eng
Выпуск #5/2016
А.Макаров
Масс-спектрометры Thermo Fisher Scientific. Orbitrap – 10 лет прогресса
Масс-спектрометры Thermo Fisher Scientific. Orbitrap – 10 лет прогресса
Просмотры: 4481
Орбитальная ионная ловушка, Орбитрэп (Orbitrap), считается одним из самых современных и новейших масс-анализаторов в масс-спектрометрии. Первый прибор с его использованием компания Thermo Fisher Scientific выпустила только в 2005 году.
В течение минувшего десятилетия конструкция масс-спектрометров на основе Orbitrap непрерывно совершенствовалась, а их возможности расширялись. Всего было создано около полутора десятков моделей спектрометров, относящихся к трем основным семействам: LTQ Orbitrap, Q Exactive/Exactive и Orbitrap Fusion. Настоящий обзор посвящен рассмотрению их свойств и возможностей.
В течение минувшего десятилетия конструкция масс-спектрометров на основе Orbitrap непрерывно совершенствовалась, а их возможности расширялись. Всего было создано около полутора десятков моделей спектрометров, относящихся к трем основным семействам: LTQ Orbitrap, Q Exactive/Exactive и Orbitrap Fusion. Настоящий обзор посвящен рассмотрению их свойств и возможностей.
Исторически первое упоминание об использовании электростатической орбитальной ловушки ионов относится к 1923 году [1]. Тогда К.Х.Кингдон (K.H.Kingdon) опубликовал свои эксперименты по улавливанию заряженных частиц устройством, состоящим из закрытого металлического цилиндра с фланцами и пропущенного внутри него провода. Исследователь наблюдал, что ионы, имеющие достаточную начальную тангенциальную скорость, не сталкивались с проволокой, а вращались вокруг нее. Однако долгое время эта возможность захвата заряженных частиц в электростатических полях использовалась лишь изредка в спектроскопии [2–4]. Интерес к данной задаче вернулся в 1990-е годы и был обусловлен интенсивным развитием масс-спектрометрических методов анализа. В основе разработки лежало "желание построить новый спектрометр, который позволит избежать недостатков предыдущих инструментов, таких как сложность и размеры анализаторов ионного циклотронного резонанса с фурье-преобразованием (фурье-ИЦР); низкая чувствительность, динамический диапазон и разрешение (в те времена) ортогональных времяпролетных (TOF) анализаторов; ограниченная точность определения массы в анализаторах ионная ловушка" [4].
Первая орбитальная ионная ловушка была разработана в конце 1990-х годов [3, 5]. Она представляла собой центральный электрод веретенообразной формы, помещенный внутрь двух точно его повторяющих симметричных внешних электродов, электрически изолированных друг от друга. Конструкция позволяла улавливать ионы электрическим полем, с максимальной точностью контролировать их движение и измерять частоты аксиальных колебаний по току, наведенному на внешних электродах ловушки и детектируемому дифференциальным усилителем. Затем широкополосный частотный сигнал оцифровывался и конвертировался путем преобразования Фурье в частотный спектр, а затем – в спектр отношений массы к заряду [6].
Хотя первые прототипы масс-анализатора Orbitrap представляли собой действительно успешное доказательство принципа его работы, однако для реализации ее аналитического потенциала потребовалось также решить задачу обеспечения достаточного числа ионов, приходящих извне в орбитальную ионную ловушку. Для их накопления была разработана специальная газонаполненная искривленная линейная ионная ловушка (С-образная ловушка), сделавшая возможным сопряжение импульсно работающего Orbitrap с непрерывными источниками ионов, такими как электрораспылители [7]. Чтобы ионы, собранные в квадрупольной С-образной ловушке, инжектировать в Orbitrap, радиочастотное удерживающее напряжение на ее электродах импульсно меняется на сильное поле, выталкивающее ортогонально искривленной оси устройства. В результате этого ионы с каждым отношением массы к заряду фокусируются на входном отверстии в орбитальную ловушку, втягиваются туда электродинамическим полем и начинают когерентные аксиальные колебания (рис.1).
МАСС-СПЕКТРОМЕТР
С ТАНДЕМОМ ОРБИТАЛЬНОЙ
И ЛИНЕЙНОЙ ИОННЫХ ЛОВУШЕК
В начале 2000-х годов развитие протеомики и метаболомики требовало появления прибора с масс-анализатором, сочетающего в себе эффективность фурье-ИЦР спектрометров с компактностью, простотой и способностью выделять и фрагментировать ионы. И здесь использование Orbitrap в тандемной масс-спектрометрии (МС / МС) смогло предоставить решение, обеспечивающее необходимо высокое разрешение (ВР), точность определения масс (ТМ) и скорость измерений при весьма скромных требованиях к лабораторному пространству и эксплуатационному обслуживанию. Вполне естественным первым шагом на этом пути стало объединение в одном приборе масс-анализаторов с орбитальной и линейной ионными ловушками. Последняя очень хорошо зарекомендовала себя в области протеомики, поскольку обеспечивала хорошую совместимость с жидкостной хроматографией (ЖХ) по скорости и высокой чувствительности и поддерживала несколько уровней фрагментации и выделения ионов-предшественников (возможности МСn) путем диссоциации, индуцированной столкновениями (CID).
Такой прибор впервые разработала и представила в 2005 году компания Thermo Electron (ныне Thermo Fisher Scientific) [8]. Модель получила название LTQ Orbitrap. Ее оригинальная конструкция (рис.2) обеспечила необходимую гибкость, позволяющую записывать как МС-, так и МСn-спектры либо с помощью масс-анализатора Orbitrap, чтобы получить максимальное значение ВР / ТМ, либо с помощью линейной ионной ловушки, обеспечивающей максимальную скорость и чувствительность. Наиболее используемым режимом в нем стало применение орбитальной ионной ловушки для получения спектров в широком массовом диапазоне, и линейной – для параллельного сбора МС / МС-спектров. Это позволило достигнуть максимальной точности и разрешения при обнаружении ионов-предшественников в спектрах сложных смесей и проводить тандемные масс-спектрометрические эксперименты с чувствительностью и скоростью, соответствующими временным масштабам ЖХ.
Масс-спектрометр LTQ Orbitrap на момент своего появления решал сразу несколько насущных проблем исследований в области протеомики по идентификации пептидов. Во-первых, высокоточное измерение ВР / ТМ, реализованное в приборе, значительно упрощало идентификацию ионов по их m / z в сложных смесях, поскольку позволяло использовать для этого поиск по базам данных. Так, при полном сканировании в масс-анализаторе Orbitrap с разрешающей способностью 120 000 по ширине пика на полувысоте (FWHM) на m / z 400 а.е.м. экспериментатор за одно хроматографическое разделение получает список возможных предшественников, структуру которых можно уточнить с помощью фрагментации с использованием CID.
Во-вторых, LTQ Orbitrap оказался пригодным для применения в качестве инструмента количественного анализа. Cтабильность точного измерения массы позволила создавать узкие окна для количественного извлечения ионов предшественников, высокая разрешающая способность – снижать влияние химического шума, а быстрота сканирования (3–5 Гц) в сочетании с тандемной МС обеспечили возможность однозначного подтверждения содержания аналитов даже при их низком уровне. И, наконец, в-третьих, в приборе была применена автоматическая регулировка усиления (АРУ), которая представляет собой короткое предварительное сканирование в линейной ионной ловушке для того, чтобы определить величину ионного тока в интересующем диапазоне масс. Это позволяет поддерживать необходимое количество ионов в С-образной ловушке для последующего масс-анализа, устраняя проблемы с величиной пространственного заряда и поддерживая высокую чувствительность.
Однако несмотря на успех в исследовательском сообществе, LTQ Orbitrap имел несколько существенных ограничений. Прежде всего, используемый в приборе метод фрагментации на основе CID хотя и хорошо показал себя для идентификации пептидов, однако был неприменим для фрагментов белковых молекул с посттрансляционными модификациями (ПТМ), такими как, например, фосфорилирование и гликозилирование. Кроме того, на практике точное измерение массы в тандемных МС-экспериментах оказывалось недостаточно быстрым для применения вместе с ЖХ сверхвысокого давления.
Чтобы решить эти проблемы, в следующей модели масс-спектрометра – LTQ Orbitrap XL – была улучшена конструкция С-образной ловушки и реализованы дополнительные методы фрагментации, такие как диссоциация, индуцируемая столкновениями при повышенной энергии (HCD), и позднее – диссоциация при переносе электрона (ETD). Включение камеры высокоэнергетичных столкновений (HCD-камера) в конструкцию Orbitrap было произведено по примеру ее применения в тройных квадрупольных и квадруполь-времяпролетных масс-спектрометрах. В приборе она располагалась непосредственно после С-образной ловушки [9] (рис.3). Это было сделано в первую очередь для того, чтобы за счет удаленного расположения уменьшить перетекание газа из HCD-камеры в масс-анализатор с линейной ионной ловушкой. Кроме того, такая геометрия делала прибор более компактным и обеспечивала бóльшую гибкость в эксплуатации. Для решения задач протеомики объединение Orbitrap с камерой активных столкновений было в частности полезно тем, что в ней генерируются ионы иммония, естественного маркера при секвенировании пептидов de novo. И это не только облегчает процесс установления их структуры, но и содействует активному расширению библиотек фрагментации.
В LTQ Orbitrap XL вместе с орбитальной ионной ловушкой также впервые был использован еще один метод фрагментации, ETD. Он был разработан в 2004 году для улучшения определения аминокислотных последовательностей в белках и пептидах, а также установления локализации, структуры и содержания неустойчивых ПТМ. Первоначально в качестве ETD-реагента использовались анионы флуорантена, которые генерировались в источнике, расположенном за камерой активных столкновений. Через нее и С-образную ловушку они попадали в масс-анализатор с линейной ионной ловушкой, где, собственно, и реагировали с пептидными катионами [11]. Поскольку при этом фрагментируются преимущественно пептидные цепи, посттрансляционные модификации сохраняются без изменений. Фрагментация по методу ETD носит неэргодичный характер (т. е. результат зависит от пути протекания процесса), чувствительна к зарядовой плотности и способствует выявлению предшественников с высоким зарядом и низким m / z. Объединение данных, получаемых таким образом, с данными CID, позволило разработать оптимизированный метод дерева решений, используемый в масс-спектрометрическом анализе [12]. Он нашел применение не только для идентификации и определения расположения ПТМ, но и для установления самих пептидных последовательностей.
