eng
Выпуск #5/2017
О.В.Ласточкина, П.В.Горелов
Биологические микрочипы – новый уровень лабораторных исследований
Биологические микрочипы – новый уровень лабораторных исследований
Просмотры: 7292
Представлен обзор публикаций, посвященных использованию технологии микрочипов в различных молекулярно-генетических, биотехнологических и других исследованиях, в медицинской диагностике, при назначении эффективного лечения и составлении прогноза течения заболеваний, а также в криминалистике и обеспечении биобезопасности.
УДК 54.07, 57.083; ВАК 02.00.02, 03.01.06
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.36.5.76.86
УДК 54.07, 57.083; ВАК 02.00.02, 03.01.06
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.36.5.76.86
Технология микрочипов – принципиально новый уровень лабораторных исследований, позволяющий за короткое время проводить одновременное тестирование тысяч образцов и, в зависимости от поставленной задачи, идентифицировать генетические дефекты, определенные белки, метаболиты, онкогены, аллергены, биологически активные малые молекулы и др. Биочип представляет собой нерастворимую стеклянную, пластиковую, гелевую или кремниевую матрицу с множеством иммобилизованных на ней биологических объектов (фрагментов ДНК, белков, ферментов, клеточных лизатов и др.), которые способны избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе [1]. Принцип действия биочипов показан на (рис.1) на примере олигонуклеотидного чипа. На матричную подложку иммобилизуют одноцепочечный олигонуклеотид (пробу). При добавлении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК, например генома человека, происходит их высокоспецифичное взаимодействие. В случае комплементарного связывания пробы с фрагментом ДНК в соответствующем элементе чипа наблюдается свечение.
В зависимости от типа молекулы, нанесенной на подложку, биочипы можно разделить на несколько классов. Основная доля производимых в мире биологических микрочипов приходится на ДНК-чипы (90%), содержащие фрагменты ДНК длиной от 10 до 1 000 нуклеотидов. К биочипам этого класса относят и олигонуклеотидные чипы, включающие 10–70 нуклеотидных оснований, принадлежащие к одному и тому же гену. На подложку белковых чипов, составляющих 7–10% всех производимых чипов, наносятся белковые молекулы: ферменты, антитела, антигены и др. Оставшиеся 3% биочипов составляют тканевые и клеточные микрочипы, а также микрочипы на основе малых молекул. На платформу тканевых чипов наносятся образцы тканей для определения содержания белков в здоровых и патологически измененных тканях и оценки потенциальных мишеней для лекарственных препаратов. На платформу клеточных чипов наносятся клетки или лизаты клеток, например, для определения чувствительности к антибиотикам и ксенобиотикам [2]. Микрочипы на основе малых молекул используются для идентификации биологически значимых природных и синтетических малых молекул [3].
По своему назначению биологические микрочипы бывают аналитические, функциональные и чипы с обращенной фазой [1] (рис.2). Аналитические чипы (рис.2а) предназначены для изучения связывания молекул, нанесенных на подложку, с молекулами-партнерами, находящимися в растворе. На подложку таких биочипов наносят антитела, белки-мишени, ДНК, аптамеры или низкомолекулярные лиганды. Функциональные чипы (рис.2б) служат для изучения экспрессии генов или белков, для изучения профиля активности белков, а также при диагностике определенных заболеваний. Эти чипы содержат широкий спектр различных белков или пептидов, иммобилизованных на единую подложку. Аналитические и функциональные чипы относятся к так называемым биочипам с прямой фазой (Forward-phase Microarrays). В таких чипах происходит связывание одной биологической мишени, нанесенной на чип, с одной из множественных потенциальных молекул-партнеров аналита. Принципиально противоположным типом чипов являются чипы с обращенной фазой (RPPA, reverse phase protein array, рис.2в). На матрицу таких чипов наносят лизаты клеток или образцы тканей, содержащие все присущие клетке или ткани белки, а затем обрабатывают их раствором, содержащим специфический к выявляемому веществу лиганд. Таким образом, чипы с обращенной фазой можно рассматривать как миниатюрное воплощение иммуногистохимического метода.
В последние годы появились такие новые интегративные подходы, как геномика, протеомика и селломика, позволяющие устанавливать структуру и изучать процессы на уровне генов всего генома, белков всей клетки или клеток всей ткани. Биологические микрочипы позволяют в достаточно простых и доступных экспериментах изучать экспрессию генов и белков различных бактерий и человека [4].
Широкое распространение биочиповых исследований связано с высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью, простотой выполнения процедуры, возможностью одновременного анализа множества параметров и невысокой стоимостью. Технология микрочипов может использоваться как для исследовательских, так и для диагностических целей в разных областях науки и практики.
БИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА
Технология биологических микрочипов является наиболее подходящим методом для изучения генетической предрасположенности к многофакторным и инфекционным заболеваниям, влияния различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов, изучения фармакогенетики и создания "генетического паспорта", для прогнозирования исхода заболевания и изучения механизмов биологических процессов.
Области приложения биочипов в биологии и медицине показаны на рис.3.
