grzywa-Celinska A., Trojnor M.
A comparative analytical assessment of iodides in healthy and pathological human thyroids based on IC-PAD method preceded by microwave digestion // Journal of Chromatography B. 2011.
V. 879. P. 573–578.
40. Hojo K., Hakamata H., Ito A., Kotani A., Furukawa C.
Determination of total cholesterol in serum by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography A. 2007. V. 1 166. P. 135–141.
41. Chin-Chen M.-L., Rambla-Alegre A., Durgavanshi A.,
Bose D., Esteve-Romero J. Rapid and sensitive determination of nicotine in formulations and biological fluid using micellar liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2010. V. 878. P. 2 397–2 402.
42. Sim H.-J., Jeong J.-S., Kwon H.-J., Kong T.H. et al. HPLC with pulsed amperometric detection for sorbitol as a biomarker for diabetic neuropathy // Journal of Chromatography B. 2009. V. 877. P. 1 607–1 611.
43. Bolarinwa A., Linseisen J. Validated application of a new high-performance liquid chromatographic method for the determination of selected flavonoids and phenolic acids in human plasma using electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2005. V. 823. P. 143–151.
Амперометрическое детектирование используется в окислительном режиме со стеклоуглеродом в качестве рабочего электрода при постоянном потенциале [2]. Применяется оно и в импульсном режиме, в частности для прямого определения аминокислот и сахаров [2]. А в восстановительном режиме его используют значительно реже. Амперометрический детектор определяет полифенолы, тиолы, ароматические амины, соединения с сопряженными двойными связями.
Перечислим основные достоинства амперометрического детектора [2]:
• низкий предел обнаружения, то есть высокая чувствительность;
• высокая селективность к соединениям, имеющим гидроксильную или аминную группы в бензольном кольце, а также к тиолам;
• возможность превращения амперометрического детектирования в 3D при регистрации при разных потенциалах;
• возможность напрямую (без дериватизации) определять аминокислоты и сахара в импульсном режиме в щелочной среде;
• малый объем ячейки детектора, позволяющий применять его в капиллярном, микро- и даже нанорежимах;
• низкая стоимость.
В последнее десятилетие большой интерес вызывает определение маркеров многих заболеваний с целью их ранней диагностики. Начали выходить специализированные журналы по этим вопросам: Journal of Biomarkers, Journal of Molecular Biomarkers
and Diagnosis и др. Перечень основных маркеров, определяемых амперометрическим детектором в биологических жидкостях напрямую без концентрирования и дериватизации, приведен в таблице.
Рассмотрим подробнее наиболее важные применения ВЭЖХ с амперометрическим детектором для определения маркеров заболеваний.
Катехоламины выполняют биологическую функцию краткосрочной адаптации и регулируют многие процессы метаболизма, включая реакцию гидродинамического артериального давления, а также передачу нервного сигнала в синапсах симпатической нервной системы. В первом случае катехоламины могут рассматриваться как гормоны, во втором случае – как нейромедиаторы. Клинический интерес к уровню катехоламинов в биологических жидкостях связан с проблемой физиологии адаптивных сигналов стресса (точность оценки заболевания и прогноз).
Типичная реакция на стресс – активация синтеза и повышение содержания в крови катехоламинов. Под влиянием стресса они выделяются в кровь и мобилизуют организм для активной мышечной деятельности, как при внешней, так и внутренней угрозе, связанной с различными болезнями. Определение катехоламинов является тестом дифференциальной диагностики симптоматических форм артериальной гипертонии, особенно при наличии феохромацитомы или нейробластомы.
Важную роль катехоламины играют также в поддержании биологической функции гомеостаза (постоянства состава внутренней среды и устойчивости основных физиологических функций). Для оценки состояния организма определяют содержание катехоламинов (адреналина, норадреналина, дофамина), их предшественников и метаболитов в биологических жидкостях (плазма крови, моча, слюна).