По своим характеристикам LTQ Orbitrap XL в конце 2000-х годов позволял решать большое число исследовательских задач. Он обеспечивал разрешение 60 000 (на m / z 400 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и массовую точность 1–3 ppm в диапазоне m / z до 4 000 а.е.м. Однако требовалось дальнейшее повышение чувствительности и скорости сканирования для того, чтобы работать со сложными белковыми смесями, не прибегая к их глубокому предварительному фракционированию и обработке.
Для решения этих задач компания Thermo Fisher Scientific выпустила в 2009 году новый масс-спектрометр LTQ Orbitrap Velos (рис.4) [13]. Он обладал более высокой чувствительностью (в 3–5 раз в режиме полного сканирования и до 10 раз в режиме МС / МС). Это было достигнуто за счет изменения интерфейса ввода ионов путем использования новой ионной оптики (S-линза) и создания новой двухкамерной конструкции масс-анализатора с линейной ионной ловушкой.
Назначением S-линзы, кольцевых радиочастотных устройств, служила эффективная фокусировка ионов в узком ионном пучке для увеличения надежности и эффективности его транспортировки. В двухкамерной ионной ловушке первая камера высокого давления была оптимизирована для выделения и фрагментации ионов, вторая – низкого давления – для их ускоренного анализа. Все вместе это позволяло увеличить поток ионов в систему, а затем быстро и эффективно ими манипулировать. Кроме того, теперь время впрысков ионов для тандемной МС определялось не по различным предварительным сканированиям, выполняемым для каждого предшественника (АРУ), а по ионным интенсивностям, измеренным в результате предыдущих полных спектров (предиктивная АРУ). Тем самым также сокращалась длительность аналитического процесса, что дало возможность увеличить частоту сканирований до 10 Гц и сделать в протеомике обыденным анализ нефракционированных образцов [4].
Еще одно изменение в конструкции LTQ Orbitrap Velos коснулось расположения камеры высокоэнергетичных столкновений. Ее приблизили к C-образной ловушке, отделив их друг от друга лишь одной диафрагмой. Это позволило использовать вытягивающее поле для инжекции ионов в орбитальную ионную ловушку также и для более полного извлечения из HCD-камеры фрагментов пептидов с низкими значениями m / z. Тем самым достигалась бóльшая точность результатов количественного анализа (в особенности изобарно меченых мультиплексированных белковых образцов). Кроме того, это позволяло при существующей разрешающей способности МС увеличить скорость анализа в тандемной масс-спектрометрии.
ORBITRAP – ТЕХНОЛОГИИ
ДЛЯ РУТИННЫХ АНАЛИЗОВ
Хотя преимущества гибридной платформы Orbitrap для решения количественных и качественных задач в области протеомики получили широкое признание, эти системы были слишком сложными и дорогими, чтобы превратиться в рутинный аналитический инструмент обычных лабораторий – токсикологических, пищевых, экологических и других. Однако потребность в таком приборе существовала. Решая эту задачу, в Thermo Fisher Scientific была разработана платформа Exactive [14] (рис.5). В ней технологии, обеспечивающие высокое разрешение и точное определение массы, органично сочетаются с настольными габаритами прибора и его относительно невысокими стоимостью и сложностью.
Прежде всего, в масс-спектрометре отсутствует масс-анализатор линейная ионная ловушка. В приборе используется только Orbitrap для регистрации полного спектра и HCD-камера для фрагментации ионов без выделения предшественника. Такая конструкция потребовала развития новых методов АРУ, рассчитанных на использование одной только орбитальной ионной ловушки. Решение было найдено путем дополнительного включения в прибор детектора заряда.
Несмотря на внешнюю простоту конструкции, Exactive обеспечивает высокое значение ВР / ТМ. Он поддерживает разрешение 100 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и точность измерения массы 2–5 ppm при впечатляющем динамическом диапазоне (более 4 000) и скорости переключения полярности менее секунды. Благодаря этому прибор нашел активное применение для количественного и качественного скрининга как известных, так и неизвестных соединений. Он с успехом использовался в лабораториях, занимающихся анализом в области пищевой безопасности и охраны окружающей среды [15, 16], биоанализом [17, 18], клиническим анализом [19, 20], определением наркотических веществ и допинга [21–23], исследованиями в области протеомики и метаболомики [24, 25].
В дальнейшем платформа Exactive развивалась в направлении создания ГХ-МС спектрометра Exactive GC, в целом аналогичного по характеристикам своему ЖХ-МС аналогу, а также более продвинутой модели Exactive Plus (Exactive Plus EMR) (рис.6). Последний прибор был оснащен усиленной ионной оптикой (S-линзами), поддерживал несколько источников ионизации (электрораспыление, нагреваемое электрораспыление и химическую ионизацию при атмосферном давлении), обеспечивал разрешение до 140 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и точность измерения массы менее 1 ppm. Кроме того, увеличенное быстродействие Exactive Plus (до 12 сканирований в секунду) позволяло использовать спектрометр вместе с ультра-ВЭЖХ. В сочетании с возможностью увеличить доступный диапазон масс со стандартного 50–6 000 а.е.м. до расширенного (EMR, extended mass range) 350–20 000 а.е.м. это превращало прибор в практически универсальный инструмент, пригодный для большинства рутинных исследований в области биологии и биофармацевтики, то есть там, где требовался анализ моноклональных антител, их конъюгатов с лекарственными препаратами, белками и белковыми комплексами в их нативном состоянии [26].
Однако несмотря на все замечательные характеристики рассмотренных масс-спектрометров семейства Exactivе, ограничением их возможностей в анализе тандемных МС-спектров служит неспособность к выделению ионов-предшественников. Она была реализована лишь в 2011 году с появлением Q Exactive, нового прибора компании Thermo Fisher, оснащенного, наряду с масс-анализатором Orbitrap и HCD-камерой, также квадрупольным масс-фильтром [27] (рис.7). К этому моменту распространение ультра-ВЭЖХ также потребовало более высоких значений скорости накопления данных, в особенности в связи с необходимостью увеличения числа анализируемых точек при количественном анализе пиков ЖХ. Для того чтобы получать тандемные МС-спектры с высокими значениями ВР, но за более короткие временные интервалы, в Q Exactive применили новую технологию обработки сигнала, регистрируемого в масс-анализаторе Orbitrap, которая получила название усовершенствованного фурье-преобразования (eFT) [28]. Объединение возможностей S-линз, HCD-фрагментации, быстрой и эффективной квадрупольной фильтрации ионов и их регистрации в орбитальной ионной ловушке с технологией eFT обеспечили высокое качество и скорость записи данных. В системе было достигнуто полное распараллеливание МС / МС-процессов: в то время когда в Orbitrap предыдущий цикл регистрации спектра еще продолжался, C-образная ловушка и HCD-камера уже начинали заполняться заново. Благодаря этим своим конструктивным особенностям Q Exactive позволяет записывать с высоким разрешением до 12 тандемных МС-спектров в секунду и является отличным решением для использования в системах с ультра-ВЭЖХ [27].
Последующее развитие платформы Q Exactive, поддерживающей диапазон масс 50–6 000 а.е.м и разрешение до 140 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц), привело к созданию двух специализированных решений Q Exactive Focus (рис.8) и Q Exactive Plus. Первый из этих масс-спектрометров сориентирован на анализ молекул с небольшими молекулярными весами (диапазон масс до 2 000 a.e.m.) и имеет характеристики, в целом аналогичные Q Exactive по производительности, точности измерения массы, динамическому диапазону. Однако будучи предназначенным преимущественно для рутинных анализов, Q Exactive Focus уступает своему предшественнику в разрешении (70 000 на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и не поддерживает мультиплексность.
Совсем иные, превосходные, возможности предоставляет Q Exactive Plus (рис.9). Это – мощный аналитический инструмент, поддерживающий рекордное на момент своего появления разрешение – 280 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц). В данном масс-спектрометре дальнейшее развитие получила система ввода и формирования ионного пучка – Advanced Active Beam Guide (AABG). В ней вслед за ВЧ-линзами располагается система, предназначенная для снижения уровня шума и освобождения от нейтральных частиц и состоящая из предфильтра (инжекционного флатаполя) и искривленного флатаполя. Усовершенствованию подверглась и конструкция квадрупольного масс-фильтра, который приобрел сегментированность для улучшения передачи ионов и создания изолирующих окон (Advanced quadrupole technology, AQT). Как и его предшественник, Q Exactive Plus поддерживает анализ молекул в диапазоне масс 50–6 000 а.е.м., частоту МС / МС-сканирований до 12 Гц и позволяет выделять до 10 ионов-предшественников в одном спектре. Этот прибор компания Thermo Fisher Scientific в настоящее время предлагает как один из вариантов платформы Q Exactive BioPharma – специализированного решения, которое оптимально удовлетворяет требованиям, необходимым в исследованиях природных и денатурированных белков и пептидов.
НА ПУТИ
К МАКСИМАЛЬНЫМ ВОЗМОЖНОСТЯМ
Стремясь достичь наилучших значений рабочих параметров своих приборов с масс-анализатором Orbitrap, компания Thermo Fisher Scientific усовершенствовала практически все основные элементы их конструкции в семействах LTQ Orbitrap, Q Exactive / Exactive. В том числе и самый главный – орбитальную ионную ловушку. Уже в 2011 году ее новая, высокополевая версия использовалась в модели Orbitrap Elite [29] (рис.10), а затем в Q Exactive HF (рис.11) и инновационной серии трибридных приборов Orbitrap Fusion.
Улучшенный анализатор Orbitrap по сравнению со своим предшественником обнаруживал в целом почти вчетверо более высокую эффективность. Он использовал удвоенную рабочую частоту и благодаря eFT-технологии позволял дополнительно достичь двукратного увеличения разрешающей способности (240 000 на m / z 400 а.е.м. для 768 мс процесса). Естественно, что реализовать эти возможности было невозможно без достаточной точности обработки электродов в конструкции самого масс-анализатора и одновременной модификации предусилителя и смежной ионной оптики, обеспечивающей надежность ионопередачи [30]. Эти и другие изменения нашли свое отражение в устройстве Orbitrap Elite и последующих приборов.