Лабораторная диагностика. Биочипы в лабораторной диагностике применяются в онкологии, вирусной неонатологии, акушерстве и гинекологии, онкогематологии и др. [5–10].
Биочипы могут служить удобным инструментом при анализе различных генетических изменений, включая генетический полиморфизм, точечные мутации и некоторые хромосомные перестройки.
Так, продемонстрирована эффективность практического применения биочипов тест-системы ПФ-биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации, участвующих в метаболизме ксенобиотиков (лекарственные препараты, канцерогены, продукты питания и т.д.), в гене NAT2 и генах ренин-ангиотензиновой системы, участвующих в регуляции кровяного давления. Эта диагностическая тест-система зарегистрирована в Росздравнадзоре (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/5317-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике. ПФ-биочип используется в ФГБНУ "НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта" и ФГАУ "Научный центр здоровья детей" для определения индивидуальной чувствительности к некоторым лекарственным препаратам, в том числе тиопуринам, а также риска развития некоторых многофакторных заболеваний и составления генетического паспорта [11].
Использование технологии ДНК-микрочипов позволило идентифицировать ключевые гены, связанные с предрасположенностью к возникновению рака желудка [6].
Были проведены масштабные исследования по изучению геномов пациентов с различными заболеваниями: атеросклероз, ожирение, диабет, рак легких и простаты, сердечно-сосудистые заболевания, астма, хронические заболевания легких, болезнь Альцгеймера и многие другие [12]. Разработана микрочиповая нанотехнология ClearRead (Nanosphere) с применением наночастиц золота для исследования однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), которая может использоваться для анализа ДНК человека, полученной из образцов размером с каплю крови. Технология от Nanosphere позволяет быстро, просто и точно генотипировать любые последовательности ДНК на наличие ОНП для выявления генетических заболеваний, предрасположенности к мультифакторным болезням, а также для прогнозирования метаболического ответа на фармакологические препараты [12].
Благодаря появлению ДНК-чипов появилась возможность производить анализ мутаций во всех генах генома одновременно. Для анализа всех возможных мутаций во всех генах человека достаточно ДНК-чипа с количеством ячеек 100–200 млн, что технически достижимо. Современные ДНК-микрочипы могут выявить около миллиона мутаций [13].
К настоящему моменту создан метод диагностики 13-ти транслокаций при острых и хронических лейкозах с использованием олигонуклеотидных биочипов. Впервые в России определены частоты этих транслокаций у детей, больных лейкозом. Диагностическая тест-система ЛК-биочип для анализа хромосомных транслокаций при лейкозах зарегистрирована в Росздравнадзоре (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/4756-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике [11].
В работе Т.В.Павловой [14] впервые была представлена модифицированная технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах. Данная технология перспективна для масштабного скринирования структурных (деление и амплификация) и эпигеномных (метилирование) изменений в геномах опухолевых клеток. Информация об этих изменениях может служить предварительной базой для выявления потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста и наиболее перспективных опухолевых маркеров [14].
Наибольшие успехи в применении биочипов для классификации и прогноза течения заболеваний достигнуты в области онкологии, а именно, идентификации мутаций, вызывающих онкологические заболевания [15]. Национальным Институтом рака США проведено типирование 60-ти видов различных раковых клеток с использованием чипа, содержащего 9703 кДНК, и показано, что характер генетической экспрессии меняется в соответствии с происхождением ткани. Выявлено, что общий подход позволяет идентифицировать профиль транскрипции и классифицировать тип опухоли, а затем найти корреляции между этим типом и прогнозом течения заболевания [16, 25]. Клиническое применение профилей транскрипции, получаемых с помощью биочипов, детально отработано для рака молочной железы [16, 17].
Технология биочипов может помочь осуществить переход от массового лечения к персонализованной медицине (ПМ), главной задачей которой является поиск конкретного лекарства для конкретного пациента в соответствии с его генотипом [15, 18]. Использование биочипов в ПМ можно проиллюстрировать на примере поиска вариаций числа генетических копий (CNV) у больных аутизмом и психозами с ранним началом в рамках проекта PsychCNVs [19]. Возможность эффективного поиска редких вариабельных последовательностей появилась после разработки микрочипа HumanCNV370 (deCODE genetics), позволяющего выявлять десятки тысяч последовательностей ДНК, связанных с этими заболеваниями. Эта разработка, включающая в себя высокотехнологичное программное обеспечение, является одной из наиболее эффективных в мире для анализа вариабельных последовательностей ДНК [19]. Описано применение биочипов для определения чувствительности раковых клеток к применяемым противораковым препаратам [24], что служит еще одним шагом к применению препаратов, эффективных именно для данного больного.
ДНК-микрочипы позволяют диагностировать широкий спектр заболеваний, таких как шизофрения, склероз, ишемическая и неишемическая кардиомиопатии, болезнь Крона, ревматоидный артрит [12, 20].
