eng
Выпуск #6/2016
А.Яшин, Б.Немзер, А.Веденин, Я.Яшин
Определение тиолов в биологических жидкостях человека методом ВЭЖХ
Определение тиолов в биологических жидкостях человека методом ВЭЖХ
Просмотры: 4532
Тиолы – цистеин CySH и восстановленный глутатион GSH играют важную роль в защите молекул белков, липидов, ДНК, мембран, клеток от вредного воздействия реакционных кислородных и азотных соединений, в т.ч. и свободных радикалов. В работе проанализированы основные методы анализа тиолов и их окисленных форм. Приведен обзор определения тиолов в биологических жидкостях человека методом ВЭЖХ с разными детекторами. Обсуждается зависимость содержания тиолов от питания, возраста, болезней, физических нагрузок и т.д.
ВВЕДЕНИЕ
Тиолы играют важную роль в биологических процессах. Биологические тиолы – продукты метаболизма серы. Их активно изучают, поскольку точное и надежное определение тиолов и их метаболитов в биологических жидкостях и тканях имеет большое значение.
Как химические соединения тиолы (RSH) относятся к тиоспиртам (их называют также меркаптанами) и содержат сульфогидрильную группу (SH). Если эти группы пространственно доступны (не связаны в белках), то тиолы активно вступают во многие химические реакции, имеющие биологическое значение. При таких взаимодействиях могут возникать связи -S-C-, -S-металл, -S-S-, -S-O-. Биологическая активность тиолов в основном зависит от легкой окисляемости связи тиольной группы -S-H до дисульфидной группы (-S-S-) из-за многих валентных состояний атома серы. Дисульфидные группы устойчивы к дальнейшему окислению.
Соединения с тиольными группами – антиоксиданты, в частности цистеин, цистеинилглицин, глутатион (g-L-глутамил-L-цистеинилглицин, GSH), гомоцистеин и др. Эти антиоксиданты защищают биологические системы от окисления. Среди них наиболее важен глутатион (GSH), присутствующий в клетках в миллимольных концентрациях и в меньшем количестве – в межклеточных жидкостях, таких как плазма. Глутатион восстановленный наиболее сильно влияет на окислительно-восстановительное равновесие в клетках и биологических жидкостях, нейтрализует свободные радикалы и, кроме того, регенерирует другие антиоксиданты, такие как витамины С и Е.
Многочисленные исследования показывают, что по концентрации тиолов в биологических жидкостях можно судить о заболеваниях человека и метаболических нарушениях, связанных с окислительным стрессом. Например, по общему содержанию гомоцистеина и цистеина проводят клинический анализ генетических и метаболических заболеваний.
Кроме низкомолекулярных тиолов есть и высокомолекулярные, в частности тиоредоксин и альбумин. Тиоредоксин – это белок, который действует как антиоксидант, облегчая восстановление в других белках цистеинового равновесия тиол-дисульфид. Тиоредоксин есть в организмах всех млекопитающих и весьма важен для поддержания жизни. В составе тиоредоксина присутствуют две тиольные группы, расположенные рядом. Эти две молекулы цистеина – ключевые в способности тиоредоксина восстанавливать другие белки. Альбумин – основной компонент общих тиольных групп в плазме, это белок с молекулярной массой 65 000 а.е.м., растворимый в воде, солевых растворах, кислотах и щелочах.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОЛОВ
В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
Надежное определение тиолов в биологических жидкостях – сложная задача. Для этого используют разные аналитические методы с предварительным разделением и без разделения: ВЭЖХ, газовую хроматографию, капиллярный электрофорез, ГХ-МС, ГХ-МС/МС, ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС [1]. Без разделения применяют спектроскопические (УФ- и флуориметрия), электрохимические (амперометрия) и масс-спектрометрические (МС) методы. С предварительным разделением можно применять капиллярный электрофорез, газовую хроматографию (ГХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и сочетание ГХ-МС и ВЭЖХ-МС [1,2]. Сегодня чаще всего для анализа тиолов используют ВЭЖХ с разными детектирующими устройствами. Среди методов ВЭЖХ выделим обращенно-фазовую, ион-парную, ион-обменную, ультраВЭЖХ. Для исследования тиоредоксинов подходит аффинная хроматография [3]. В таблице 1 приведены методы детектирования и достигаемые с их помощью пределы обнаружения тиолов [1].
Электрохимическое детектирование (ЭД). Отметим, что самые низкие пределы обнаружения на уровне фемтомолей имеют электрохимические детекторы [10]. Они сегодня привлекают все больший интерес за счет высокой чувствительности и селективности определения тиольных соединений в сложных биологических матрицах без концентрирования и дериватизации. В [11] обобщены результаты исследований ВЭЖХ с амперометрическим детектором. В этом обзоре процитированы 34 статьи по определению GSH в плазме, моче, сыворотке, слезах, тканях мозга, эритроцитах и других объектах. В качестве рабочих электродов амперометрического детектора в этих работах были использованы следующие материалы: углерод, стеклоуглерод, медь, платина, золото. Потенциалы, приложенные к рабочему электроду, были в пределах 0,46–1,6 мВ. В последние годы опубликовано много интересных статей по применению электрохимических детекторов для определения тиолов [11–17]. Нами в работах [21,22] было показано, что методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором можно напрямую определять цистеин, восстановленный глутатион и мочевую кислоту в сыворотке человека.
УФ-детектирование. Тиолы и диосульфиды в своем составе не имеют хромофорных групп, и оптические детекторы без дериватизации их не определяют. Поэтому тиолы предварительно переводят в производные, имеющие полосы поглощения в УФ-области. В качестве дериватизирующих агентов используют 5,5-дитио-бис-нитробензойную кислоту, 2-хлор-1-метилхинониумтетрафторборат, 1-хлор-2,4-динитробензол и др. Регистрацию химически связанных тиолов производят на длинах волн 280, 330, 340, 350 нм в зависимости от дериватизирующего агента.