Нейробластома – наиболее часто встречающаяся опухоль у детей, это вторая причина смертности в возрасте до 5 лет. При ранней диагностике нейробластомы на первой стадии возможно полное излечение. Даже при диагностировании второй стадии болезни процент излечения детей составляет около 90%. Очень важно обследовать детей до одного года. В высокоразвитых странах (США, Канаде, Франции, Японии) производится скрининг детей до 5 лет. В нашей стране чаще всего диагностируют нейробластому на 3–4 стадии, когда полное излечение затруднено и требует больших финансовых затрат.
Ранняя диагностика нейробластомы возможна по содержанию ее биохимических маркеров в моче – ванилилминдальной (ВМК) и гомованилиновой (ГВК) кислот: у 90% больных их концентрация возрастает. Достоверность диагноза увеличивается, если одновременно измерять и ванилилактоновую (ВЛ) кислоту. Определение этих маркеров проводят с помощью ВЭЖХ с амперометрическим детектором. Время разделения около 10 мин на колонке в обращенно-фазовом варианте с ион-парными элюентами [9]. Жидкостный хроматограф с амперометрическим детектором в окислительном режиме позволяет надежно определять примеси ВМК, ГВК и ВЛ
в моче без дериватизации и концентрирования.
Очень большое диагностическое значение имеет определение серотонина и его метаболита. Серотонин влияет на ритм сердца, сон, секс, терморегуляцию, а также на синтез мелатонина, психические заболевания, такие как депрессия, шизофрения. По метаболиту серотонина 5-гидроксииндол уксусной кислоты (5-HIAA) можно диагностировать карциноидные синдромы (см.: Харт К. Секреты серотонина. Минск, 1998. 315 с.).
Не так давно установлена связь между повышенным содержанием гомоцистеина в крови человека и ростом числа коронарных заболеваний. Кардиологические пациенты с наиболее высоким уровнем гомоцистеина погибают раньше, чем больные с низким содержанием гомоцистеина в плазме. Гомоцистеин – мощный стимул развития атеросклероза, это главный маркер для оценки атерогенного риска. Если уровень циркулирующего в крови гомоцистеина превышает 8–10 мкмоль/л, то высок риск тромбоза и сердечно-сосудистых заболеваний независимо от других показателей. В норме содержание гомоцистеина порядка 9,6 мкмоль/л, с возрастом его содержание увеличивается. При концентрации гомоцистеина 15 мкмоль/л опасность в 100 раз больше, чем при высоком холестерине. Смертельно опасное содержание – свыше 50 мкмоль/л.
Негативное действие гомоцистеина заклю-чается в том, что он поражает сосудистую стенку артерий. При поражении коронарных артерий сердца происходит сужение сосудов, возникает недостаточность кровообращения, что в конечном итоге может привести к инфаркту миокарда. Поражение сосудов головного мозга может вызвать инсульт. Многие исследователи приходят к заключению, что основной виновник сердечно-сосудистых заболеваний в большей мере гомоцистеин, а не холестерин. Поэтому необходим экспрессный, достоверный и сравнительно простой метод анализа гомоцистеина. Для определения гомоцистеина (и сопутствующих цистеина и метионина) применяют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). На сегодняшний момент опубликовано более 600 статей по анализу гомоцистеина методом ВЭЖХ, а в 1997 году вышла книга К.С.МакКалли "Гомоцистеиновая революция". В качестве детектирующих систем используют спектрофотометрические, флуоресцентные и амперометрические. Первые две требуют предварительной дериватизации, а амперометрический детектор определяет гомоцистеин напрямую без дериватизации [14].
В плазме крови гомоцистеин присутствует в виде свободного, симметричного дисульфида и ассиметричных дисульфидов, связанных через дисульфидную связь с белком (80–85%). Следовательно, общее для всех аналитических методик состоит в переводе всех связанных форм гомоцистеина в свободный с помощью восстанавливающих агентов. Находят применение следующие восстановители: боргидриды натрия и калия, водорастворимые фосфины, такие как трибутилфосфин, трис-(2-карбоксилэтилфосфин), трифенилфосфин, а также дитиотриетол, который работает в широком диапазоне температур. Для приготовления калибровочных растворов можно использовать чистый гомоцистеин фирмы Sigma. Для оценки правильности измерений гомоцистеина в плазме крови применяют контрольные растворы гомоцистеина "Ликвичек гомоцистеин" фирмы Bio-Rad
с концентрациями: 10 мкмоль/л (7,5–12,5 мкмоль/л) и 45 мкмоль/л (36–54 мкмоль/л).