Биочипы применяются в иммунодиагностике для обнаружения антигенов и антител к ним при инфекционных и аутоиммунных заболеваниях, а также для обнаружения биомаркеров, то есть веществ, наличие которых указывает на развитие какого-либо заболевания раньше, чем проявятся клинические признаки.
Показана возможность одновременного количественного определения девяти онкомаркеров: альфа-фетопротеина, раково-эмбрионального антигена, хорионического гонадотропина человека, раковых антигенов СА125, СА15-3, СА19-9, двух форм простат-специфического антигена (ПСАобщ и ПСАсвоб) [5]. В работе А.В.Шишкина [21] описано применение исследовательско-диагностического комплекса для изучения нормальных и опухолевых клеток крови на основе иммунобиочипов с возможностью одновременного проведения иммуноморфологических и иммуноцитохимических исследований клеток [21]. Этот комплекс пригоден для решения задач различного уровня сложности в лабораториях с разным уровнем оснащенности.
Была показана возможность использования биочипов в диагностике аутоимунных заболеваний, например, буллезного эпидермолиза [22], вульгарной пузырчатки (Pemphigus vulgaris) [23].
Вирусология и бактериология. Биочипы активно разрабатываются и применяются в вирусологии и микробиологии [26–27].
Показана эффективность применения биологических ДНК-микрочипов для этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы [27]. Авторам удалось одновременно выявить и идентифицировать ДНК патогенных и условно-патогенных возбудителей острых кишечных инфекций: Shigella spp.+EIEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis [27].
Ю.-Ч Чанг (Yu-Ch. Chiang) и соавт. [26] разработали биочип для определения пяти главных сероваров Salmonella (Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Hadar, Virchow) и показали возможность его использования для быстрого и надежного выявления клеток сальмонелл.
Разработан биочип, позволяющий идентифицировать 15 вариантов гемагглютинина (Н1-Н15) и два варианта нейраминидазы (N1, N2) вируса гриппа А [28]. Процедура определения вирусного подтипа не требует выполнения предварительных стадий культивирования вируса, а результаты анализа могут быть получены в течение 10 ч. На выборке из 41-го образца были определены специфичность и чувствительность предложенного метода идентификации вирусного подтипа (100% и 76%, соответственно). Аналитическая чувствительность метода составила 10 ЭИДзо/мл. В этой работе было показано, что предложенный подход обладает высокой специфичностью и может использоваться для разработки ДНК-микрочипов, нацеленных на генотипирование вирусов, характеризующихся высокой изменчивостью [28]. Необходимое оборудование установлено в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского в г. Москве и используется для определения этиологического агента эпизоотий и эпидемиологического мониторинга вирусов гриппа.
Оценена возможность использования ДНК-микрочипов для быстрого определения наиболее распространенных β-лактамаз, плазмид-опосредованных цефалоспориназ и карбапенемаз у Enterobacteriaceae, Pseudomonas и Acinetobacter [29]. Показана эффективность использования нового ДНК-чипа низкой плотности Check-MDR CT103 XL (Check-Points, Нидерланды) в определении наиболее значимых генов β-лактамаз – ESBLs (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaBEL, blaPER, blaGES and blaVEB), pAmpCs (blaCMY-2-like, blaDHA, blaFOX, blaACC-1, blaACT/MIR и blaCMY-1-like/MOX) и карбапенемаз (blaKPC, blaOXA-48, blaVIM, blaIMP, blaNDM, blaGIM, blaSPM, blaOXA-23, -24 и -58) в культуре бактерий.
В 2011 году М.М.Уляшова продемонстрировала эффективность использования колориметрических ДНК-микрочипов для генотипирования β-лактамаз молекулярного класса А на основе определения ОНП кодирующих их генов [30]. Оптимизированы условия проведения гибридизационного анализа биотинилированной ДНК на микрочипах с колориметрической детекцией. Предел обнаружения биотинилированных олигонуклеотидов составил 0,025 ± 0,005 нМ на микрочипах из стекла и 0,04 ± 0,01 нМ на мембранных микрочипах. Апробация экспериментальной серии ДНК-микрочипов на 97-ми клинических штаммах семейства Enterobacteriaceae показала 96%-ное совпадение с результатами ДНК-секвенирования [30].
В.М.Михайловичем [31] были разработаны тест-системы на основе олигонуклеотидных микрочипов. Эти тест-системы могут применяться для выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду, идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от близких видов рода Bacillus, идентификации ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину, идентификации и количественного определения вирусов ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови, обнаружения штаммов ВИЧ-1, устойчивых к ингибиторам вирусных протеаз, а также для определения субтипов вируса гриппа А. Представленные в работе подходы позволили рационально объединить преимущества чувствительных и эффективных ферментативных реакций и гибридизационного анализа с удобной и экономичной платформой биологического микрочипа. В настоящее время четыре такие тест-системы прошли государственную сертификацию и применяются более чем в 20-ти научных и медицинских учреждениях.