Флуориметрическое детектирование также проводят с тиолами в виде производных с монобромбимоном или о-фталевым альдегидом [6–8]. Cпектр возбуждения состоит из линий 380, 381, 386, 390 нм, спектр эмиссии – 376, 390, 478, 510, 512, 516 нм. Минимальное значение предела обнаружения: 0,4–3 пикоМ [6–8].
Масс-спектрометрическое детектирование не требует дериватизации, кроме того, его можно использовать как для качественного, так и для количественного анализов [2–9].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ТИОЛОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ЖИДКОСТЯХ ЧЕЛОВЕКА
В [20] представлены результаты исследования динамики концентрации CysН и GSH в течение суток в плазме здоровых людей (63 человека) после приема белков: 0,8 г белка на кг веса в день с S-содержащими аминокислотами, 20 мг на кг в день таких аминокислот. Концентрации CySН и GSH максимальны через 3 и 6 часов после еды соответственно. Соотношения GSH/GSSG и CySН/CySS также менялись в основном в соответствии с изменением концентраций тиольных групп. У пожилых людей (свыше 60 лет) соотношение CySН/CySS увеличивалось в 1,8 раза быстрее, чем у молодых (менее 40 лет). Эти данные надо учитывать при анализе тиолов.
В работах [2,9] исследовано содержание глутатиона хроматографическими и масс-спектрометрическими методами в биологических пробах. GSH – основное небелковое внутриклеточное тиольное соединение, которое играет главную роль в защите клеток и тканей от окислительного стресса. GSH присутствует во всех органах, в том числе и в печени. Концентрация GSH внутри клеток на уровне мМ, а в плазме – мкМ. В клетках GSH содержится как в свободном виде, так и связанном с белками. После окисления GSH до GSSG под действием фермента глутатионредуктазы происходит восстановление GSSG до GSH. У здоровых людей соотношение GSH/GSSG около 100:1, при разных заболеваниях оно может уменьшаться до 10:1 или даже к 1:1 [2]. Исследования показали, что концентрации GSH и GSSG зависят от состояния организма и при многих болезнях их соотношение изменяется в сторону роста окисленных форм. Например, при СПИДе – до 0,3; диабете – до 5; хронических болезнях – до 14,7; атеросклерозе – до 21,4; раке молочной железы – до 18,3 (начальная стадия) и 5,9 (после развития опухоли); раке прямой кишки – до 41 (начальная стадия) и 10,5 (после развития опухоли); при сильных физических нагрузках – до 0,4–16,0. В работе [6] проведено одновременное определение глутатиона, цистеина, гомоцистеина и цистенил глицина в биологических жидкостях (плазма, слюна, моча) методом ион-парной ВЭЖХ с предварительной дериватизацией этих компонентов. В таблице 2 приведены значения измеренных концентраций в биологических жидкостях.
В большом обзоре [21] представлены данные о биосинтезе глутатиона, его защитной роли и методах измерения. В клетках концентрация GSH установлена в пределах 1–2 мМ, а в гепатоцитах (hepatocytes) около 10 мМ. Высокая концентрация GSH наблюдается в клетках эпителия. В [21] обсуждаются изменения внутриклеточного GSH при патологии легких, печени и разных вирусных болезнях, а также возможная терапия глутатионом (GSH) онкологических заболеваний.
Определение эндогенных тиолов и тиольных лекарств в моче методом ВЭЖХ с УФ-детектированием описано в статье [5]. Содержание CySН в моче установлено около 30 мМ на моль креатинина (среднее из 10 измерений). Среди анализируемых тиолов: цистеин, цистеинилглицин, гомоцистеин, N-ацетилцистеин, тиогликолевая кислота. Тиольные лекарства, определяемые в моче, следующие: цистеамин, тиопронин, D-пенисиламин, каптоприл, метимазол, пропилтиоурацил, тиогуанин.
В [2] представлены результаты исследования зависимости между уровнем окисленных и восстановленных тиолов при раннем атеросклерозе у взрослых людей (114 человек) методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором. Определены средние значения: GSH – 1,6 мкМ, GSSG – 0,11 мкМ, CySН – 10 мкМ, CySS – 80 мкМ. Основной вывод работы – определение соотношений GSH/GSSG как меры окислительного стресса поможет выявить у пациентов риск развития раннего атеросклероза.
Влияние дефицита цистеина на концентрации GSH, GSSG в клетках Н29 карциномы прямой кишки изучено в работе [23]. В контрольных измерениях содержание в мкМ/л составило: GSH – 951, GSSG – 14, при дефиците цистеина: GSH – 11, GSSG – 1,3. Таким образом, показано, что содержание восстановленного глутатиона GSH в 90 раз, а содержание GSSG в 10 раз меньше при дефиците CySН.
Диагностическое значение тиосульфидного звена антиоксидантной системы изучено при бруцеллезе [24]. Обследовано 320 больных бруцеллезом в острой (160 человек) и хронической форме
(162 человека), у некоторых также выявлены сердечно-сосудистые заболевания. Показатели контрольной группы (мМ): CySH – 11,7; CySS – 4,5;
CySH/CySS – 2,6. У больных бруцеллезом они изменены: CySH – 7,2; CySS – 5,5; CySH/CySS – 1,3. Отношение CySH/CySS у больных уменьшилось в 2 раза, это свидетельствует о функциональной недостаточности антиоксидантной системы у больных.