Сегодня в нашей стране и за рубежом интенсивно ведутся исследования по разработке методов и приборов для диагностики окислительного стресса. При неблагоприятных условиях (плохая экология, облучение, стресс, загрязненная и некачественная пища, некоторые болезни, курение, алкоголизм, наркомания и пр.) в биологических жидкостях может возрастать концентрация высокореакционных кислородных и азотных соединений, включая и свободные радикалы (супероксидный радикал кислорода, гидроксид-радикал, пероксинитрит и др.). Свободные радикалы в допустимых концентрациях необходимы для некоторых биологических процессов, а также для нормальной функции иммунной системы и ее компонентов. Однако их избыточное содержание приводит к развитию патологических изменений в организме человека. Такое состояние называют окислительным (оксидантным) стрессом. Подавляющее большинство теорий старения также основаны на свободнорадикальном окислении. Многочисленные научные публикации подтверждают, что большинство тяжелых болезней вызывается окислительным стрессом: атеросклероз, онкологические, нарушения мозгового кровообращения, сахарный диабет, воспалительные, ревматоидные, нейродегенеративные (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, шизофрения, аутизм). Поэтому исключительно важно диагностировать начало развития окислительного стресса, пока он не перерос в серьезное заболевание. Окислительный стресс может быть быстро определен путем измерения общего антиоксидантного статуса, то есть суммарного содержания антиоксидантов в организме человека. Для более достоверного детального анализа необходимо оценивать окислительный стресс по специальным маркерам, которые появляются в биологических жидкостях при окислении липидов, белков, углеводов и молекул ДНК.
Современные жидкостные хроматографы с амперометрическим и спектрофотометрическим детекторами с изократическим и градиентным насосами позволяют определять основные маркеры окислительного стресса. Маркеры окисления белков, липидов, молекул ДНК в разных биологических жидкостях (плазма или сыворотка крови, моча, слюна, конденсат выдыхаемого воздуха) детектируются на уровне 10–10 – 10–9 г/см3. На жидкостных хроматографах отработаны методические рекомендации по определению наиболее представительных маркеров окислительного стресса: тирозина, 3.4-DOPA, м-тирозина, о-тирозина, 3-хлортирозина, 3-нитротирозина, малонового диальдегида, 8-гидрокси-2ґ-дезокси-гуанозина, цистеина, глутатиона, мочевой кислоты [2, 19, 20]. На таких хроматографах можно измерять окислительно-восстановительный по-
тенциал биологических жидкостей по соотношению восстановленных и окисленных форм биологически активных молекул, в частности, глутатиона (GSH и GSSG), мочевой кислоты, цистеина к цистину, убихинола к убихинону, нитрита к нитрату и др. Это позволит с большой достоверностью оценить состояние здоровья человека, так как практически нет болезней, при которых бы окислительно-восстановительный баланс не нарушался [19, 20].
Массовое внедрение таких хроматографов позволит выявлять начало развития опасных болезней на самой ранней стадии и, используя антиоксидантную терапию, на основании нашего банка данных содержания антиоксидантов в пищевых продуктах, напитках, лекарствах, витаминах, БАДах, экстрактах лекарственных трав (всего более 1 400 продуктов), не допустить дальнейшего их развития. Благодаря этому могут значительно сократиться затраты на лечение, увеличиться продолжительность жизни и снизиться смертность населения Российской Федерации.
Обследования по раннему выявлению окислительного стресса можно организовать не только в больницах, диагностических центрах, но и в профилакториях, санаториях, домах отдыха и других оздоровительных учреждениях. Стоимость таких обследований будет доступна большинству населения нашей страны. Выявление окислительного стресса (предшественника болезней) и его устранение – это шаг к новой профилактической медицине.