М.Дж.Хан (M.J.Khan) и его коллеги [32] показали эффективность использования платформы ДНК-микрочипов (SMAvirusChip) для обнаружения смеси вирусов путем анализа четырех пулов: 1) вирусы из разных семейств, в том числе BSQV (Flaviviridae), MAYV (Togaviridae), PIRYV (Rhabdoviridae); 2) вирусы семейства Flavivirus (DENV-2, ROCV, SLEV); 3) четыре серотипа вируса денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4); 4) вирусы, вызывавшие эпидемии в Бразилии (CHIKV, DENV-1, ZIKV).
Проводятся исследования, направленные на разработку молекулярно-генетических диагностических технологий в микологии на основе биочипов [33]. Биочипы позволяют определять грибковые патогены с высокой специфичностью и чувствительностью (15 пг/мл). Так, микрочип, основанный на технологии Arrayed-primer extension (APEX) [34], может использоваться для анализа 24-х штаммов 10-ти видов патогенных грибов (в том числе кандиды, трихофитон и др.), включая дифференцированную диагностику близкородственных штаммов кандиды – C. parapsilosis, C. orthopsilosis и C. metapsilosis. Б.Спиесс (B.Spiess) с соавт. [35] разработали метод, основанный на комбинации мультипраймерной ПЦР и гибридизации на биочипах, для анализа 14-ти грибковых патогенов в крови, бронхоальвиальном лаваже и образцах ткани пациентов с высоким риском иммунодефицитных состояний.
Токсикология. М.А.Филиппова (Институт молекулярной биологии РАН) [36] показала, что биочип позволяет проводить эффективный количественный анализ пятнадцати белковых биотоксинов бактериального и растительного происхождения одновременно: летального фактора и протективного антигена сибиреязвенного токсина, холерного и дифтерийного токсинов, рицина, термолабильного токсина из Е. coli, семи типов стафилококковых энтеротоксинов (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE, SEI, SEG) и двух типов ботулинических нейротоксинов (BNTA, BNTE). Аналитическая чувствительность для этих биотоксинов находилась в пределах от 0,5 до 10 нг/мл. В исследованиях Р.Плотана (R.Plotan) и его коллег [37] было доказано, что технология биочипов служит точным инструментом для надежного и быстрого обнаружения более 20-ти видов микотоксинов всех основных групп, включая афлатоксины, охратоксины, фумонины, трихотецены типа А и В, зеараленоны.
ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
Технология микрочипов открывает возможности для точной идентификации пищевых патогенных микроорганизмов, что находит применение при оценке безопасности и качества пищевых продуктов [26, 38]. В 2016 году Г.Г.Шин (H.H.Shin) с соавт. [38] разработали метод 16S рРНК-ген-биочип, который может быть успешно использован для быстрого и одновременного обнаружения 16-ти патогенных бактерий, часто выделяемых из зараженных продуктов. Использование биочипов позволяет быстро и с высокой точностью выявлять наличие клеток сальмонелл в пищевой продукции [26] и детектировать более 20-ти видов микотоксинов [37]. Кроме того, эта технология позволяет определять остаточные количества ветеринарных препаратов в животноводческой продукции, наличие остаточных количеств пестицидов и других вредных веществ в растительной продукции [39, 40].
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
Технология ДНК-микрочипов может применяться в селекции растений, позволяя значительно ускорять процессы создания новых сортов сельскохозяйственных культур, отличающихся высокой продуктивностью и устойчивостью к болезням, вредителям и абиотическим стрессовым факторам среды [41]. Скрининг мультимикотоксинов облегчает проверку соответствия исходного растительного материала приемлемым стандартам безопасности [37]. Кроме того, к настоящему времени разработана визуальная система ДНК-микрочипов в сочетании с мультиплексной ПЦР (м-ПЦР) для быстрого обнаружения двенадцати генетически модифицированных (ГМ) сортов кукурузы (GMM: Bt176, Bt11, MON810, GA21, T25, MON88017, NK603, MON863, MON89034, DAS-59122-7, TC1507, MIR604), ГМ хлопка (MON1445, MON15985), ГМ сои (MRRs 40-3-2). Высокая специфичность и чувствительность позволяют эффективно использовать этот метод при рутинном анализе генетически модифицированных организмов (ГМО) [42]. ГМ сорта сои и кукурузы также могут быть выявлены с помощью олигонуклеотидных микрочипов с высокой плотностью [43]. Показана возможность применения биочипов для быстрой идентификации пестицидов без использования меток, в частности, четырех разных концентраций пестицида имидаклоприда [39].