Соотношение цистеин/цистин – новый знак в схеме биологической редокс-сигнализации и контроля [25]. В этой работе было установлено содержание цистеина и цистина в клетках: 126 и 31 мкМ соответственно. Окисление цистеина в плазме наблюдалось с помощью ВЭЖХ при эндотоксиновых нарушениях легких [26].
Количественное определение GSH и GSSG в биологических пробах оформлено как антиоксидантный протокол [27] с использованием ВЭЖХ с УФ-детектированием при 210 нм и с флуориметрическим детектором [28].
В таблице 3 приведены способы определения тиолов методом ВЭЖХ с разными детекторами при некоторых патологических состояниях человека.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итак, накоплена обширная информация по исследованию связи между состоянием организма и содержанием тиолов, особенно соотношения восстановленных и окисленных форм (CySH/CySS, GSH/GSSG). Разработаны методы их определения в биологических жидкостях и материалах на основе ВЭЖХ с разными детектирующими устройствами. Следующий шаг – тщательный анализ полученного массива данных, сравнение методов между собой и выбор самых надежных для клинических анализов. С нашей точки зрения, наиболее перспективны электрохимические и масс-спектрометрические детекторы, которые позволяют напрямую без дериватизации определять тиолы при очень малых количествах на уровне фемтомолей [10].
На практике этот метод очень перспективен для экспресс-контроля общего состояния организма как в обычных, так и в экстремальных условиях. Например, для спортсменов определение соотношения восстановленных и окисленных форм CySH/CySS и GSH/GSSG позволит оценить предельный уровень тренировочных нагрузок, после которых организм еще может быстро восстановиться, тем самым не допуская перетренировок.
ЛИТЕРАТУРА
Bayram B., Rimbach G., Frank J., Esatbeyoglui. Rapid method for glutathione quantitation using HPLC with coulometric electrochemical detection // J.Agric.Food.Chem. 2014. V.62. P.402–408.
Iwasaki Y., Saito Y., Nakano Y. et al. Chromatographic and mass spectrometric analysis of glutathione in biological samples // J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3309–3317.
Hisabori T., Hara S., Fujii T., Yamazaki D. et al. Thioredoxin affinity chromatography- a useful method for further understanding the thioredoxin network // Y.Exper. Botany. 2005. V.56. P.1463–1468.
Glowacki R., Bald E. Fully automated method for simultaneous determination of total cysteine, cysteinylglycine, glutathione and homocysteine in plasma by HPLC with UV absorbance detection // J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3400–3404.
Kušmierek K., Chwatko G., Glowacki R., Bald E. Determination of endogenous thiols and thiol drugs in urine by HPLC with ultraviolet detection // J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3300–3308.
Zhang W., Li P., Geng Q., Duan Y., Guo M., Cao Y.
Simultaneous determination of glutathione, cysteine, homocysteine and cysteinylglycine in biological fluids by ion-pairing HPLC coupled with precolumn derivatization // J.Agric.Food.Chem. 2014. V.62. P.5845–5852.
McMenamin M.E., Hummelfarb J., Nolin T.D. Simultaneous analysis of multiple aminothiols in human plasma by HPLC with fluorescence detection //
J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3274–3281.
Cereser C., Guichard J., Drai J., Bannier E., Garcia I., Boget S., Parvaz P., Revol A. Quantification of reduced and total glutathione at the femtomole level by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection: application to red blood cells and cultured fibroblasts // J.Chromatogr. B 2001. 752. P.123−132.
Norris R.L., Eaglesham G.K., Shaw G.R., Smith M.J., Chiswell R.K., Seawright A.A., Moore M.R. A sensitive and specific assay for glutathione with potential application to glutathione disulfide, using high-performance liquid chromatography−tandem mass spectrometry //
J.Chromatogr. B 2001. 762. P.17−23.
Hiraku Y., Murata M., Kawanishi S. Determination of intracellular glutathione and thiols by high performance liquid chromatography with a gold electrode at the femtomole level: comparison with a spectroscopic assay // Biochim.Biophys.Acta. 2002. 1570. P.47−52.
White P.C., Lawrence N.S., Davis J., Compton R.G. Electrochemical determination of thiols-a perspective // Electroanalysis. 2002. V.14. P.89–98.
Petrlova J., Mikelova R., Stejskal K., Kleckerova A., Zitka O., Petrek J., Havel L., Zehnalek J., Adam V., Trnkova L. Simultaneous determination of eight biologically active thiol compounds using gradient elution-liquid chromatography with Coul-Array detection // J.Sep.Sci. 2006. 29. P.1166−1173.
Yao X., Wang Y., Chen G. Simultaneous determination of aminothiols, ascorbic acid and uric acid in biological samples by capillary electrophoresis with electrochemical detection // Biomed.Chromatogr. 2007. 21. P.520−256.
Spadaro A.; Bousquet E., Santagati N.A., Vittorio F., Ronsisvalle G. Simple analysis of glutathione in human colon carcinoma cells and epidermoid human larynx carcinoma cells by HPLC with electrochemical detection // Chromatographia 2005. 62. 11−15.
Khan A., Khan M. I., Iqbal Z., Shah Y., Ahmad L., Nazir S., Watson D.G., Khan J.A., Nasir F., Khan A. A new HPLC method for the simultaneous determination of ascorbic acid and aminothiols in human plasma and erythrocytes using electrochemical detection // Talanta 2011. 84. P.789−801.
Steele M.L., Ooi L., Münch G. Development of a high performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of glutathione and related thiols // Anal.Biochem. 2012. 429. P.45−52.
Park H.J., Mah E., Bruno R.S. Validation of high-performance liquid chromatography-boron-doped diamond detection for assessing hepatic glutathione redox status // Anal.Biochem. 2010. 407. P.151−159.
Blanco R.A., Ziegler T.R., Carlson B.A. et al. Diurnal variation in glutathione and cysteine redox states in human plasma // Am.J.Clin.Nutr. 2007. V.86. P.1016−1023.