В целом и Orbitrap Elite, и Q Exactive HF, будучи старшими и последними моделями в своих семействах спектрометров, сохранили все достигнутые преимущества предшественников, превзойдя их в скорости накопления данных, убыстрении тандемных МС-сканирований (частота до 15 и 18 Гц соответственно), увеличении числа идентифицируемых ионов и, как следствие, возрастании возможностей проникновения в тонкости строения веществ [4]. В силу этого, названные приборы нашли активное применение как инструменты, используемые вместе с ультра-ВЭЖХ для распознавания и установления структуры молекул биологически активных соединений, включая достаточно крупные пептидные фрагменты (до 4 000 и 6 000 а.е.м соответственно),
в экологическом и пищевом анализе, клиническом и биоанализе, метаболомике и протеомике, липидомике и допинг-контроле [4]. Совершенно не случайно компания Thermo Fisher Scientific сегодня предлагает Q Exactive HF как старшую модель платформы Q Exactive BioPharma, поддерживающую режим HMR (High Mass Range)
с расширенным до 8 000 а.е.м диапазоном анализируемых масс.
Однако с появлением моделей Orbitrap Elite и Q Exactive HF дальнейшее совершенствование семейств, к которым принадлежат эти масс-спектрометры, оказалось проблематичным, поскольку достигли предела технологические возможности, заложенные в каждую из их базовых конструкций. И в силу этого разработчики Thermo Fisher Scientific поступили вполне ожидаемо: они создали совершенно новый прибор, Orbitrap Fusion, в котором впервые объединили преимущества гибридных систем Orbitrap – линейная ионная ловушка и Orbitrap – квадрупольный масс-фильтр [31] (рис.12).
Такая архитектура спектрометра привела к существенному увеличению его производительности и разрешающей способности, достигшей 500 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц). Использование одновременно трех масс-анализаторов позволяет полностью распараллелить процессы и обеспечить максимальный ионный ток. Благодаря этому становятся доступными сложные режимы анализа, в которых один из анализаторов (линейная ионная ловушка или квадруполь) применяется для изолирования ионов, а два других (Orbitrap и линейная ионная ловушка) – для их детектирования. Подобный подход делает доступным использование всех из ранее упоминавшихся типов фрагментации (HCD, CID, ETD), также совершенно нового, EThcD, представляющего собой комбинацию ETD и HCD и получившего название диссоциации, вызванной переносом электронов и высокоэнергетичными столкновениями (electron-transfer / higher-energy collision dissociation) [32]. При этом фрагменты и ионы-предшественники могут анализироваться на любом уровне МСn, что открывает путь к новым типам масс-спектрометрических экспериментов, позволяющим решать сложные вопросы установления структуры веществ [33].
Среди новых возможностей – отказ от классического подхода TopN, в котором в качестве критерия выбора иона-предшественника для дальнейших исследований используется интенсивность его сигнала. В Orbitrap Fusion это можно делать, опираясь на другие критерии, например на величину m / z, которую определяет сам пользователь прибора. Кроме того, присутствующий режим Top Speed предполагает возможность произвольно устанавливать число уровней в тандемных МС-экспериментах вплоть до максимального, который в данной модели спектрометра равен 20, то есть значительно выше, чем в Orbitrap Elite и Q Exactive HF. Использование режима Top Speed крайне полезно в тех случаях, когда спектрометр используется совместно с хроматографом и требуется получить максимальное число точек, приходящихся на пик хроматограммы.
Значительные преимущества в масс-спектро-метрии малых молекул, имеющих важное значение в исследованиях в области гликомики, метаболомики и липидомики, создает возможность комбинированного применения методов фрагментации. Использование HCD-фрагментации, рождающей осколочные фрагменты меньшего веса, и последующий их анализ в линейной ионной ловушке (для достижения максимальной чувствительности и степени параллелизации) или в Orbitrap (для наибольшего разрешения) позволяет получать всю необходимую информацию при наименьшем числе стадий МСn.
Более эффективным стал используемый в Orbitrap Fusion ETD-источник ионов реагентов, названный EASY-ETD. Он основан на применении таунсендовского разряда вместо прежнего источника с электронным ударом [34]. Благодаря заложенной в прибор возможности выборочно определять ионы-мишени, этот источник позволяет ускорить идентификацию ионов с более высоким зарядом и низким значением m / z, которые наиболее чувствительны к ETD-фрагментации.
Чтобы решить задачи по быстрому и точному ТМТ-анализу*, в Orbitrap Fusion впервые разработали и применили новый метод выделения фрагментов, основанный на одновременном отборе нескольких предшественников (SPS, synchronous precursor selection) на стадии МС3. Для этого в масс-анализаторе линейная ионная ловушка используется так называемая многополосная фильтрация (multi-notch isolation), позволяющая в этом режиме на стадии МС2 выделять до 20 ионов-предшественников [35] (для сравнения максимальное число выделяемых предшественников в обычном режиме и в спектрометрах предыдущих моделей – 10). Благодаря SPS также значительно возрастает точность и селективность ТМТ-МС3-анализа [36]. Кроме того, за счет параллельности процессов выделения и идентификации ионов скорость ТМТ-МС3-экспериментов становится сопоставимой с той, что была прежде в тандемной МС. При этом существенно увеличивается количественная точность измерений.
ORBITRAP –
САМЫЕ ПЕРЕДОВЫЕ РЕШЕНИЯ
Десятилетие своих разработок по созданию и совершенствованию конструкции спектрометров на основе Orbitrap компания Thermo Fisher Scientific завершила сразу двумя новыми моделями:
ГХ-МС/МС-спектрометром Q Exactive GC и масс-
спектрометром Orbitrap Fusion Lumos, соединившем в себе последние достижения трибридной технологии. Оба прибора впервые были представлены в конце 2015 года, а позже экспонировались на мюнхенской выставке analytica 2016.
Хромато-масс-спектрометр Q Exactive GC (рис.13) на данный момент представляет собой один из наиболее продвинутых вариантов объединения газового хроматографа и масс-спектрометра. Он отличается высокой разрешающей способностью 100 000 (на m / z 272 а.е.м.) и точностью измерения масс 1–3 миллионных долей. в массовом диапазоне 50–3 000 а.е.м. Это одна из двух моделей ГХ-МС-спектрометра, которая разработана в Thermo Fisher Scientific на основе масс-анализатора Orbitrap. В другой, Exactive GC, отсутствует квадруполь, и, соответственно, невозможен тандемный МС-анализ. Спектрометр Q Exactive GC поддерживает до 18 сканирований в секунду в режиме тандемной МС и позволяет обнаруживать до 10 предшественников за сканирование. Дополнительное удобство для пользователя создает реализованная в приборе возможность смены хроматографической колонки и источника ионизации без отключения вакуума прибора. С его более подробным описанием можно ознакомиться в материале, ранее опубликованном в журнале "Аналитика". [37].
Как и все другие масс-спектрометры на основе Orbitrap, Q Exactive GC предназначен для решения самого широкого круга задач в исследовательских и промышленных лабораториях: от чисто химического и химико-технологического анализа до скрининга безопасности пищевых продуктов, судебно-медицинской токсикологической экспертизы и борьбы с допингом. К примеру, самый первый из произведенных приборов был установлен в октябре 2015 года в Вестфальском университете им. Вильгельма г. Мюнстер (Германия) в Мюнстерском центре технологий электрохимической энергии и исследований аккумуляторов (Muenster Electrochemical Energy Technology (MEET) Battery Research Center, University of Muenster, Germany) [38]. Основным доводом в пользу выбора этого прибора университетскими учеными было названо уникальное значение ВР / ТМ, позволяющее с высокой точностью оценивать структуру и содержание микроследовых количеств токсичных фторированных и нефторированных фосфатов, которые образуются в разрабатываемых электролитах для автомобильных литий-ионных аккумуляторов.
Характеристики Q Exactive GC получили высокую оценку в марте 2016 года на престижной конференции Pittcon 2016, где хромато-масс-спектрометр получил награду "Выбор ученых" (SelectScience Award) [39] (рис.14). Как сказано в тексте пресс-релиза: "Система Q Exactive GC впервые объединила возможности газовой хроматографии с высокой разрешающей способностью и точностью измерения массы (ВР / ТМ) масс-спектрометрии Orbitrap, чтобы в одном анализе получать полную характеристику [исследуемых веществ]. Предназначение системы состоит в увеличении производительности ГХ-МС в сочетании с возможностями обнаружения, идентификации и количественной оценки, чтобы предоставить пользователям более глубокое, чем когда-либо прежде, представление об их образцах".
Вторая новинка – масс-спектрометр Orbitrap Fusion Lumos (рис.15). По реализованным возможностям это наиболее совершенный из приборов на основе технологии Orbitrap, которые были созданы Thermo Fisher Scientific в течение последнего десятилетия. Как легко увидеть из названия и схемы (рис.16), он представляет собой следующую ступень в развитии семейства Orbitrap Fusion.
По сравнению с предшественником, Orbitrap Fusion Lumos почти не отличается по базовым физическим характеристикам. У него аналогичное разрешение (500 000 на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и точность измерения массы. Совпадают максимальная скорость сканирования в режиме МС / МС и мультиплексность. Основные усовершенствования коснулись, в первую очередь, системы ввода и формирования ионного пучка. Вместо радиочастотных линз (S-линз) в спектрометре используются тонко настраиваемые высокопроизводительная передаточная трубка и электродинамическая ионная воронка. Они предназначены для увеличения потока ионов и расширения пределов их обнаружения. Для снижения уровня шума и освобождения от нейтральных частиц в приборе установлена улучшенная система управления ионным пучком, AABG.
Усовершенствованная конструкция квадрупольного масс-фильтра, AQT, призвана обеспечить максимальные селективность и эффективность в создании изолирующих окон и передачи ионов в масс-анализатор Orbitrap. А эффективный транспорт ионов с высокой молекулярной массой стабильно поддерживает продвинутая технология создания сверхвысокого вакуума (ниже 2 · 10–10 мм. рт. ст.). Дальнейшее развитие получили также ETD / EThcD-технологии, превратившиеся в Orbitrap Fusion Lumos в ETD HD-диссоциацию с переносом электрона высокого динамического диапазона (high dynamic range ETD), позволяющую расширить динамический диапазон и пределы детектирования в данном типе фрагментации.