Кроме приведенных маркеров, амперометрическим детектором можно измерять в биологических жидкостях большинство наркотиков и наркотических средств [34, 35], лекарств [36–38], а также биологически активные соединения: иодид [39], холестерин [40], никотин [41], сорбитол [42] и др. При исследовании биодоступности природных антиоксидантов определяют содержание флавоноидов и фенольных кислот в плазме человека [43].
***
Таким образом, ВЭЖХ с амперометрическим детектированием имеет большие перспективы в клинических и терапевтических анализах. Определение катехоламинов уже проводят в некоторых медицинских учреждениях. В Нижегородском диагностическом центре в лаборатории, руководимой Т.А.Басалгиной, для диагностики ферохромацитомы – рака надпочечников – регулярно проводят измерения катехоламинов в суточной моче методом ВЭЖХ с амперометрическим детектированием. Проведено более 12 тыс. анализов. Также регулярно проводятся анализы катехоламинов методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором в биохимической лаборатории Российского кардиологического научно-производственного комплекса
(зав. лаб., д.м.н. проф. В.Н.Титов).
Гомоцистеин определяется только в некоторых частных медицинских центрах. Клинические анализы маркеров окислительного стресса в медицинских учреждениях не проводятся, некоторые маркеры определяются только в исследовательских целях.
Изучение окислительного стресса и связь его с разными заболеваниями, определение маркеров окислительного стресса, антиоксидантная терапия для подавления окислительного стресса – это актуальные научные медицинские темы. В ближайшие годы следует ожидать новых достижений в этих направлениях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Яшин Я., Веденин А., Яшин А. 60 лет хроматографическому приборостроению // Аналитика. 2016. № 2. С. 84–98.
2. Яшин А.Я. Амперометрическое детектирование в ВЭЖХ и проточно-инжекционных системах. Обзор // Зав.Лаб. 2012. Т. 78. № 2. С. 4–15.
3. Rozet E., Morello R., Lecomte F., Martin G.B., Chiap P., Crommen J., Boos K.S., Hubert Ph. Performances of a multidimensional on-line SPE-LC-ECD method for the determination of three major catecholamines in native human urine: Validation, risk and uncertainty assessments // Journal of Chromatography B. 2006. V. 844. P. 251–260.
4. Jing F.-C., Chen H., Li C.-L. Rapid Determination of Dopamine and Its Metabolites During in vivo Cerebral Microdialysis by Routine High Performance Liquid Chromatography With Electrochemical Detection // Biomedical and Environmental Sciences. 2007. V. 20. P. 317–320.
5. Głуd B.K., Stańczak K.I., Woźniak A., Pakszys W.
Determination of a catecholamines and the total antioxidant potential of blood plasma by use of an improved RPHPLC-ED assay // Acta Chromatographica. 2004. V. 14. P. 142–148.
6. Patel B.A., Arundell M., Parker K.H., Yeoman M.S., O’Hare D. Simple and rapid determination of serotonin and catecholamines in biological tissue using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2005. V. 818. P. 269–276.
7. Карцова А.А., Сидорова А.А., Казаков В.А., Бессонова Е.А., Яшин А.Я. Определение катехоламинов методом капиллярного электрофореза и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией // Журнал аналитической химии. 2004. Т. 59. № 8. С. 826–831.
8. Karimi M., Carl J.L., Loftin S., Perlmutter J.S. Modified high-performance liquid chromatography with electrochemical detection method for plasma measurement of levodopa, 3-O-methyldopa, dopamine, carbidopa and 3,4-dihydroxyphenyl acetic acid // Journal of Chromatography B. 2006. V. 836. P. 120–123.
9. Mathien P., Greffe J., Philip T., Chanvin F. Using HPLC in early detection of neuroblastoma. Mass screening for childhood cancer // Peak. 1991. № 3. P. 10–11.
10. Parrott S., Lambos-Senas L., Sentenac S., Denoroy L., Renaud B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2007. V. 850. P. 303–309.
11. Hubbard K.E., Wells A., Owens T., Tagen M., Fraga C.H., Stewart C.F. Determination of dopamine, serotonin, and their metabolites in pediatric cerebrospinal fluid by isocratic high performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection // Biomedical chromatography. 2010. V. 24. P. 626–631.