Forman H.J., Zhang H., Rinna A., Glutathione. Overview of its protective roles , measurement and biosynthesis // Mol.Aspects Med. 2009. V.30. P.1−12.
Ashfag S., Abramson J.L., Jones D.P., Rhodes S.D. et al. The relationship between plasma levels of oxidized and reduced thiols and early atherosclerosis in healthy adults // J.Am.Coll.Cardiol. 2006. V.47. P.1005−1007.
Яшин Я.И., Яшин А.Я. ВЭЖХ маркеров окислительного стресса // Аналитика. 2011. № 1. С.34−43.
Яшин Я.И., Яшин А.Я., Черноусова Н.И., Федина П.А. Диагностика окислительного стресса – предшественника опасных болезней и преждевременного старения и антиоксидантная терапия // Anti-age medicine: наука оставаться молодым / коллектив авторов; под ред. А.И.Труханова, М.: Асвомед. 2012. С.455–489.
Miller L.T., Watson W.H., Kirlin W.G., Ziegler T.R., Jones D.P. Oxidation of the glutathione/glutathione disulfide redox state is induced by cysteine deficiency in human colon carcinoma HT29 cells // The Journal of nutrition. 2002. 132:2303–2306.
Южук Н.Д., Ахмедова М.Д., Васюк Ю.А. Диагностическое значение тиолдисульфидного звена антиоксидантной системы при бруцеллезе. Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 7. С. 10−12.
Jones D.P., Go Y.M., Anderson C.L., Ziegler T.R., Kinkade J.M., Kirlin W.G. Cysteine/cystine couple is a newlyrecognized node in the circuitry for biological redox signaling and control // Faseb J. 2004. V.18. P.1246−1248.
Iyer S.S., Jones D.P., Brigham K.L., Rojas M. Oxidation of plasma cysteine/cystine redox state in endotoxin-induced lung injury // Am.J.Respir.cell Mol.Biol. 2009. V.40. P.90−98.
Afzal M., Afzal A., Jones A., Armstrong D. A rapid method for the quantification of GSH and GSSG in biological samples // Oxidative stress. Biomarkers and antioxidant protocols. 2002. P.117−122.
Hogarth l.A., Rabello C.M.A., Hall A.G. Measurement of reduced glutathione using HPLC //
Methods in molecular medicine. Vol.28. Ed. R.Brown. Humana Press, 2008.
Bald E., Głowacki R. Analysis of saliva for glutathione and metabolically related thiols by liquid chromatography with ultraviolet detection // Amino Acids 2005. 28. P.431−433.
Khan M.I., Iqbal Z. Simultaneous determination of ascorbic acid, aminothiols, and methionine in biological matrices using ion-pairing RP-HPLC coupled with electrochemical detector // J.Chromatogr. B 2011. 879. P.2567−2575.
Bronowicka-Adamska P., Zagajewski J., Czubak J.,
Wrobel M. RP-HPLC method for quantitative determination of cystathionine, cysteine and glutathione: An application for the study of the metabolism of cysteine in human brain //
J.Chromatogr. B 2011. 879. P.2005−2009.
Bald E., Chwatko G., Głowacki R., Kusmierek K. Analysis of plasma thiols by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection //
J.Chromatogr. A 2004. 1032. P.109−115.
Kaniowska E., Chwatko G., Głowacki R.,
Kubalczyk P., Bald E. Urinary excretion measurement of cysteine and homocysteine in the form of their S-pyridinium derivatives by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection //
J.Chromatogr. A 1998. 798. P.27−35.
Cevasco G., Piątek A.M., Scapolla C., Thea S. An improved method for simultaneous analysis of aminothiols in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection //
J.Chromatogr. A 2010. 1217. P.2158−2162.
Guan X., Hoffman B., Dwivedi C., Matthees D.P.
A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples // J.Pharm. Biomed. Anal. 2003. 31.
P.251−261.
Huang Y.Q., Ruan G.D., Liu J.Q., Gao Q., Feng Y.Q. Use of isotope differential derivatization for simultaneous determination of thiols and oxidized thiols by liquid chromatography tandem mass spectrometry // Anal.Biochem. 2011. 416.
P.159−166.
Droge W., Breitkeutz R. Glutathione and immune function // Proc.Nutr.Soc. 2000. V.59. P.595−600.
Giustarini D., Dalle-Donne I., Colombo R., Milza-ni A., Rossi R. An improved HPLC measurement for GSH and GSSG in human blood // Free Radical Biol.Med. 2003. 35. P.1365−1372.
Moore T., Le A., Niemi A.K., Kwan T., Cusmano-Ozog K., Enns G.M., Cowan T.M. A new LC−MS/MS method for the clinical determination of reduced and oxidized glutathione from whole blood //
J.Chromatogr. B 2013. 929. P.51−55.
Toyo’oka T. Recent advances in separation and detection methods for thiol compounds in biological samples // J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3318−3330.
Raguso C.A., Regan M.M., Young V.R. Cysteine kinetics and oxidants at different intakes of methionine and cystine in young adults // Am.J.Clin.Nutr. 2000. V.71. P.491−499.
Berndt C., Lillig C.H., Holmgren A. Thiol-based mechanisms of the thioredoxin and glutaredoxin systems-implications for diseases in the cardiovascular system // Am.J.Physiol.Heart Circ. Physiol. 2007. V.292. P.1227−1236.
Halvey P.J., Watson W.H., Hansen J.M., Go Y.-M., Samali A., Jones D.P. Compartmental oxidation of thiol-disulphide redox couples during epidermal growth factor signaling // Biochem.J. 2005 V.386. P.215−219.