В целом все перечисленные изменения направлены, прежде всего, на расширение аналитических возможностей Orbitrap Fusion Lumos и предопределяют его преимущественное использование в научных исследованиях сложных биологических объектов. Прежде всего, это касается улучшенных возможностей в пептидном анализе, изучении структуры интактных белков и моноклональных антител. Как продемонстрировано Thermo Fisher Scientific, применение нового прибора также высокоперспективно для выполнения работ в области гликопротеомики, липидомики, метаболомики [40].
За десятилетие развития масс-спектрометрии на основе технологии Orbitrap компания Thermo Fisher Scientific разработала и выпустила на рынок более полутора десятков различных приборов. Бóльшая часть из них до сих пор доступна потребителям для заказа. Спектрометры отличаются друг от друга по своим характеристикам и специализации. Одни предназначены для рутинного контроля, другие – для поддержки серьезных и сложных научных изысканий в самых передовых областях естествознания. Для того чтобы облегчить выбор инструмента, наиболее соответствующего решаемым задачам, на сайте разработчика даже приводится таблица, которая позволяет наглядно оценить характеристики наиболее востребованных масс-спектрометров Orbitrap [41] (см. таблицу). Но, помимо названной практической пользы, в ней отчетливо прослеживается и тенденция: от модели к модели неуклонно возрастают разрешающая способность, быстродействие, мультиплексность и, как следствие, аналитические возможности. Причем это происходит при сохранении и даже уменьшении габаритов. В предельном варианте такое движение можно представить как попытку создания идеального лабораторного инструмента, позволяющего исследователю получать исчерпывающую качественную и количественную информацию о химическом объекте, с которым тот работает. И большой отрезок пути в этом направлении уже успешно пройден.
ЛИТЕРАТУРА:
Kingdon K.H. A method for the neutralization of electron space charge by positive ionization at very low gas pressures // Phys. Rev. 1923. V. 21. P. 408–418.
Perry R.H., Cooks R.G., Noll R.J. Orbitrap mass spectrometry: instrumentation, ion motion and applications // Mass Spec. Rev. 2008. V. 27. P. 661– 699.
Makarov A. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: a high-performance technique of mass analysis // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 1156–1162.
Eliuk S., Makarov A. Evolution of Orbitrap Mass Spectrometry Instrumentation // Annual Rev. Anal. Chem. 2015. V. 8. P. 61–80. http://www.annualreviews.org.
Makarov A.A. Mass spectrometer. US Patent 5886346, 1999.
Макаров А. Масс-спектрометрия на основе орбитальной ловушки ионов: достижения и перспективы // Аналитика. 2013. № 5. С. 30–36.
Hu Q., Noll R.J., Li H., Makarov A., Hardman M., Cooks R.G. The Orbitrap: a new mass spectrometer // J. Mass Spectrom. 2005. V. 40. P. 430–443.
Makarov A., Denisov E., Kholomeev A., Balschun W., Lange O., Strupat K., Horning S. Performance evaluation of a hybrid linear ion trap/Orbitrap mass spectrometer // Anal. Chem. 2006. V. 78. P. 2113–2120.
Olsen J.V., Macek B., Lange O., Makarov A., Horning S., Mann M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis // Nat. Methods. 2007. V. 4. P. 709–12.
Syka J.E., Coon J.J., Schroeder M.J., Shabanowitz J., Hunt D.F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 9528–9533.
McAlister G.C., Phanstiel D., Good D.M., Berggren W.T., Coon J.J. Implementation of electron-transfer dissociation on a hybrid linear ion trap–Orbitrap mass spectrometer // Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 3525–3534.
Swaney D.L., McAlister G.C., Coon J.J. Decision tree-driven tandem mass spectrometry for shotgun proteomics // Nat. Methods. 2008. V. 5. P. 959–964.
Olsen J.V., Schwartz J.C., Griep-Raming J., Nielsen M.L., Damoc E., Denisov E., Lange O., Remes P., Taylor D., Splendore M., Wouters E.R., Senko M. A dual pressure linear ion trap Orbitrap instrument with very high sequencing speed // Mol. Cell Proteomics. 2009. V. 8. P. 2759–2769.
Bateman K.P., Kellmann M., Muenster H., Papp R., Taylor L. Quantitative-qualitative data acquisition using a benchtop Orbitrap mass spectrometer // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2009. V. 20. P. 1441–1450.
Blay P., Hui J.P.M., Chang J., Melanson J.E. Screening for multiple classes of marine biotoxins by liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry // Anal. Bioanal. Chem. 2011. V. 400. P. 577–585.
Edison S.E., Lin L.A., Parrales L. Practical considerations for the rapid screening for pesticides using ambient pressure desorption ionization with high-resolution mass spectrometry // Food Addit. Contam., Part A. 2011. V. 28. P. 1393–1404.
Scigelova M., Makarov A. Advances in bioanalytical LC-MS using the Orbitrap mass analyzer // Bioanalysis. 2009. V. 1. P. 741–754.
Korfmacher W. High-resolution mass spectrometry will dramatically change our drug-discovery bioanalysis procedures // Bioanalysis. 2011. V. 3. P. 1169–1171.
Jiwan J.-L.H., Wallemacq P., Herent M.-F. HPLC-high resolution mass spectrometry in clinical laboratory? // Clin. Biochem. 2010. V. 44. P. 136–147.
Henry H., Sobhi H.R., Scheibner O., Dromiski M., Nimkar S.B., Rochat B. Comparison between a high resolution single stage Orbitrap and a triple quadrupole mass spectrometer for quantitative analyses of drugs // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2012. V. 26. № 5. P. 499–509.
Beuck S., Bornatsch W., Lagojda A., Schanzer W., Thevis M. Development of liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analytical assays for the determination of HIF stabilizers in preventive doping research // Drug Test. Analysis. 2011. V. 3. P. 756–770.
Guddat S., Solymos E., Orlovius A., Thomas A., Sigmund G., Geyer M., Thevis M., Schanzer W. High-throughput screening for various classes of doping agents using a new ‘dilute-and-shoot’ liquid chromatography / tandem mass spectrometry multi-targeted approach // Drug Test. Analysis. 2011. V. 3. Р. 836–850.
Moulard Y., Bailly-Chouriberry L., Boyer S., Garcia P., Popot M.-A., Bonnaire Y. Use of benchtop Exactive high resolution and high mass accuracy orbitrap mass spectrometer for screening in horse doping control // Anal. Chim. Acta. 2011. V. 700. P. 126–136.
Lu W., Clasquin M.F., Melamud E., Amador-Noguez D., Caudy A.A., Rabinowitz J.D. Metabolomics analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a standalone Orbitrap mass spectrometer // Anal. Chem. 2010. V. 82. P. 3212–3221.
Geiger T., Cox J., Mann M. Proteomics on an Orbitrap benchtop mass spectrometer using all-ion fragmentation // Mol. Cell. Proteomics. 2010. V. 9. P. 2252–2261.
Xuan Y., Debaene F., Stojko J., Beck A., Dorsselaer A.V., Cianférani S., Bromiski M. Monoclonal antibody and related product characterization under native conditions using a benchtop mass spectrometer // https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AN-597-monoclonal-antibody-63950-AN63950-en.pdf.
Michalski A., Damoc E., Hauschild J.P., Lange O., Wieghaus A., Makarov A., Nagaraj N., Cox J., Mann M., Horning S. Mass spectrometry-based proteomics using Q Exactive, a high-performance benchtop quadrupole Orbitrap mass spectrometer //
Mol. Cell Proteomics. 2011. 10:M111.011015.
Lange O., Damoc E., Wieghaus A., Makarov A. Enhanced Fourier transform for Orbitrap mass spectrometry // Int. J. Mass Spectrom. 2014. V. 369. P. 16–22.
Michalski A., Damoc E., Lange O., Denisov E., Nolting D., Müller M., Viner R., Schwartz J., Remes P., Belford M., Dunyach J.J., Cox J., Horning S., Mann M., Makarov A. Ultra high resolution linear ion trap Orbitrap mass spectrometer (Orbitrap Elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes // Mol.Cell Proteomics. 2012. 11(3):O111.013698.
Makarov A., Denisov E., Lange O. Performance evaluation of a high-field Orbitrap mass analyzer //
J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2009. V. 20. P. 1391–1396.
Senko M.W., Remes P.M., Canterbury J.D., Mathur R., Song Q., Eliuk S.M., Mullen C., Earley L., Hardman M., Blethrow J.D., Bui H., Specht A., Lange O., Denisov E., Makarov A., Horning S., Zabrouskov V. Novel parallelized quadrupole/linear ion trap/Orbitrap tribrid mass spectrometer improving proteome coverage and peptide identification rates // Anal. Chem. 2013. V. 85. P. 11710–11714.
Frese C.K., Zhou H., Taus T., Altelaar A.F., Mechtler K., Heck A.J.R., Shabaz M. Unambiguous phosphosite localization using electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD) // J. Proteome Res. 2013. V. 12. P. 1520–1525.
Wu S.W., Pu T.H., Viner R., Khoo K.H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides // Anal. Chem. 2014. V. 86. P. 5478–5486.
Earley L., Anderson L.C., Bai D.L., Mullen C., Syka J.E., English A.M., Dunyach J.J., Staf-ford G.C.Jr., Shabanowitz J., Hunt D.F., Compton P.D. Front-end electron transfer dissociation: a new ionization source // Anal. Chem. 2013. V. 85. P. 8385–8390.
McAlister G.C., Nusinow D.P., Jedrychowski M.P., Wuhr M., Huttlin E.L., Erickson B.K., Rad R., Haas W., Gygi S.P. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes // Anal. Chem. 2014. V. 86. P. 7150–7158.
Ting L., Rad R., Gygi S.P., Haas W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics // Nat. Meth. 2011. V. 8. P. 937–940.
Гордеев К., Шахнович И. Аналитическая спектрометрия сегодня: от новых технологий к новым открытиям // Аналитика. 2016. № 1. С. 36–61.