ВЕТЕРИНАРИЯ И ЗООТЕХНИКА
Компаниями Affymetrix и Bovigen созданы биочипы для выявления генов, ассоциированных с качественными характеристиками мяса крупного рогатого скота (КРС), а также биочипы для контроля происхождения животных. Разработанные биочипы позволяют выявлять однонуклеотидный полиморфизм по 20 тыс. сайтов в различных участках геномов КРС молочных и мясных пород и идентифицировать те мононуклеотидные замены, которые связаны с желательным проявлением характеристик продуктивности. В 2009 году был расшифрован геном свиньи и разработан ОНП-чип (вариант ДНК-микрочипа), содержащий 60 тыс. генетических маркеров генома. Образец ДНК свиньи можно тестировать на наличие или отсутствие практически всех важных точечных мутаций, определяющих продуктивные признаки. Эти достижения привели к внедрению технологии – геномной селекции [44]. Разработанные методы с использованием микрочипов могут успешно применяться и для идентификации вирусов, вызывающих эпизоотию среди животных [28]. Показано, что мультиплексная ПЦР в сочетании с ДНК-биочипом является полезным инструментом для выявления патогенов и профилактики болезней животных, а также для использования службами карантина животных [40]. Биочип, описанный Ю.-Ч. Чианг (Y.-Ch. Chiang) и коллективом авторов [26], может применяться для быстрого и надежного выявления клеток бактерий рода Salmonella (Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Hadar, Virchow) в птицеводстве, как у птиц, так и в производимой продукции [26].
КРИМИНАЛИСТИКА
Биологические микрочипы используют в криминалистике для экспресс-ДНК-дактилоскопии за пределами лаборатории, определения цвета глаз с точностью 94%, а также для идентификации личности. К примеру, создан биологический микрочип (ИЛ-биочип), позволяющий анализировать девять аллелей гена HLA-DOA1, пять аллелей АВО и два аллеля гена AMEL. Проведены исследования основных параметров информативности локусов HLA-DOA1 и АВО, в результате чего было показано, что средняя вероятность идентификации личности с помощью разработанного биочипа составляет 99.6%. При такой вероятности идентификации ИЛ-биочип может быть использован в судебно-медицинской практике, например, помогает сузить круг подозреваемых или опознать тела погибших. При этом ИЛ-биочип позволяет определять группу крови АВО (заменяет серологический анализ крови) и пол индивида [11].
МОНИТОРИНГ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
И БИОБЕЗОПАСНОСТЬ
Технология микрочипов может использоваться национальными органами здравоохранения для обнаружения вирусов и предотвращения развития эпидемий [32]. Так, была показана эффективность использования биочипов для определения этиологических агентов эпизоотий и для эпидемиологического мониторинга вируса гриппа А, циркулирующих в природных резервуарах [28]. Как упоминалось выше, ДНК-микрочипы SMAvirusChip могут также применяться для обнаружения вирусов BSQV (Flaviviridae), MAYV (Togaviridae), PIRYV (Rhabdoviridae), DENV-2, ROCV, SLEV (Flavivirus), DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, CHIKV, DENV-1, ZIKV и предотвращения возникновения эпидемий [32].
ВЫВОДЫ
Таким образом, в настоящее время технология биологических микрочипов может быть использована и используется для решения широкого круга задач в разных областях исследований и диагностики. К числу наиболее доступных биочипов для практического применения можно отнести GeneChip (Affymetrix), AmpliChip CYP450 (Roche), ТБ-БИОЧИП-1,2, HCV-БИОЧИП (ООО "БИОЧИП-ИМБ"). В табл.1–3 приведены основные производители ДНК, РНК, белковых, тканевых и клеточных биочипов. Продолжаются исследования, направленные на совершенствование биочипов и расширение областей их применения. В ближайшем будущем использование технологии биочипов способно заменить целые диагностические лаборатории с многочисленным штатом и дорогостоящим оборудованием, повышая в десятки раз производительность и значительно снижая себестоимость анализов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gupta S., Manubhai K.P., Kulkarni V., Srivastava S. An overview of innovations and industrial solutions in Protein Microarray Technology // Proteomics. 2016. 16:1297–1308.
2. Фесенко Д., Наседкина Т., Мирзабеков А. Бактериальный микрочип: принцип работы на примере обнаружения антибиотиков // Докл. Акад. наук. 2001. 381(6):831–833.
3. Uttamchandani M., Walsh D.P., Yao S.Q., Chang Y-T. Small molecule microarrays: recent advances and applications // Current Opinion in Chemical Biology. 2005. 9:4–13.
4. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века // Вестник Российской академии наук. 2003. 73(5):412.
5. Зубцова Ж.И. Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом биочипе: Автореф. дис. канд. физ.-мат. наук // М., 2010. 25 c.
6. Sun H. Identification of key genes associated with gastric cancer based on DNA microarray data // Oncology Letters. 2016. 11: 525–530.
7. Мызникова А.И., Файзуллин Л.З., Захарова Н.В. и др. Олигонуклеотидные биочипы в диагностике неонатальных вирусных инфекций // Вопросы практ. педиатрии. 2006. 1: 61–64.
8. Stokowski R., Wang E., White K., Batey A., Jacobsson B., Brar H., Balanarasimha M., Hollemon D., Sparks A., Nicolaides K., Musci T.J. Clinical performance of non-invasive prenatal testing (NIPT) using targeted cell-free DNA analysis in maternal plasma with microarrays or next generation sequencing (NGS) is consistent across multiple controlled clinical studies // Prenat Diagn. 2015. 35(12):1243–1246.
9. Наседкина Т.В. Использование биологических микрочипов в онкогематологии // Онкогематология. 2006. 1–2:25–37.