Jones D.P. Redox potential of GSH/GSSG couple: assay and biological significance // Methods in enzymology. 2002. 348. P. 93–112.
Moriarty S.E., Shah J.H., Lynn M., Jiang S., Openo K., Jones D.P., Sternberg P. Oxidation of glutathione and cysteine in human plasma associated with smoking // Free radical biology & medicine. 2003. 35. P.1582–1588.
Тиолы играют важную роль в биологических процессах. Биологические тиолы – продукты метаболизма серы. Их активно изучают, поскольку точное и надежное определение тиолов и их метаболитов в биологических жидкостях и тканях имеет большое значение.
Как химические соединения тиолы (RSH) относятся к тиоспиртам (их называют также меркаптанами) и содержат сульфогидрильную группу (SH). Если эти группы пространственно доступны (не связаны в белках), то тиолы активно вступают во многие химические реакции, имеющие биологическое значение. При таких взаимодействиях могут возникать связи -S-C-, -S-металл, -S-S-, -S-O-. Биологическая активность тиолов в основном зависит от легкой окисляемости связи тиольной группы -S-H до дисульфидной группы (-S-S-) из-за многих валентных состояний атома серы. Дисульфидные группы устойчивы к дальнейшему окислению.
Соединения с тиольными группами – антиоксиданты, в частности цистеин, цистеинилглицин, глутатион (g-L-глутамил-L-цистеинилглицин, GSH), гомоцистеин и др. Эти антиоксиданты защищают биологические системы от окисления. Среди них наиболее важен глутатион (GSH), присутствующий в клетках в миллимольных концентрациях и в меньшем количестве – в межклеточных жидкостях, таких как плазма. Глутатион восстановленный наиболее сильно влияет на окислительно-восстановительное равновесие в клетках и биологических жидкостях, нейтрализует свободные радикалы и, кроме того, регенерирует другие антиоксиданты, такие как витамины С и Е.
Многочисленные исследования показывают, что по концентрации тиолов в биологических жидкостях можно судить о заболеваниях человека и метаболических нарушениях, связанных с окислительным стрессом. Например, по общему содержанию гомоцистеина и цистеина проводят клинический анализ генетических и метаболических заболеваний.
Кроме низкомолекулярных тиолов есть и высокомолекулярные, в частности тиоредоксин и альбумин. Тиоредоксин – это белок, который действует как антиоксидант, облегчая восстановление в других белках цистеинового равновесия тиол-дисульфид. Тиоредоксин есть в организмах всех млекопитающих и весьма важен для поддержания жизни. В составе тиоредоксина присутствуют две тиольные группы, расположенные рядом. Эти две молекулы цистеина – ключевые в способности тиоредоксина восстанавливать другие белки. Альбумин – основной компонент общих тиольных групп в плазме, это белок с молекулярной массой 65 000 а.е.м., растворимый в воде, солевых растворах, кислотах и щелочах.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОЛОВ
В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
Надежное определение тиолов в биологических жидкостях – сложная задача. Для этого используют разные аналитические методы с предварительным разделением и без разделения: ВЭЖХ, газовую хроматографию, капиллярный электрофорез, ГХ-МС, ГХ-МС/МС, ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС [1]. Без разделения применяют спектроскопические (УФ- и флуориметрия), электрохимические (амперометрия) и масс-спектрометрические (МС) методы. С предварительным разделением можно применять капиллярный электрофорез, газовую хроматографию (ГХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и сочетание ГХ-МС и ВЭЖХ-МС [1,2]. Сегодня чаще всего для анализа тиолов используют ВЭЖХ с разными детектирующими устройствами. Среди методов ВЭЖХ выделим обращенно-фазовую, ион-парную, ион-обменную, ультраВЭЖХ. Для исследования тиоредоксинов подходит аффинная хроматография [3]. В таблице 1 приведены методы детектирования и достигаемые с их помощью пределы обнаружения тиолов [1].
Электрохимическое детектирование (ЭД). Отметим, что самые низкие пределы обнаружения на уровне фемтомолей имеют электрохимические детекторы [10]. Они сегодня привлекают все больший интерес за счет высокой чувствительности и селективности определения тиольных соединений в сложных биологических матрицах без концентрирования и дериватизации. В [11] обобщены результаты исследований ВЭЖХ с амперометрическим детектором. В этом обзоре процитированы 34 статьи по определению GSH в плазме, моче, сыворотке, слезах, тканях мозга, эритроцитах и других объектах. В качестве рабочих электродов амперометрического детектора в этих работах были использованы следующие материалы: углерод, стеклоуглерод, медь, платина, золото. Потенциалы, приложенные к рабочему электроду, были в пределах 0,46–1,6 мВ. В последние годы опубликовано много интересных статей по применению электрохимических детекторов для определения тиолов [11–17]. Нами в работах [21,22] было показано, что методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором можно напрямую определять цистеин, восстановленный глутатион и мочевую кислоту в сыворотке человека.
УФ-детектирование. Тиолы и диосульфиды в своем составе не имеют хромофорных групп, и оптические детекторы без дериватизации их не определяют. Поэтому тиолы предварительно переводят в производные, имеющие полосы поглощения в УФ-области. В качестве дериватизирующих агентов используют 5,5-дитио-бис-нитробензойную кислоту, 2-хлор-1-метилхинониумтетрафторборат, 1-хлор-2,4-динитробензол и др. Регистрацию химически связанных тиолов производят на длинах волн 280, 330, 340, 350 нм в зависимости от дериватизирующего агента.
Флуориметрическое детектирование также проводят с тиолами в виде производных с монобромбимоном или о-фталевым альдегидом [6–8]. Cпектр возбуждения состоит из линий 380, 381, 386, 390 нм, спектр эмиссии – 376, 390, 478, 510, 512, 516 нм. Минимальное значение предела обнаружения: 0,4–3 пикоМ [6–8].