Пресс-релиз. University of Muenster Using Orbitrap-based GC-MS to Advance Lithium-Ion Battery Research, http://news.thermofisher.com/press-release/thermo-scientific/university-muenster-using-obitrap-based-gc-ms-advance-lithium-ion-ba.
Пресс-релиз. Thermo Fisher Scientific Wins SelectScience Awards at Pittcon 2016, http://news.thermofisher.com/press-release/aacc-2015/thermo-fisher-scientific-wins-selectscience-awards-pittcon-2016.
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/BR-64392-LC-MS-Orbitrap-Fusion-Lumos-Tribrid-BR64392-EN.pdf
http://www.thermofisher.com/ru/ru/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-systems/orbitrap-lc-ms/orbitrap-lc-ms-comparison-chart.html
* ТМТ-анализ – один из методов в тандемной масс-спектрометрии, применяемых для установления структуры биомакромолекул – белков, пептидов, нуклеиновых кислот. Основан на использовании специальных изобарических химических меток (ТМТ – tandem mass tag).
* Название поэмы конструктора спектрометров ЯМР А.Н. Любимова из самиздата 1980 года.
Первая орбитальная ионная ловушка была разработана в конце 1990-х годов [3, 5]. Она представляла собой центральный электрод веретенообразной формы, помещенный внутрь двух точно его повторяющих симметричных внешних электродов, электрически изолированных друг от друга. Конструкция позволяла улавливать ионы электрическим полем, с максимальной точностью контролировать их движение и измерять частоты аксиальных колебаний по току, наведенному на внешних электродах ловушки и детектируемому дифференциальным усилителем. Затем широкополосный частотный сигнал оцифровывался и конвертировался путем преобразования Фурье в частотный спектр, а затем – в спектр отношений массы к заряду [6].
Хотя первые прототипы масс-анализатора Orbitrap представляли собой действительно успешное доказательство принципа его работы, однако для реализации ее аналитического потенциала потребовалось также решить задачу обеспечения достаточного числа ионов, приходящих извне в орбитальную ионную ловушку. Для их накопления была разработана специальная газонаполненная искривленная линейная ионная ловушка (С-образная ловушка), сделавшая возможным сопряжение импульсно работающего Orbitrap с непрерывными источниками ионов, такими как электрораспылители [7]. Чтобы ионы, собранные в квадрупольной С-образной ловушке, инжектировать в Orbitrap, радиочастотное удерживающее напряжение на ее электродах импульсно меняется на сильное поле, выталкивающее ортогонально искривленной оси устройства. В результате этого ионы с каждым отношением массы к заряду фокусируются на входном отверстии в орбитальную ловушку, втягиваются туда электродинамическим полем и начинают когерентные аксиальные колебания (рис.1).
МАСС-СПЕКТРОМЕТР
С ТАНДЕМОМ ОРБИТАЛЬНОЙ
И ЛИНЕЙНОЙ ИОННЫХ ЛОВУШЕК
В начале 2000-х годов развитие протеомики и метаболомики требовало появления прибора с масс-анализатором, сочетающего в себе эффективность фурье-ИЦР спектрометров с компактностью, простотой и способностью выделять и фрагментировать ионы. И здесь использование Orbitrap в тандемной масс-спектрометрии (МС / МС) смогло предоставить решение, обеспечивающее необходимо высокое разрешение (ВР), точность определения масс (ТМ) и скорость измерений при весьма скромных требованиях к лабораторному пространству и эксплуатационному обслуживанию. Вполне естественным первым шагом на этом пути стало объединение в одном приборе масс-анализаторов с орбитальной и линейной ионными ловушками. Последняя очень хорошо зарекомендовала себя в области протеомики, поскольку обеспечивала хорошую совместимость с жидкостной хроматографией (ЖХ) по скорости и высокой чувствительности и поддерживала несколько уровней фрагментации и выделения ионов-предшественников (возможности МСn) путем диссоциации, индуцированной столкновениями (CID).
Такой прибор впервые разработала и представила в 2005 году компания Thermo Electron (ныне Thermo Fisher Scientific) [8]. Модель получила название LTQ Orbitrap. Ее оригинальная конструкция (рис.2) обеспечила необходимую гибкость, позволяющую записывать как МС-, так и МСn-спектры либо с помощью масс-анализатора Orbitrap, чтобы получить максимальное значение ВР / ТМ, либо с помощью линейной ионной ловушки, обеспечивающей максимальную скорость и чувствительность. Наиболее используемым режимом в нем стало применение орбитальной ионной ловушки для получения спектров в широком массовом диапазоне, и линейной – для параллельного сбора МС / МС-спектров. Это позволило достигнуть максимальной точности и разрешения при обнаружении ионов-предшественников в спектрах сложных смесей и проводить тандемные масс-спектрометрические эксперименты с чувствительностью и скоростью, соответствующими временным масштабам ЖХ.
Масс-спектрометр LTQ Orbitrap на момент своего появления решал сразу несколько насущных проблем исследований в области протеомики по идентификации пептидов. Во-первых, высокоточное измерение ВР / ТМ, реализованное в приборе, значительно упрощало идентификацию ионов по их m / z в сложных смесях, поскольку позволяло использовать для этого поиск по базам данных. Так, при полном сканировании в масс-анализаторе Orbitrap с разрешающей способностью 120 000 по ширине пика на полувысоте (FWHM) на m / z 400 а.е.м. экспериментатор за одно хроматографическое разделение получает список возможных предшественников, структуру которых можно уточнить с помощью фрагментации с использованием CID.
Во-вторых, LTQ Orbitrap оказался пригодным для применения в качестве инструмента количественного анализа. Cтабильность точного измерения массы позволила создавать узкие окна для количественного извлечения ионов предшественников, высокая разрешающая способность – снижать влияние химического шума, а быстрота сканирования (3–5 Гц) в сочетании с тандемной МС обеспечили возможность однозначного подтверждения содержания аналитов даже при их низком уровне. И, наконец, в-третьих, в приборе была применена автоматическая регулировка усиления (АРУ), которая представляет собой короткое предварительное сканирование в линейной ионной ловушке для того, чтобы определить величину ионного тока в интересующем диапазоне масс. Это позволяет поддерживать необходимое количество ионов в С-образной ловушке для последующего масс-анализа, устраняя проблемы с величиной пространственного заряда и поддерживая высокую чувствительность.
Однако несмотря на успех в исследовательском сообществе, LTQ Orbitrap имел несколько существенных ограничений. Прежде всего, используемый в приборе метод фрагментации на основе CID хотя и хорошо показал себя для идентификации пептидов, однако был неприменим для фрагментов белковых молекул с посттрансляционными модификациями (ПТМ), такими как, например, фосфорилирование и гликозилирование. Кроме того, на практике точное измерение массы в тандемных МС-экспериментах оказывалось недостаточно быстрым для применения вместе с ЖХ сверхвысокого давления.
Чтобы решить эти проблемы, в следующей модели масс-спектрометра – LTQ Orbitrap XL – была улучшена конструкция С-образной ловушки и реализованы дополнительные методы фрагментации, такие как диссоциация, индуцируемая столкновениями при повышенной энергии (HCD), и позднее – диссоциация при переносе электрона (ETD). Включение камеры высокоэнергетичных столкновений (HCD-камера) в конструкцию Orbitrap было произведено по примеру ее применения в тройных квадрупольных и квадруполь-времяпролетных масс-спектрометрах. В приборе она располагалась непосредственно после С-образной ловушки [9] (рис.3). Это было сделано в первую очередь для того, чтобы за счет удаленного расположения уменьшить перетекание газа из HCD-камеры в масс-анализатор с линейной ионной ловушкой. Кроме того, такая геометрия делала прибор более компактным и обеспечивала бóльшую гибкость в эксплуатации. Для решения задач протеомики объединение Orbitrap с камерой активных столкновений было в частности полезно тем, что в ней генерируются ионы иммония, естественного маркера при секвенировании пептидов de novo. И это не только облегчает процесс установления их структуры, но и содействует активному расширению библиотек фрагментации.
В LTQ Orbitrap XL вместе с орбитальной ионной ловушкой также впервые был использован еще один метод фрагментации, ETD. Он был разработан в 2004 году для улучшения определения аминокислотных последовательностей в белках и пептидах, а также установления локализации, структуры и содержания неустойчивых ПТМ. Первоначально в качестве ETD-реагента использовались анионы флуорантена, которые генерировались в источнике, расположенном за камерой активных столкновений. Через нее и С-образную ловушку они попадали в масс-анализатор с линейной ионной ловушкой, где, собственно, и реагировали с пептидными катионами [11]. Поскольку при этом фрагментируются преимущественно пептидные цепи, посттрансляционные модификации сохраняются без изменений. Фрагментация по методу ETD носит неэргодичный характер (т. е. результат зависит от пути протекания процесса), чувствительна к зарядовой плотности и способствует выявлению предшественников с высоким зарядом и низким m / z. Объединение данных, получаемых таким образом, с данными CID, позволило разработать оптимизированный метод дерева решений, используемый в масс-спектрометрическом анализе [12]. Он нашел применение не только для идентификации и определения расположения ПТМ, но и для установления самих пептидных последовательностей.
По своим характеристикам LTQ Orbitrap XL в конце 2000-х годов позволял решать большое число исследовательских задач. Он обеспечивал разрешение 60 000 (на m / z 400 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и массовую точность 1–3 ppm в диапазоне m / z до 4 000 а.е.м. Однако требовалось дальнейшее повышение чувствительности и скорости сканирования для того, чтобы работать со сложными белковыми смесями, не прибегая к их глубокому предварительному фракционированию и обработке.
Для решения этих задач компания Thermo Fisher Scientific выпустила в 2009 году новый масс-спектрометр LTQ Orbitrap Velos (рис.4) [13]. Он обладал более высокой чувствительностью (в 3–5 раз в режиме полного сканирования и до 10 раз в режиме МС / МС). Это было достигнуто за счет изменения интерфейса ввода ионов путем использования новой ионной оптики (S-линза) и создания новой двухкамерной конструкции масс-анализатора с линейной ионной ловушкой.