10. Наседкина Т.В., Гусева Н.А., Митяева О.Н. и др. Микрочипы в диагностике лимфопролиферативных заболеваний // Молекулярная медицина. 2007. 3:54–60.
11. Наседкина Т.В. Анализ генетических изменений у человека в норме и при различных заболеваниях с использованием биочипов: Автореф. дис. докт. биол. наук // М., 2009. 50 c.
12. Щербо С.Н., Щербо Д.С. Лабораторная медицина как основа персонализированной медицины. Применение биочипов в медицине // Клинич. лабор. диагн. 2014. 5:4–11.
13. Шляпников Ю.М. Разработка методов иммобилизации и детекции фрагментов ДНК на микрочипах: Автореф. дис. канд хим. наук // М., 2010. 24 c.
14. Павлова Т.В. Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах: Автореф. дис. канд. биол. наук // М., 2009. 25 c.
15. Gonzalez-Angulo A.M., Hennessy B.T., Mills G.B. Future of personalized medicine in oncology: a systems biology approach // J. Clin. Oncol. 2010. 28:2777–2783.
16. Quackenbush J. Microarray analysis and tumor classification // N.Engl. J. Med. 2006. 354(23):2463–2472.
17. Sotiriou C., Piccart M. Taking gene-expression profiing to the clinic:when will molecular signatures become relevant to patient care? // J. Nat. Rev. Cancer. 2007. 7:545–553.
18. Yu X., Schneiderhan-Marra N., Joos T.O. Protein Microarrays for Personalized Medicine // Clinical Chemistry. 2010. 56(3):376–387.
19. Голимбет В.Е., Корень Е.В. Вариации числа копий в геноме – новая страница в генетических исследованиях в области психиатрии: международный проект PsychCNVs. // Клиническая психиатрия. 2010. 110(1):107–109.
20. Heller R.A., Schena M., Chai A., et al. Discovery and analysis of inflmmatory disease-related genes using cdna microarrays // Proc. natl. acad. sci. USA. 1997. 94:2150–2155.
21. Шишкин А.В. Разработка и применение исследовательско-диагностического комплекса для изучения клеток крови на основе иммунологических биочипов: Автореф. дис. докт. мед. наук // СПб, 2012. 50 c.
22. Marzano A.V., Cozzani E., Biasin M., Russo I., Alaibac M. The use of Biochip immunofluorescence microscopy for the serological diagnosis of epidermolysis bullosa acquisita //Arch Dermatol Res. 2016. 308(4):273–276.
23. Russo I., Saponeri A., Michelotto A., Alaibac M. Salivary Samples for the Diagnosis of Pemphigus vulgaris Using the BIOCHIP Approach: a Pilot Study // In vivo. 2017. 31:97–100.
24. Zembutsu H., Ohnishi Y., Tsunoda T. et al. Genome-wide cDNA microarray screening to correlate gene expression profiles with sensitivity of 85 human cancer xenografts to anticancer drugs // Cancer Res. 2002. 62(2): 518–527.
25. Lu J., Getz G., Miska E.A. MicroRNA expression profiles classify human cancers // Nature. 2005. 435(7043): 834–838.
26. Chiang Y-Ch., Wang H-H., Ramireddy L., Chen H-Y., Shin C-M., Lin C-K., Tsen H-Y. Designing a biochip following multiplex polymerase chain reaction for the detection of Salmonella serovars Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Hadar, and Virchow in poultry products // Journal of food and drug analysis. 2017. Open assess. In press. https://doi.org/10.1016/j.jfda.2016.11.019
27. Айвазян С.Р. Применение биологических ДНК-микрочипов в этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы: Автореф. дис. канд. мед. наук // М., 2009. 25 c.
28. Фесенко Е.Е. Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе: Автореф. дис. канд. биол. наук // Пущино, 2009. 26 c.
29. Bogaerts P. et al. Evaluation of a DNA Microarray for Rapid Detection of the Most Prevalent Extended-Spectrum β-Lactamases, Plasmid-Mediated Cephalosporinases and Carbapenemases in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter // Int J Antimicrob Agents. 2016. 48(2): 189–193.
30. Уляшова М.М. ДНК-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А: Автореф. дис. канд. хим. наук // М., 2011. 25 c.
31. Михайлович В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: Автореф. дис. докт. биол. наук // М., 2009. 51 c.
32. Khan M.J., Trabuco A.C., Alfonso H.L., Figueiredo M.L., Batista W.C., Badra S.J., Figueiredo L.T., Lavrador M.A., Aquino V.H. DNA Microarray Platform for Detection and Surveillance of Viruses Transmitted by Small Mammals and Arthropods // J. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2016. Open assess. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005017
33. Huang A., Li J., Shen Z., Wang X., Jin M. High-throughput identification of clinical pathogenic fungi by hybridization to an oligonucleotide microarray // J. Clin. Microb. 2006. 44(9): 3299–3305.