Масс-спектрометрическое детектирование не требует дериватизации, кроме того, его можно использовать как для качественного, так и для количественного анализов [2–9].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ТИОЛОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ЖИДКОСТЯХ ЧЕЛОВЕКА
В [20] представлены результаты исследования динамики концентрации CysН и GSH в течение суток в плазме здоровых людей (63 человека) после приема белков: 0,8 г белка на кг веса в день с S-содержащими аминокислотами, 20 мг на кг в день таких аминокислот. Концентрации CySН и GSH максимальны через 3 и 6 часов после еды соответственно. Соотношения GSH/GSSG и CySН/CySS также менялись в основном в соответствии с изменением концентраций тиольных групп. У пожилых людей (свыше 60 лет) соотношение CySН/CySS увеличивалось в 1,8 раза быстрее, чем у молодых (менее 40 лет). Эти данные надо учитывать при анализе тиолов.
В работах [2,9] исследовано содержание глутатиона хроматографическими и масс-спектрометрическими методами в биологических пробах. GSH – основное небелковое внутриклеточное тиольное соединение, которое играет главную роль в защите клеток и тканей от окислительного стресса. GSH присутствует во всех органах, в том числе и в печени. Концентрация GSH внутри клеток на уровне мМ, а в плазме – мкМ. В клетках GSH содержится как в свободном виде, так и связанном с белками. После окисления GSH до GSSG под действием фермента глутатионредуктазы происходит восстановление GSSG до GSH. У здоровых людей соотношение GSH/GSSG около 100:1, при разных заболеваниях оно может уменьшаться до 10:1 или даже к 1:1 [2]. Исследования показали, что концентрации GSH и GSSG зависят от состояния организма и при многих болезнях их соотношение изменяется в сторону роста окисленных форм. Например, при СПИДе – до 0,3; диабете – до 5; хронических болезнях – до 14,7; атеросклерозе – до 21,4; раке молочной железы – до 18,3 (начальная стадия) и 5,9 (после развития опухоли); раке прямой кишки – до 41 (начальная стадия) и 10,5 (после развития опухоли); при сильных физических нагрузках – до 0,4–16,0. В работе [6] проведено одновременное определение глутатиона, цистеина, гомоцистеина и цистенил глицина в биологических жидкостях (плазма, слюна, моча) методом ион-парной ВЭЖХ с предварительной дериватизацией этих компонентов. В таблице 2 приведены значения измеренных концентраций в биологических жидкостях.
В большом обзоре [21] представлены данные о биосинтезе глутатиона, его защитной роли и методах измерения. В клетках концентрация GSH установлена в пределах 1–2 мМ, а в гепатоцитах (hepatocytes) около 10 мМ. Высокая концентрация GSH наблюдается в клетках эпителия. В [21] обсуждаются изменения внутриклеточного GSH при патологии легких, печени и разных вирусных болезнях, а также возможная терапия глутатионом (GSH) онкологических заболеваний.
Определение эндогенных тиолов и тиольных лекарств в моче методом ВЭЖХ с УФ-детектированием описано в статье [5]. Содержание CySН в моче установлено около 30 мМ на моль креатинина (среднее из 10 измерений). Среди анализируемых тиолов: цистеин, цистеинилглицин, гомоцистеин, N-ацетилцистеин, тиогликолевая кислота. Тиольные лекарства, определяемые в моче, следующие: цистеамин, тиопронин, D-пенисиламин, каптоприл, метимазол, пропилтиоурацил, тиогуанин.
В [2] представлены результаты исследования зависимости между уровнем окисленных и восстановленных тиолов при раннем атеросклерозе у взрослых людей (114 человек) методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором. Определены средние значения: GSH – 1,6 мкМ, GSSG – 0,11 мкМ, CySН – 10 мкМ, CySS – 80 мкМ. Основной вывод работы – определение соотношений GSH/GSSG как меры окислительного стресса поможет выявить у пациентов риск развития раннего атеросклероза.
Влияние дефицита цистеина на концентрации GSH, GSSG в клетках Н29 карциномы прямой кишки изучено в работе [23]. В контрольных измерениях содержание в мкМ/л составило: GSH – 951, GSSG – 14, при дефиците цистеина: GSH – 11, GSSG – 1,3. Таким образом, показано, что содержание восстановленного глутатиона GSH в 90 раз, а содержание GSSG в 10 раз меньше при дефиците CySН.
Диагностическое значение тиосульфидного звена антиоксидантной системы изучено при бруцеллезе [24]. Обследовано 320 больных бруцеллезом в острой (160 человек) и хронической форме
(162 человека), у некоторых также выявлены сердечно-сосудистые заболевания. Показатели контрольной группы (мМ): CySH – 11,7; CySS – 4,5;
CySH/CySS – 2,6. У больных бруцеллезом они изменены: CySH – 7,2; CySS – 5,5; CySH/CySS – 1,3. Отношение CySH/CySS у больных уменьшилось в 2 раза, это свидетельствует о функциональной недостаточности антиоксидантной системы у больных.
Соотношение цистеин/цистин – новый знак в схеме биологической редокс-сигнализации и контроля [25]. В этой работе было установлено содержание цистеина и цистина в клетках: 126 и 31 мкМ соответственно. Окисление цистеина в плазме наблюдалось с помощью ВЭЖХ при эндотоксиновых нарушениях легких [26].
Количественное определение GSH и GSSG в биологических пробах оформлено как антиоксидантный протокол [27] с использованием ВЭЖХ с УФ-детектированием при 210 нм и с флуориметрическим детектором [28].