Назначением S-линзы, кольцевых радиочастотных устройств, служила эффективная фокусировка ионов в узком ионном пучке для увеличения надежности и эффективности его транспортировки. В двухкамерной ионной ловушке первая камера высокого давления была оптимизирована для выделения и фрагментации ионов, вторая – низкого давления – для их ускоренного анализа. Все вместе это позволяло увеличить поток ионов в систему, а затем быстро и эффективно ими манипулировать. Кроме того, теперь время впрысков ионов для тандемной МС определялось не по различным предварительным сканированиям, выполняемым для каждого предшественника (АРУ), а по ионным интенсивностям, измеренным в результате предыдущих полных спектров (предиктивная АРУ). Тем самым также сокращалась длительность аналитического процесса, что дало возможность увеличить частоту сканирований до 10 Гц и сделать в протеомике обыденным анализ нефракционированных образцов [4].
Еще одно изменение в конструкции LTQ Orbitrap Velos коснулось расположения камеры высокоэнергетичных столкновений. Ее приблизили к C-образной ловушке, отделив их друг от друга лишь одной диафрагмой. Это позволило использовать вытягивающее поле для инжекции ионов в орбитальную ионную ловушку также и для более полного извлечения из HCD-камеры фрагментов пептидов с низкими значениями m / z. Тем самым достигалась бóльшая точность результатов количественного анализа (в особенности изобарно меченых мультиплексированных белковых образцов). Кроме того, это позволяло при существующей разрешающей способности МС увеличить скорость анализа в тандемной масс-спектрометрии.
ORBITRAP – ТЕХНОЛОГИИ
ДЛЯ РУТИННЫХ АНАЛИЗОВ
Хотя преимущества гибридной платформы Orbitrap для решения количественных и качественных задач в области протеомики получили широкое признание, эти системы были слишком сложными и дорогими, чтобы превратиться в рутинный аналитический инструмент обычных лабораторий – токсикологических, пищевых, экологических и других. Однако потребность в таком приборе существовала. Решая эту задачу, в Thermo Fisher Scientific была разработана платформа Exactive [14] (рис.5). В ней технологии, обеспечивающие высокое разрешение и точное определение массы, органично сочетаются с настольными габаритами прибора и его относительно невысокими стоимостью и сложностью.
Прежде всего, в масс-спектрометре отсутствует масс-анализатор линейная ионная ловушка. В приборе используется только Orbitrap для регистрации полного спектра и HCD-камера для фрагментации ионов без выделения предшественника. Такая конструкция потребовала развития новых методов АРУ, рассчитанных на использование одной только орбитальной ионной ловушки. Решение было найдено путем дополнительного включения в прибор детектора заряда.
Несмотря на внешнюю простоту конструкции, Exactive обеспечивает высокое значение ВР / ТМ. Он поддерживает разрешение 100 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и точность измерения массы 2–5 ppm при впечатляющем динамическом диапазоне (более 4 000) и скорости переключения полярности менее секунды. Благодаря этому прибор нашел активное применение для количественного и качественного скрининга как известных, так и неизвестных соединений. Он с успехом использовался в лабораториях, занимающихся анализом в области пищевой безопасности и охраны окружающей среды [15, 16], биоанализом [17, 18], клиническим анализом [19, 20], определением наркотических веществ и допинга [21–23], исследованиями в области протеомики и метаболомики [24, 25].
В дальнейшем платформа Exactive развивалась в направлении создания ГХ-МС спектрометра Exactive GC, в целом аналогичного по характеристикам своему ЖХ-МС аналогу, а также более продвинутой модели Exactive Plus (Exactive Plus EMR) (рис.6). Последний прибор был оснащен усиленной ионной оптикой (S-линзами), поддерживал несколько источников ионизации (электрораспыление, нагреваемое электрораспыление и химическую ионизацию при атмосферном давлении), обеспечивал разрешение до 140 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и точность измерения массы менее 1 ppm. Кроме того, увеличенное быстродействие Exactive Plus (до 12 сканирований в секунду) позволяло использовать спектрометр вместе с ультра-ВЭЖХ. В сочетании с возможностью увеличить доступный диапазон масс со стандартного 50–6 000 а.е.м. до расширенного (EMR, extended mass range) 350–20 000 а.е.м. это превращало прибор в практически универсальный инструмент, пригодный для большинства рутинных исследований в области биологии и биофармацевтики, то есть там, где требовался анализ моноклональных антител, их конъюгатов с лекарственными препаратами, белками и белковыми комплексами в их нативном состоянии [26].
Однако несмотря на все замечательные характеристики рассмотренных масс-спектрометров семейства Exactivе, ограничением их возможностей в анализе тандемных МС-спектров служит неспособность к выделению ионов-предшественников. Она была реализована лишь в 2011 году с появлением Q Exactive, нового прибора компании Thermo Fisher, оснащенного, наряду с масс-анализатором Orbitrap и HCD-камерой, также квадрупольным масс-фильтром [27] (рис.7). К этому моменту распространение ультра-ВЭЖХ также потребовало более высоких значений скорости накопления данных, в особенности в связи с необходимостью увеличения числа анализируемых точек при количественном анализе пиков ЖХ. Для того чтобы получать тандемные МС-спектры с высокими значениями ВР, но за более короткие временные интервалы, в Q Exactive применили новую технологию обработки сигнала, регистрируемого в масс-анализаторе Orbitrap, которая получила название усовершенствованного фурье-преобразования (eFT) [28]. Объединение возможностей S-линз, HCD-фрагментации, быстрой и эффективной квадрупольной фильтрации ионов и их регистрации в орбитальной ионной ловушке с технологией eFT обеспечили высокое качество и скорость записи данных. В системе было достигнуто полное распараллеливание МС / МС-процессов: в то время когда в Orbitrap предыдущий цикл регистрации спектра еще продолжался, C-образная ловушка и HCD-камера уже начинали заполняться заново. Благодаря этим своим конструктивным особенностям Q Exactive позволяет записывать с высоким разрешением до 12 тандемных МС-спектров в секунду и является отличным решением для использования в системах с ультра-ВЭЖХ [27].
Последующее развитие платформы Q Exactive, поддерживающей диапазон масс 50–6 000 а.е.м и разрешение до 140 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц), привело к созданию двух специализированных решений Q Exactive Focus (рис.8) и Q Exactive Plus. Первый из этих масс-спектрометров сориентирован на анализ молекул с небольшими молекулярными весами (диапазон масс до 2 000 a.e.m.) и имеет характеристики, в целом аналогичные Q Exactive по производительности, точности измерения массы, динамическому диапазону. Однако будучи предназначенным преимущественно для рутинных анализов, Q Exactive Focus уступает своему предшественнику в разрешении (70 000 на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и не поддерживает мультиплексность.
Совсем иные, превосходные, возможности предоставляет Q Exactive Plus (рис.9). Это – мощный аналитический инструмент, поддерживающий рекордное на момент своего появления разрешение – 280 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц). В данном масс-спектрометре дальнейшее развитие получила система ввода и формирования ионного пучка – Advanced Active Beam Guide (AABG). В ней вслед за ВЧ-линзами располагается система, предназначенная для снижения уровня шума и освобождения от нейтральных частиц и состоящая из предфильтра (инжекционного флатаполя) и искривленного флатаполя. Усовершенствованию подверглась и конструкция квадрупольного масс-фильтра, который приобрел сегментированность для улучшения передачи ионов и создания изолирующих окон (Advanced quadrupole technology, AQT). Как и его предшественник, Q Exactive Plus поддерживает анализ молекул в диапазоне масс 50–6 000 а.е.м., частоту МС / МС-сканирований до 12 Гц и позволяет выделять до 10 ионов-предшественников в одном спектре. Этот прибор компания Thermo Fisher Scientific в настоящее время предлагает как один из вариантов платформы Q Exactive BioPharma – специализированного решения, которое оптимально удовлетворяет требованиям, необходимым в исследованиях природных и денатурированных белков и пептидов.
НА ПУТИ
К МАКСИМАЛЬНЫМ ВОЗМОЖНОСТЯМ
Стремясь достичь наилучших значений рабочих параметров своих приборов с масс-анализатором Orbitrap, компания Thermo Fisher Scientific усовершенствовала практически все основные элементы их конструкции в семействах LTQ Orbitrap, Q Exactive / Exactive. В том числе и самый главный – орбитальную ионную ловушку. Уже в 2011 году ее новая, высокополевая версия использовалась в модели Orbitrap Elite [29] (рис.10), а затем в Q Exactive HF (рис.11) и инновационной серии трибридных приборов Orbitrap Fusion.
Улучшенный анализатор Orbitrap по сравнению со своим предшественником обнаруживал в целом почти вчетверо более высокую эффективность. Он использовал удвоенную рабочую частоту и благодаря eFT-технологии позволял дополнительно достичь двукратного увеличения разрешающей способности (240 000 на m / z 400 а.е.м. для 768 мс процесса). Естественно, что реализовать эти возможности было невозможно без достаточной точности обработки электродов в конструкции самого масс-анализатора и одновременной модификации предусилителя и смежной ионной оптики, обеспечивающей надежность ионопередачи [30]. Эти и другие изменения нашли свое отражение в устройстве Orbitrap Elite и последующих приборов.
В целом и Orbitrap Elite, и Q Exactive HF, будучи старшими и последними моделями в своих семействах спектрометров, сохранили все достигнутые преимущества предшественников, превзойдя их в скорости накопления данных, убыстрении тандемных МС-сканирований (частота до 15 и 18 Гц соответственно), увеличении числа идентифицируемых ионов и, как следствие, возрастании возможностей проникновения в тонкости строения веществ [4]. В силу этого, названные приборы нашли активное применение как инструменты, используемые вместе с ультра-ВЭЖХ для распознавания и установления структуры молекул биологически активных соединений, включая достаточно крупные пептидные фрагменты (до 4 000 и 6 000 а.е.м соответственно),
в экологическом и пищевом анализе, клиническом и биоанализе, метаболомике и протеомике, липидомике и допинг-контроле [4]. Совершенно не случайно компания Thermo Fisher Scientific сегодня предлагает Q Exactive HF как старшую модель платформы Q Exactive BioPharma, поддерживающую режим HMR (High Mass Range)
с расширенным до 8 000 а.е.м диапазоном анализируемых масс.