34. Campa D., Tavanti A., Gemignani F. et al. DNA microarray based on arrayed-primer extension technique for identification of pathogenic fungi responsible for invasive and superficial mycoses // J. Clin. Microbiol. 2008. 46(3): 909–915.
35. Spiess B., Seifarth W., Hummel M. et al. DNA microarray-based detection and identification of fungal pathogens in clinical samples from neutropenic patients // J. Clin. Microbiol. 2007. 45(11):3743–3753.
36. Филиппова М.А. Одновременный количественный анализ бактериальных и растительных биотоксинов на гидрогелевых микрочипах: Автореф. дис. канд. хим. наук // М., 2011. 25 c.
37. Plotan R., Devlin J., Porter M., Benchikh M.L., Rodrнguez R.I., McConnell S.P FitzGerald. The Use of Biochip Array Technology for Rapid Multimycotoxin Screening // Journal of AOAC InternatIonal. 2016. 99(4):878–889.
38. Shin H.H., Hwang B.H., Cha H.J. Multiplex 16S rRNA-derived geno-biochip for detection of 16 bacterial pathogens from contaminated foods // Biotechnol. J. 2016. 11:1–10.
39. Lee K., You M., Tsai C., Lin E., Hsieh S., Ho M., Hsu J., Wei P. Nanoplasmonic biochips for rapid label-free detection of imidacloprid pesticides with a smartphone // Biosensors and Bioelectronics. 2016. 75: 88–95.
40. Tung H., Chen W.-Ch., Ou B., Yeh J., Cheng Y., Tsng P., Hsu M., Tsai M.-Sh., Liang Y.-Ch. Simultaneous detection of multiple pathogens by multiplex PC coupled with DNA biochip hybridization // Laboratory Animals. 2017. 0(0): 1–10.
41. Sikandar U., Ahmed H., Hayat F., Mumtaz H.M.A., Jabbar M.A., Haider S., Khan M.N. Modern techniques in plant breeding // Research Journal of Innovative Ideas and Thoughts. 2015. 3(1):45–70.
42. Li Y., Xiong T., Wu H., Yang Y. Visual DNA Microarray Coupled with Multiplex-PC for the Rapid Detection of Twelve Genetically Modified Maize // BioChip Journal. 2016. 10(1): 42–47.
43. Turkec A., Lucas S.J., Karacanli B., Baykut A., Yuksel H. Assessment of a direct hybridization microarray strategy for comprehensive monitoring of genetically modified organisms (GMOs) // Food Chemistry. 2016. 194:399–409.
44. Глазко В.И. Молекулярная биология для животноводства // FarmAnimals. 2011. 1:24–29.
45. https://www.moleculardevices.com/systems/microarray-systems/array-suppliers#tab-0
В зависимости от типа молекулы, нанесенной на подложку, биочипы можно разделить на несколько классов. Основная доля производимых в мире биологических микрочипов приходится на ДНК-чипы (90%), содержащие фрагменты ДНК длиной от 10 до 1 000 нуклеотидов. К биочипам этого класса относят и олигонуклеотидные чипы, включающие 10–70 нуклеотидных оснований, принадлежащие к одному и тому же гену. На подложку белковых чипов, составляющих 7–10% всех производимых чипов, наносятся белковые молекулы: ферменты, антитела, антигены и др. Оставшиеся 3% биочипов составляют тканевые и клеточные микрочипы, а также микрочипы на основе малых молекул. На платформу тканевых чипов наносятся образцы тканей для определения содержания белков в здоровых и патологически измененных тканях и оценки потенциальных мишеней для лекарственных препаратов. На платформу клеточных чипов наносятся клетки или лизаты клеток, например, для определения чувствительности к антибиотикам и ксенобиотикам [2]. Микрочипы на основе малых молекул используются для идентификации биологически значимых природных и синтетических малых молекул [3].
По своему назначению биологические микрочипы бывают аналитические, функциональные и чипы с обращенной фазой [1] (рис.2). Аналитические чипы (рис.2а) предназначены для изучения связывания молекул, нанесенных на подложку, с молекулами-партнерами, находящимися в растворе. На подложку таких биочипов наносят антитела, белки-мишени, ДНК, аптамеры или низкомолекулярные лиганды. Функциональные чипы (рис.2б) служат для изучения экспрессии генов или белков, для изучения профиля активности белков, а также при диагностике определенных заболеваний. Эти чипы содержат широкий спектр различных белков или пептидов, иммобилизованных на единую подложку. Аналитические и функциональные чипы относятся к так называемым биочипам с прямой фазой (Forward-phase Microarrays). В таких чипах происходит связывание одной биологической мишени, нанесенной на чип, с одной из множественных потенциальных молекул-партнеров аналита. Принципиально противоположным типом чипов являются чипы с обращенной фазой (RPPA, reverse phase protein array, рис.2в). На матрицу таких чипов наносят лизаты клеток или образцы тканей, содержащие все присущие клетке или ткани белки, а затем обрабатывают их раствором, содержащим специфический к выявляемому веществу лиганд. Таким образом, чипы с обращенной фазой можно рассматривать как миниатюрное воплощение иммуногистохимического метода.