12. Lee M.-S., Cheng F.-C. Determination of Plasma Serotonin and 5-Hydroxyindoleacetic Acid in Healthy Subjects and Cancer Patients // Clinical Chemistry. 2000. V. 46. P. 422–423.
13. Agui L., Pena-Farfal C., Yanez-Sedeno P., Pingarron J.M.
Electrochemical determination of homocysteine at a gold nanoparticle-modified electrode // Talanta. 2007. V. 72. P. 412–420.
14. Малинка М.К., Полуэктова М.В., Яшин А.Я Определение гомоцистеина в плазме методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т. 7. Вып. 1. С. 60–65.
15. Hiraku Y.; Murata M., Kawanishi S. Determination of intracellular glutathione and thiols by high performance liquid chromatography with a gold electrode at the femtomole level: comparison with a spectroscopic assay // Biochim. Biophys. Acta 2002. 1570. 47−52.
16. White P.C., Lawrence N.S., Davis J., Compton R.G.
Electrochemical determination of thiols-a perspective // Electroanalysis. 2002. V. 14. P. 89–98.
17. Petrlova J. Mikelova R., Stejskal K., Kleckerova A., Zitka O., Petrek J., Havel L., Zehnalek J., Adam V., Trnkova L. Simultaneous determination of eight biologically active thiol compounds using gradient elution-liquid chromatography with Coul-Array detection // J. Sep. Sci. 2006. № 29. P. 1 166−1 173.
18. Ashfag S., Abramson J. L., Jones D.P., Rhodes S.D. et al. The relationship between plasma levels of oxidized and reduced thiols and early atherosclerosis in healthy adults // J. Am. Coll.Cardiol. 2006. V. 47. P. 1 005–1 007.
19. Яшин Я.И., Яшин А.Я. ВЭЖХ маркеров окислительного стресса // Аналитика. 2011. № 1.
С. 34–43.
20. Яшин Я.И., Яшин А.Я., Черноусова Н.И., Федина П.А. Диагностика окислительного стресса – предшественника опасных болезней и преждевременного старения и антиоксидантная терапия // В кн.: "Anti-age medicine: наука оставаться молодым" / Колл. ав. под ред. А.И.Труханова. М.: Асвомед, 2012. С. 455–489.
21. Spadaro A., Bousquet E., Santagati N.A., Vittorio F., Ronsisvalle G. Simple analysis of glutathione in human colon carcinoma cells and epidermoid human larynx carcinoma cells by HPLC with electrochemical detection // Chromatographia. 2005. 62. 11−15.
22. Park H.J., Mah E., Bruno R.S. Validation of high-performance liquid chromatography-boron-doped diamond detection for assessing hepatic glutathione redox status // Anal. Biochem. 2010. 407. 151−159.
23. Forman H.J., Zhang H., Rinna A. Glutathione. Overview of its protective roles , measurement and biosynthesis // Mol. Aspects Med. 2009. V. 30. P. 1–12.
24. Revelo I.A., Piedate J.A.P., Oliveira-Brett A.M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-0xo-7,8-dihidroguanine and 8-oxo-7,8-dihidroguanosine in the presence of uric acid // Talanta. 2004. V. 63. P. 323–331.
25. Kasai H. A new automated method to analyze urinary 8-hydroxydeoxyguanosine by a HPLC-electrochemical detector system // J. Radiat. Res. (Tokyo). 2003. V. 44. P. 185–189.
26. Domiyan A.M., Peraica M. Determination of 8-hydroxi-2-deoxyguanosine in urine using HPLC with electrochemical detection // Archives of industrial hygiene and toxicology. 2008. V. 59. P. 277–282.
27. Есипов Д.С., Сидоренко Е.В., Есипова О.В., Горбачева Т.А., Невредимова Т.С., Крушинский А.Л., Кузенков В.С., Реутов В.П. Определение отношения 8-оксо-2-дезоксигуанозина к 2-дезоксигуанозину в ДНК с помощью ВЭЖХ с амперометрической детекцией // Вестник МИТХТ. 2010. Т. 5. С. 62–68.