Однако с появлением моделей Orbitrap Elite и Q Exactive HF дальнейшее совершенствование семейств, к которым принадлежат эти масс-спектрометры, оказалось проблематичным, поскольку достигли предела технологические возможности, заложенные в каждую из их базовых конструкций. И в силу этого разработчики Thermo Fisher Scientific поступили вполне ожидаемо: они создали совершенно новый прибор, Orbitrap Fusion, в котором впервые объединили преимущества гибридных систем Orbitrap – линейная ионная ловушка и Orbitrap – квадрупольный масс-фильтр [31] (рис.12).
Такая архитектура спектрометра привела к существенному увеличению его производительности и разрешающей способности, достигшей 500 000 (на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц). Использование одновременно трех масс-анализаторов позволяет полностью распараллелить процессы и обеспечить максимальный ионный ток. Благодаря этому становятся доступными сложные режимы анализа, в которых один из анализаторов (линейная ионная ловушка или квадруполь) применяется для изолирования ионов, а два других (Orbitrap и линейная ионная ловушка) – для их детектирования. Подобный подход делает доступным использование всех из ранее упоминавшихся типов фрагментации (HCD, CID, ETD), также совершенно нового, EThcD, представляющего собой комбинацию ETD и HCD и получившего название диссоциации, вызванной переносом электронов и высокоэнергетичными столкновениями (electron-transfer / higher-energy collision dissociation) [32]. При этом фрагменты и ионы-предшественники могут анализироваться на любом уровне МСn, что открывает путь к новым типам масс-спектрометрических экспериментов, позволяющим решать сложные вопросы установления структуры веществ [33].
Среди новых возможностей – отказ от классического подхода TopN, в котором в качестве критерия выбора иона-предшественника для дальнейших исследований используется интенсивность его сигнала. В Orbitrap Fusion это можно делать, опираясь на другие критерии, например на величину m / z, которую определяет сам пользователь прибора. Кроме того, присутствующий режим Top Speed предполагает возможность произвольно устанавливать число уровней в тандемных МС-экспериментах вплоть до максимального, который в данной модели спектрометра равен 20, то есть значительно выше, чем в Orbitrap Elite и Q Exactive HF. Использование режима Top Speed крайне полезно в тех случаях, когда спектрометр используется совместно с хроматографом и требуется получить максимальное число точек, приходящихся на пик хроматограммы.
Значительные преимущества в масс-спектро-метрии малых молекул, имеющих важное значение в исследованиях в области гликомики, метаболомики и липидомики, создает возможность комбинированного применения методов фрагментации. Использование HCD-фрагментации, рождающей осколочные фрагменты меньшего веса, и последующий их анализ в линейной ионной ловушке (для достижения максимальной чувствительности и степени параллелизации) или в Orbitrap (для наибольшего разрешения) позволяет получать всю необходимую информацию при наименьшем числе стадий МСn.
Более эффективным стал используемый в Orbitrap Fusion ETD-источник ионов реагентов, названный EASY-ETD. Он основан на применении таунсендовского разряда вместо прежнего источника с электронным ударом [34]. Благодаря заложенной в прибор возможности выборочно определять ионы-мишени, этот источник позволяет ускорить идентификацию ионов с более высоким зарядом и низким значением m / z, которые наиболее чувствительны к ETD-фрагментации.
Чтобы решить задачи по быстрому и точному ТМТ-анализу*, в Orbitrap Fusion впервые разработали и применили новый метод выделения фрагментов, основанный на одновременном отборе нескольких предшественников (SPS, synchronous precursor selection) на стадии МС3. Для этого в масс-анализаторе линейная ионная ловушка используется так называемая многополосная фильтрация (multi-notch isolation), позволяющая в этом режиме на стадии МС2 выделять до 20 ионов-предшественников [35] (для сравнения максимальное число выделяемых предшественников в обычном режиме и в спектрометрах предыдущих моделей – 10). Благодаря SPS также значительно возрастает точность и селективность ТМТ-МС3-анализа [36]. Кроме того, за счет параллельности процессов выделения и идентификации ионов скорость ТМТ-МС3-экспериментов становится сопоставимой с той, что была прежде в тандемной МС. При этом существенно увеличивается количественная точность измерений.
ORBITRAP –
САМЫЕ ПЕРЕДОВЫЕ РЕШЕНИЯ
Десятилетие своих разработок по созданию и совершенствованию конструкции спектрометров на основе Orbitrap компания Thermo Fisher Scientific завершила сразу двумя новыми моделями:
ГХ-МС/МС-спектрометром Q Exactive GC и масс-
спектрометром Orbitrap Fusion Lumos, соединившем в себе последние достижения трибридной технологии. Оба прибора впервые были представлены в конце 2015 года, а позже экспонировались на мюнхенской выставке analytica 2016.
Хромато-масс-спектрометр Q Exactive GC (рис.13) на данный момент представляет собой один из наиболее продвинутых вариантов объединения газового хроматографа и масс-спектрометра. Он отличается высокой разрешающей способностью 100 000 (на m / z 272 а.е.м.) и точностью измерения масс 1–3 миллионных долей. в массовом диапазоне 50–3 000 а.е.м. Это одна из двух моделей ГХ-МС-спектрометра, которая разработана в Thermo Fisher Scientific на основе масс-анализатора Orbitrap. В другой, Exactive GC, отсутствует квадруполь, и, соответственно, невозможен тандемный МС-анализ. Спектрометр Q Exactive GC поддерживает до 18 сканирований в секунду в режиме тандемной МС и позволяет обнаруживать до 10 предшественников за сканирование. Дополнительное удобство для пользователя создает реализованная в приборе возможность смены хроматографической колонки и источника ионизации без отключения вакуума прибора. С его более подробным описанием можно ознакомиться в материале, ранее опубликованном в журнале "Аналитика". [37].
Как и все другие масс-спектрометры на основе Orbitrap, Q Exactive GC предназначен для решения самого широкого круга задач в исследовательских и промышленных лабораториях: от чисто химического и химико-технологического анализа до скрининга безопасности пищевых продуктов, судебно-медицинской токсикологической экспертизы и борьбы с допингом. К примеру, самый первый из произведенных приборов был установлен в октябре 2015 года в Вестфальском университете им. Вильгельма г. Мюнстер (Германия) в Мюнстерском центре технологий электрохимической энергии и исследований аккумуляторов (Muenster Electrochemical Energy Technology (MEET) Battery Research Center, University of Muenster, Germany) [38]. Основным доводом в пользу выбора этого прибора университетскими учеными было названо уникальное значение ВР / ТМ, позволяющее с высокой точностью оценивать структуру и содержание микроследовых количеств токсичных фторированных и нефторированных фосфатов, которые образуются в разрабатываемых электролитах для автомобильных литий-ионных аккумуляторов.
Характеристики Q Exactive GC получили высокую оценку в марте 2016 года на престижной конференции Pittcon 2016, где хромато-масс-спектрометр получил награду "Выбор ученых" (SelectScience Award) [39] (рис.14). Как сказано в тексте пресс-релиза: "Система Q Exactive GC впервые объединила возможности газовой хроматографии с высокой разрешающей способностью и точностью измерения массы (ВР / ТМ) масс-спектрометрии Orbitrap, чтобы в одном анализе получать полную характеристику [исследуемых веществ]. Предназначение системы состоит в увеличении производительности ГХ-МС в сочетании с возможностями обнаружения, идентификации и количественной оценки, чтобы предоставить пользователям более глубокое, чем когда-либо прежде, представление об их образцах".
Вторая новинка – масс-спектрометр Orbitrap Fusion Lumos (рис.15). По реализованным возможностям это наиболее совершенный из приборов на основе технологии Orbitrap, которые были созданы Thermo Fisher Scientific в течение последнего десятилетия. Как легко увидеть из названия и схемы (рис.16), он представляет собой следующую ступень в развитии семейства Orbitrap Fusion.
По сравнению с предшественником, Orbitrap Fusion Lumos почти не отличается по базовым физическим характеристикам. У него аналогичное разрешение (500 000 на m / z 200 а.е.м. и скорости сканирования 1 Гц) и точность измерения массы. Совпадают максимальная скорость сканирования в режиме МС / МС и мультиплексность. Основные усовершенствования коснулись, в первую очередь, системы ввода и формирования ионного пучка. Вместо радиочастотных линз (S-линз) в спектрометре используются тонко настраиваемые высокопроизводительная передаточная трубка и электродинамическая ионная воронка. Они предназначены для увеличения потока ионов и расширения пределов их обнаружения. Для снижения уровня шума и освобождения от нейтральных частиц в приборе установлена улучшенная система управления ионным пучком, AABG.
Усовершенствованная конструкция квадрупольного масс-фильтра, AQT, призвана обеспечить максимальные селективность и эффективность в создании изолирующих окон и передачи ионов в масс-анализатор Orbitrap. А эффективный транспорт ионов с высокой молекулярной массой стабильно поддерживает продвинутая технология создания сверхвысокого вакуума (ниже 2 · 10–10 мм. рт. ст.). Дальнейшее развитие получили также ETD / EThcD-технологии, превратившиеся в Orbitrap Fusion Lumos в ETD HD-диссоциацию с переносом электрона высокого динамического диапазона (high dynamic range ETD), позволяющую расширить динамический диапазон и пределы детектирования в данном типе фрагментации.
В целом все перечисленные изменения направлены, прежде всего, на расширение аналитических возможностей Orbitrap Fusion Lumos и предопределяют его преимущественное использование в научных исследованиях сложных биологических объектов. Прежде всего, это касается улучшенных возможностей в пептидном анализе, изучении структуры интактных белков и моноклональных антител. Как продемонстрировано Thermo Fisher Scientific, применение нового прибора также высокоперспективно для выполнения работ в области гликопротеомики, липидомики, метаболомики [40].