В таблице 3 приведены способы определения тиолов методом ВЭЖХ с разными детекторами при некоторых патологических состояниях человека.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итак, накоплена обширная информация по исследованию связи между состоянием организма и содержанием тиолов, особенно соотношения восстановленных и окисленных форм (CySH/CySS, GSH/GSSG). Разработаны методы их определения в биологических жидкостях и материалах на основе ВЭЖХ с разными детектирующими устройствами. Следующий шаг – тщательный анализ полученного массива данных, сравнение методов между собой и выбор самых надежных для клинических анализов. С нашей точки зрения, наиболее перспективны электрохимические и масс-спектрометрические детекторы, которые позволяют напрямую без дериватизации определять тиолы при очень малых количествах на уровне фемтомолей [10].
На практике этот метод очень перспективен для экспресс-контроля общего состояния организма как в обычных, так и в экстремальных условиях. Например, для спортсменов определение соотношения восстановленных и окисленных форм CySH/CySS и GSH/GSSG позволит оценить предельный уровень тренировочных нагрузок, после которых организм еще может быстро восстановиться, тем самым не допуская перетренировок.
ЛИТЕРАТУРА
Bayram B., Rimbach G., Frank J., Esatbeyoglui. Rapid method for glutathione quantitation using HPLC with coulometric electrochemical detection // J.Agric.Food.Chem. 2014. V.62. P.402–408.
Iwasaki Y., Saito Y., Nakano Y. et al. Chromatographic and mass spectrometric analysis of glutathione in biological samples // J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3309–3317.
Hisabori T., Hara S., Fujii T., Yamazaki D. et al. Thioredoxin affinity chromatography- a useful method for further understanding the thioredoxin network // Y.Exper. Botany. 2005. V.56. P.1463–1468.
Glowacki R., Bald E. Fully automated method for simultaneous determination of total cysteine, cysteinylglycine, glutathione and homocysteine in plasma by HPLC with UV absorbance detection // J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3400–3404.
Kušmierek K., Chwatko G., Glowacki R., Bald E. Determination of endogenous thiols and thiol drugs in urine by HPLC with ultraviolet detection // J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3300–3308.
Zhang W., Li P., Geng Q., Duan Y., Guo M., Cao Y.
Simultaneous determination of glutathione, cysteine, homocysteine and cysteinylglycine in biological fluids by ion-pairing HPLC coupled with precolumn derivatization // J.Agric.Food.Chem. 2014. V.62. P.5845–5852.
McMenamin M.E., Hummelfarb J., Nolin T.D. Simultaneous analysis of multiple aminothiols in human plasma by HPLC with fluorescence detection //
J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3274–3281.
Cereser C., Guichard J., Drai J., Bannier E., Garcia I., Boget S., Parvaz P., Revol A. Quantification of reduced and total glutathione at the femtomole level by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection: application to red blood cells and cultured fibroblasts // J.Chromatogr. B 2001. 752. P.123−132.
Norris R.L., Eaglesham G.K., Shaw G.R., Smith M.J., Chiswell R.K., Seawright A.A., Moore M.R. A sensitive and specific assay for glutathione with potential application to glutathione disulfide, using high-performance liquid chromatography−tandem mass spectrometry //
J.Chromatogr. B 2001. 762. P.17−23.
Hiraku Y., Murata M., Kawanishi S. Determination of intracellular glutathione and thiols by high performance liquid chromatography with a gold electrode at the femtomole level: comparison with a spectroscopic assay // Biochim.Biophys.Acta. 2002. 1570. P.47−52.
White P.C., Lawrence N.S., Davis J., Compton R.G. Electrochemical determination of thiols-a perspective // Electroanalysis. 2002. V.14. P.89–98.
Petrlova J., Mikelova R., Stejskal K., Kleckerova A., Zitka O., Petrek J., Havel L., Zehnalek J., Adam V., Trnkova L. Simultaneous determination of eight biologically active thiol compounds using gradient elution-liquid chromatography with Coul-Array detection // J.Sep.Sci. 2006. 29. P.1166−1173.
Yao X., Wang Y., Chen G. Simultaneous determination of aminothiols, ascorbic acid and uric acid in biological samples by capillary electrophoresis with electrochemical detection // Biomed.Chromatogr. 2007. 21. P.520−256.
Spadaro A.; Bousquet E., Santagati N.A., Vittorio F., Ronsisvalle G. Simple analysis of glutathione in human colon carcinoma cells and epidermoid human larynx carcinoma cells by HPLC with electrochemical detection // Chromatographia 2005. 62. 11−15.
Khan A., Khan M. I., Iqbal Z., Shah Y., Ahmad L., Nazir S., Watson D.G., Khan J.A., Nasir F., Khan A. A new HPLC method for the simultaneous determination of ascorbic acid and aminothiols in human plasma and erythrocytes using electrochemical detection // Talanta 2011. 84. P.789−801.
Steele M.L., Ooi L., Münch G. Development of a high performance liquid chromatography method for the simultaneous quantification of glutathione and related thiols // Anal.Biochem. 2012. 429. P.45−52.
Park H.J., Mah E., Bruno R.S. Validation of high-performance liquid chromatography-boron-doped diamond detection for assessing hepatic glutathione redox status // Anal.Biochem. 2010. 407. P.151−159.
Blanco R.A., Ziegler T.R., Carlson B.A. et al. Diurnal variation in glutathione and cysteine redox states in human plasma // Am.J.Clin.Nutr. 2007. V.86. P.1016−1023.
Forman H.J., Zhang H., Rinna A., Glutathione. Overview of its protective roles , measurement and biosynthesis // Mol.Aspects Med. 2009. V.30. P.1−12.
Ashfag S., Abramson J.L., Jones D.P., Rhodes S.D. et al. The relationship between plasma levels of oxidized and reduced thiols and early atherosclerosis in healthy adults // J.Am.Coll.Cardiol. 2006. V.47. P.1005−1007.