28. Williamson K.S., Hensley K., Floyd R.A. HPLC with electrochemical detection analysis of 3-nitrotyrosine in human plasma. In Methods in biological oxidative stress / Ed. Hensley K. // Humana Press. 2003. P. 151–160.
29. Acworth I.N., Ullucci P.A., Gamache P.H. Determination of oxidized and reduced COQ10 and COQ9 in human plasma-serum HPLC-ECD. In Advanced protocols in oxidative stress / Ed. D.Armstrong. N.Y. // Humana press, 2008.
30. Khan A., Khan M., Igbal Z., Ahmad L., Shah Y., Watson D.S. Determination of lipoic acid in human plasma by HPLC-ECD using liquid-liquid and solid-phase extraction: Method development, validation and optimization of experimental parameters // Journal of Chromatography B. 2010. V. 878. P. 2 782–2 788.
31. Khan A., Khan M.I., Iqbal Z., Shah Y., Ahmad L. et al.
A new HPLC method for the simultaneous determination of ascorbic acid and aminothiols in human plasma and erythrocytes using electrochemical detection // Talanta. 2011. V. 84. P. 789–801.
32. Roy S., Venojarvi M., Khanna S., Sen C.K. Simultaneous detection of tocopherols and tocotrienols in biological samples using HPLC-coulometric electrode array // Methods ensymol. 2002. V. 352. P. 326–332.
33. Yamada H., Yoshizawa H., Hayase T. Sensitive determination method of estradiol in plasma using HPLC with electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2002. V. 775. P. 209–2 13.
34. Mashayekhi S.O., Ghandforoush-Sattari M., Hain R.D.W. Rapid and sensitive quantitation of morphine using HPLC with electrochemical detection. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 2008. V. 33. P. 419–427.
35. Backofen U., Matysik F.M., Lunte C.E. Determination of cannabinoids in hair with electrochemical detection // Journal of Chromatography A. 2002. V. 942. P. 259–269.
36. Chinami C., Giuliani V., Menarini A. et al. Electrochemical detection of tobramycin or gentamicin according to the European Pharmacopoeia analytical method // Journal of Chromatography A. 2007. V. 1 139. P. 53–56.
37. Catlow J.T., Barton R.D., Clements M., Gillespie T.A., Goodwin M., Swanson S.P. Analysis of olanzapine in human plasma utilizing reversed-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 1995. V. 668. P. 85–90.
38. Prabakar B.J.R., Narayanan S.S. Amperometric determination of paracetomol by a surface modified cobalt hexacyanoferrate graphite wax composite electrode // Talanta. 2007. V. 72. P. 1 818–1 827.
39. Blazewicz A., Orlicz-szczesna G., Szczesny P., Prystupa A., Grzywa-Celinska A., Trojnor M.
A comparative analytical assessment of iodides in healthy and pathological human thyroids based on IC-PAD method preceded by microwave digestion // Journal of Chromatography B. 2011.
V. 879. P. 573–578.
40. Hojo K., Hakamata H., Ito A., Kotani A., Furukawa C.
Determination of total cholesterol in serum by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography A. 2007. V. 1 166. P. 135–141.
41. Chin-Chen M.-L., Rambla-Alegre A., Durgavanshi A.,
Bose D., Esteve-Romero J. Rapid and sensitive determination of nicotine in formulations and biological fluid using micellar liquid chromatography with electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2010. V. 878. P. 2 397–2 402.
42. Sim H.-J., Jeong J.-S., Kwon H.-J., Kong T.H. et al. HPLC with pulsed amperometric detection for sorbitol as a biomarker for diabetic neuropathy // Journal of Chromatography B. 2009. V. 877. P. 1 607–1 611.
43. Bolarinwa A., Linseisen J. Validated application of a new high-performance liquid chromatographic method for the determination of selected flavonoids and phenolic acids in human plasma using electrochemical detection // Journal of Chromatography B. 2005. V. 823. P. 143–151.
Отзывы читателей