За десятилетие развития масс-спектрометрии на основе технологии Orbitrap компания Thermo Fisher Scientific разработала и выпустила на рынок более полутора десятков различных приборов. Бóльшая часть из них до сих пор доступна потребителям для заказа. Спектрометры отличаются друг от друга по своим характеристикам и специализации. Одни предназначены для рутинного контроля, другие – для поддержки серьезных и сложных научных изысканий в самых передовых областях естествознания. Для того чтобы облегчить выбор инструмента, наиболее соответствующего решаемым задачам, на сайте разработчика даже приводится таблица, которая позволяет наглядно оценить характеристики наиболее востребованных масс-спектрометров Orbitrap [41] (см. таблицу). Но, помимо названной практической пользы, в ней отчетливо прослеживается и тенденция: от модели к модели неуклонно возрастают разрешающая способность, быстродействие, мультиплексность и, как следствие, аналитические возможности. Причем это происходит при сохранении и даже уменьшении габаритов. В предельном варианте такое движение можно представить как попытку создания идеального лабораторного инструмента, позволяющего исследователю получать исчерпывающую качественную и количественную информацию о химическом объекте, с которым тот работает. И большой отрезок пути в этом направлении уже успешно пройден.
ЛИТЕРАТУРА:
Kingdon K.H. A method for the neutralization of electron space charge by positive ionization at very low gas pressures // Phys. Rev. 1923. V. 21. P. 408–418.
Perry R.H., Cooks R.G., Noll R.J. Orbitrap mass spectrometry: instrumentation, ion motion and applications // Mass Spec. Rev. 2008. V. 27. P. 661– 699.
Makarov A. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: a high-performance technique of mass analysis // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 1156–1162.
Eliuk S., Makarov A. Evolution of Orbitrap Mass Spectrometry Instrumentation // Annual Rev. Anal. Chem. 2015. V. 8. P. 61–80. http://www.annualreviews.org.
Makarov A.A. Mass spectrometer. US Patent 5886346, 1999.
Макаров А. Масс-спектрометрия на основе орбитальной ловушки ионов: достижения и перспективы // Аналитика. 2013. № 5. С. 30–36.
Hu Q., Noll R.J., Li H., Makarov A., Hardman M., Cooks R.G. The Orbitrap: a new mass spectrometer // J. Mass Spectrom. 2005. V. 40. P. 430–443.
Makarov A., Denisov E., Kholomeev A., Balschun W., Lange O., Strupat K., Horning S. Performance evaluation of a hybrid linear ion trap/Orbitrap mass spectrometer // Anal. Chem. 2006. V. 78. P. 2113–2120.
Olsen J.V., Macek B., Lange O., Makarov A., Horning S., Mann M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis // Nat. Methods. 2007. V. 4. P. 709–12.
Syka J.E., Coon J.J., Schroeder M.J., Shabanowitz J., Hunt D.F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 9528–9533.
McAlister G.C., Phanstiel D., Good D.M., Berggren W.T., Coon J.J. Implementation of electron-transfer dissociation on a hybrid linear ion trap–Orbitrap mass spectrometer // Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 3525–3534.
Swaney D.L., McAlister G.C., Coon J.J. Decision tree-driven tandem mass spectrometry for shotgun proteomics // Nat. Methods. 2008. V. 5. P. 959–964.
Olsen J.V., Schwartz J.C., Griep-Raming J., Nielsen M.L., Damoc E., Denisov E., Lange O., Remes P., Taylor D., Splendore M., Wouters E.R., Senko M. A dual pressure linear ion trap Orbitrap instrument with very high sequencing speed // Mol. Cell Proteomics. 2009. V. 8. P. 2759–2769.
Bateman K.P., Kellmann M., Muenster H., Papp R., Taylor L. Quantitative-qualitative data acquisition using a benchtop Orbitrap mass spectrometer // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2009. V. 20. P. 1441–1450.
Blay P., Hui J.P.M., Chang J., Melanson J.E. Screening for multiple classes of marine biotoxins by liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry // Anal. Bioanal. Chem. 2011. V. 400. P. 577–585.
Edison S.E., Lin L.A., Parrales L. Practical considerations for the rapid screening for pesticides using ambient pressure desorption ionization with high-resolution mass spectrometry // Food Addit. Contam., Part A. 2011. V. 28. P. 1393–1404.
Scigelova M., Makarov A. Advances in bioanalytical LC-MS using the Orbitrap mass analyzer // Bioanalysis. 2009. V. 1. P. 741–754.
Korfmacher W. High-resolution mass spectrometry will dramatically change our drug-discovery bioanalysis procedures // Bioanalysis. 2011. V. 3. P. 1169–1171.
Jiwan J.-L.H., Wallemacq P., Herent M.-F. HPLC-high resolution mass spectrometry in clinical laboratory? // Clin. Biochem. 2010. V. 44. P. 136–147.
Henry H., Sobhi H.R., Scheibner O., Dromiski M., Nimkar S.B., Rochat B. Comparison between a high resolution single stage Orbitrap and a triple quadrupole mass spectrometer for quantitative analyses of drugs // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2012. V. 26. № 5. P. 499–509.
Beuck S., Bornatsch W., Lagojda A., Schanzer W., Thevis M. Development of liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analytical assays for the determination of HIF stabilizers in preventive doping research // Drug Test. Analysis. 2011. V. 3. P. 756–770.
Guddat S., Solymos E., Orlovius A., Thomas A., Sigmund G., Geyer M., Thevis M., Schanzer W. High-throughput screening for various classes of doping agents using a new ‘dilute-and-shoot’ liquid chromatography / tandem mass spectrometry multi-targeted approach // Drug Test. Analysis. 2011. V. 3. Р. 836–850.
Moulard Y., Bailly-Chouriberry L., Boyer S., Garcia P., Popot M.-A., Bonnaire Y. Use of benchtop Exactive high resolution and high mass accuracy orbitrap mass spectrometer for screening in horse doping control // Anal. Chim. Acta. 2011. V. 700. P. 126–136.
Lu W., Clasquin M.F., Melamud E., Amador-Noguez D., Caudy A.A., Rabinowitz J.D. Metabolomics analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a standalone Orbitrap mass spectrometer // Anal. Chem. 2010. V. 82. P. 3212–3221.
Geiger T., Cox J., Mann M. Proteomics on an Orbitrap benchtop mass spectrometer using all-ion fragmentation // Mol. Cell. Proteomics. 2010. V. 9. P. 2252–2261.
Xuan Y., Debaene F., Stojko J., Beck A., Dorsselaer A.V., Cianférani S., Bromiski M. Monoclonal antibody and related product characterization under native conditions using a benchtop mass spectrometer // https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/AN-597-monoclonal-antibody-63950-AN63950-en.pdf.
Michalski A., Damoc E., Hauschild J.P., Lange O., Wieghaus A., Makarov A., Nagaraj N., Cox J., Mann M., Horning S. Mass spectrometry-based proteomics using Q Exactive, a high-performance benchtop quadrupole Orbitrap mass spectrometer //
Mol. Cell Proteomics. 2011. 10:M111.011015.
Lange O., Damoc E., Wieghaus A., Makarov A. Enhanced Fourier transform for Orbitrap mass spectrometry // Int. J. Mass Spectrom. 2014. V. 369. P. 16–22.
Michalski A., Damoc E., Lange O., Denisov E., Nolting D., Müller M., Viner R., Schwartz J., Remes P., Belford M., Dunyach J.J., Cox J., Horning S., Mann M., Makarov A. Ultra high resolution linear ion trap Orbitrap mass spectrometer (Orbitrap Elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes // Mol.Cell Proteomics. 2012. 11(3):O111.013698.
Makarov A., Denisov E., Lange O. Performance evaluation of a high-field Orbitrap mass analyzer //
J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2009. V. 20. P. 1391–1396.
Senko M.W., Remes P.M., Canterbury J.D., Mathur R., Song Q., Eliuk S.M., Mullen C., Earley L., Hardman M., Blethrow J.D., Bui H., Specht A., Lange O., Denisov E., Makarov A., Horning S., Zabrouskov V. Novel parallelized quadrupole/linear ion trap/Orbitrap tribrid mass spectrometer improving proteome coverage and peptide identification rates // Anal. Chem. 2013. V. 85. P. 11710–11714.
Frese C.K., Zhou H., Taus T., Altelaar A.F., Mechtler K., Heck A.J.R., Shabaz M. Unambiguous phosphosite localization using electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD) // J. Proteome Res. 2013. V. 12. P. 1520–1525.
Wu S.W., Pu T.H., Viner R., Khoo K.H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides // Anal. Chem. 2014. V. 86. P. 5478–5486.
Earley L., Anderson L.C., Bai D.L., Mullen C., Syka J.E., English A.M., Dunyach J.J., Staf-ford G.C.Jr., Shabanowitz J., Hunt D.F., Compton P.D. Front-end electron transfer dissociation: a new ionization source // Anal. Chem. 2013. V. 85. P. 8385–8390.
McAlister G.C., Nusinow D.P., Jedrychowski M.P., Wuhr M., Huttlin E.L., Erickson B.K., Rad R., Haas W., Gygi S.P. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes // Anal. Chem. 2014. V. 86. P. 7150–7158.
Ting L., Rad R., Gygi S.P., Haas W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics // Nat. Meth. 2011. V. 8. P. 937–940.
Гордеев К., Шахнович И. Аналитическая спектрометрия сегодня: от новых технологий к новым открытиям // Аналитика. 2016. № 1. С. 36–61.
Пресс-релиз. University of Muenster Using Orbitrap-based GC-MS to Advance Lithium-Ion Battery Research, http://news.thermofisher.com/press-release/thermo-scientific/university-muenster-using-obitrap-based-gc-ms-advance-lithium-ion-ba.
Пресс-релиз. Thermo Fisher Scientific Wins SelectScience Awards at Pittcon 2016, http://news.thermofisher.com/press-release/aacc-2015/thermo-fisher-scientific-wins-selectscience-awards-pittcon-2016.
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/BR-64392-LC-MS-Orbitrap-Fusion-Lumos-Tribrid-BR64392-EN.pdf
http://www.thermofisher.com/ru/ru/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-systems/orbitrap-lc-ms/orbitrap-lc-ms-comparison-chart.html
* ТМТ-анализ – один из методов в тандемной масс-спектрометрии, применяемых для установления структуры биомакромолекул – белков, пептидов, нуклеиновых кислот. Основан на использовании специальных изобарических химических меток (ТМТ – tandem mass tag).
* Название поэмы конструктора спектрометров ЯМР А.Н. Любимова из самиздата 1980 года.
Отзывы читателей