Яшин Я.И., Яшин А.Я. ВЭЖХ маркеров окислительного стресса // Аналитика. 2011. № 1. С.34−43.
Яшин Я.И., Яшин А.Я., Черноусова Н.И., Федина П.А. Диагностика окислительного стресса – предшественника опасных болезней и преждевременного старения и антиоксидантная терапия // Anti-age medicine: наука оставаться молодым / коллектив авторов; под ред. А.И.Труханова, М.: Асвомед. 2012. С.455–489.
Miller L.T., Watson W.H., Kirlin W.G., Ziegler T.R., Jones D.P. Oxidation of the glutathione/glutathione disulfide redox state is induced by cysteine deficiency in human colon carcinoma HT29 cells // The Journal of nutrition. 2002. 132:2303–2306.
Южук Н.Д., Ахмедова М.Д., Васюк Ю.А. Диагностическое значение тиолдисульфидного звена антиоксидантной системы при бруцеллезе. Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 7. С. 10−12.
Jones D.P., Go Y.M., Anderson C.L., Ziegler T.R., Kinkade J.M., Kirlin W.G. Cysteine/cystine couple is a newlyrecognized node in the circuitry for biological redox signaling and control // Faseb J. 2004. V.18. P.1246−1248.
Iyer S.S., Jones D.P., Brigham K.L., Rojas M. Oxidation of plasma cysteine/cystine redox state in endotoxin-induced lung injury // Am.J.Respir.cell Mol.Biol. 2009. V.40. P.90−98.
Afzal M., Afzal A., Jones A., Armstrong D. A rapid method for the quantification of GSH and GSSG in biological samples // Oxidative stress. Biomarkers and antioxidant protocols. 2002. P.117−122.
Hogarth l.A., Rabello C.M.A., Hall A.G. Measurement of reduced glutathione using HPLC //
Methods in molecular medicine. Vol.28. Ed. R.Brown. Humana Press, 2008.
Bald E., Głowacki R. Analysis of saliva for glutathione and metabolically related thiols by liquid chromatography with ultraviolet detection // Amino Acids 2005. 28. P.431−433.
Khan M.I., Iqbal Z. Simultaneous determination of ascorbic acid, aminothiols, and methionine in biological matrices using ion-pairing RP-HPLC coupled with electrochemical detector // J.Chromatogr. B 2011. 879. P.2567−2575.
Bronowicka-Adamska P., Zagajewski J., Czubak J.,
Wrobel M. RP-HPLC method for quantitative determination of cystathionine, cysteine and glutathione: An application for the study of the metabolism of cysteine in human brain //
J.Chromatogr. B 2011. 879. P.2005−2009.
Bald E., Chwatko G., Głowacki R., Kusmierek K. Analysis of plasma thiols by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection //
J.Chromatogr. A 2004. 1032. P.109−115.
Kaniowska E., Chwatko G., Głowacki R.,
Kubalczyk P., Bald E. Urinary excretion measurement of cysteine and homocysteine in the form of their S-pyridinium derivatives by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection //
J.Chromatogr. A 1998. 798. P.27−35.
Cevasco G., Piątek A.M., Scapolla C., Thea S. An improved method for simultaneous analysis of aminothiols in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection //
J.Chromatogr. A 2010. 1217. P.2158−2162.
Guan X., Hoffman B., Dwivedi C., Matthees D.P.
A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples // J.Pharm. Biomed. Anal. 2003. 31.
P.251−261.
Huang Y.Q., Ruan G.D., Liu J.Q., Gao Q., Feng Y.Q. Use of isotope differential derivatization for simultaneous determination of thiols and oxidized thiols by liquid chromatography tandem mass spectrometry // Anal.Biochem. 2011. 416.
P.159−166.
Droge W., Breitkeutz R. Glutathione and immune function // Proc.Nutr.Soc. 2000. V.59. P.595−600.
Giustarini D., Dalle-Donne I., Colombo R., Milza-ni A., Rossi R. An improved HPLC measurement for GSH and GSSG in human blood // Free Radical Biol.Med. 2003. 35. P.1365−1372.
Moore T., Le A., Niemi A.K., Kwan T., Cusmano-Ozog K., Enns G.M., Cowan T.M. A new LC−MS/MS method for the clinical determination of reduced and oxidized glutathione from whole blood //
J.Chromatogr. B 2013. 929. P.51−55.
Toyo’oka T. Recent advances in separation and detection methods for thiol compounds in biological samples // J.Chromatogr. B 2009. V.877. P.3318−3330.
Raguso C.A., Regan M.M., Young V.R. Cysteine kinetics and oxidants at different intakes of methionine and cystine in young adults // Am.J.Clin.Nutr. 2000. V.71. P.491−499.
Berndt C., Lillig C.H., Holmgren A. Thiol-based mechanisms of the thioredoxin and glutaredoxin systems-implications for diseases in the cardiovascular system // Am.J.Physiol.Heart Circ. Physiol. 2007. V.292. P.1227−1236.
Halvey P.J., Watson W.H., Hansen J.M., Go Y.-M., Samali A., Jones D.P. Compartmental oxidation of thiol-disulphide redox couples during epidermal growth factor signaling // Biochem.J. 2005 V.386. P.215−219.
Jones D.P. Redox potential of GSH/GSSG couple: assay and biological significance // Methods in enzymology. 2002. 348. P. 93–112.
Moriarty S.E., Shah J.H., Lynn M., Jiang S., Openo K., Jones D.P., Sternberg P. Oxidation of glutathione and cysteine in human plasma associated with smoking // Free radical biology & medicine. 2003. 35. P.1582–1588.
Отзывы читателей