В последние годы появились такие новые интегративные подходы, как геномика, протеомика и селломика, позволяющие устанавливать структуру и изучать процессы на уровне генов всего генома, белков всей клетки или клеток всей ткани. Биологические микрочипы позволяют в достаточно простых и доступных экспериментах изучать экспрессию генов и белков различных бактерий и человека [4].
Широкое распространение биочиповых исследований связано с высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью, простотой выполнения процедуры, возможностью одновременного анализа множества параметров и невысокой стоимостью. Технология микрочипов может использоваться как для исследовательских, так и для диагностических целей в разных областях науки и практики.
БИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА
Технология биологических микрочипов является наиболее подходящим методом для изучения генетической предрасположенности к многофакторным и инфекционным заболеваниям, влияния различных факторов (лекарств, белков, питания) на работу десятков тысяч генов, изучения фармакогенетики и создания "генетического паспорта", для прогнозирования исхода заболевания и изучения механизмов биологических процессов.
Области приложения биочипов в биологии и медицине показаны на рис.3.
Лабораторная диагностика. Биочипы в лабораторной диагностике применяются в онкологии, вирусной неонатологии, акушерстве и гинекологии, онкогематологии и др. [5–10].
Биочипы могут служить удобным инструментом при анализе различных генетических изменений, включая генетический полиморфизм, точечные мутации и некоторые хромосомные перестройки.
Так, продемонстрирована эффективность практического применения биочипов тест-системы ПФ-биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации, участвующих в метаболизме ксенобиотиков (лекарственные препараты, канцерогены, продукты питания и т.д.), в гене NAT2 и генах ренин-ангиотензиновой системы, участвующих в регуляции кровяного давления. Эта диагностическая тест-система зарегистрирована в Росздравнадзоре (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/5317-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике. ПФ-биочип используется в ФГБНУ "НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта" и ФГАУ "Научный центр здоровья детей" для определения индивидуальной чувствительности к некоторым лекарственным препаратам, в том числе тиопуринам, а также риска развития некоторых многофакторных заболеваний и составления генетического паспорта [11].
Использование технологии ДНК-микрочипов позволило идентифицировать ключевые гены, связанные с предрасположенностью к возникновению рака желудка [6].
Были проведены масштабные исследования по изучению геномов пациентов с различными заболеваниями: атеросклероз, ожирение, диабет, рак легких и простаты, сердечно-сосудистые заболевания, астма, хронические заболевания легких, болезнь Альцгеймера и многие другие [12]. Разработана микрочиповая нанотехнология ClearRead (Nanosphere) с применением наночастиц золота для исследования однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), которая может использоваться для анализа ДНК человека, полученной из образцов размером с каплю крови. Технология от Nanosphere позволяет быстро, просто и точно генотипировать любые последовательности ДНК на наличие ОНП для выявления генетических заболеваний, предрасположенности к мультифакторным болезням, а также для прогнозирования метаболического ответа на фармакологические препараты [12].
Благодаря появлению ДНК-чипов появилась возможность производить анализ мутаций во всех генах генома одновременно. Для анализа всех возможных мутаций во всех генах человека достаточно ДНК-чипа с количеством ячеек 100–200 млн, что технически достижимо. Современные ДНК-микрочипы могут выявить около миллиона мутаций [13].
К настоящему моменту создан метод диагностики 13-ти транслокаций при острых и хронических лейкозах с использованием олигонуклеотидных биочипов. Впервые в России определены частоты этих транслокаций у детей, больных лейкозом. Диагностическая тест-система ЛК-биочип для анализа хромосомных транслокаций при лейкозах зарегистрирована в Росздравнадзоре (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/4756-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике [11].
В работе Т.В.Павловой [14] впервые была представлена модифицированная технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах. Данная технология перспективна для масштабного скринирования структурных (деление и амплификация) и эпигеномных (метилирование) изменений в геномах опухолевых клеток. Информация об этих изменениях может служить предварительной базой для выявления потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста и наиболее перспективных опухолевых маркеров [14].
Наибольшие успехи в применении биочипов для классификации и прогноза течения заболеваний достигнуты в области онкологии, а именно, идентификации мутаций, вызывающих онкологические заболевания [15]. Национальным Институтом рака США проведено типирование 60-ти видов различных раковых клеток с использованием чипа, содержащего 9703 кДНК, и показано, что характер генетической экспрессии меняется в соответствии с происхождением ткани. Выявлено, что общий подход позволяет идентифицировать профиль транскрипции и классифицировать тип опухоли, а затем найти корреляции между этим типом и прогнозом течения заболевания [16, 25]. Клиническое применение профилей транскрипции, получаемых с помощью биочипов, детально отработано для рака молочной железы [16, 17].
Технология биочипов может помочь осуществить переход от массового лечения к персонализованной медицине (ПМ), главной задачей которой является поиск конкретного лекарства для конкретного пациента в соответствии с его генотипом [15, 18]. Использование биочипов в ПМ можно проиллюстрировать на примере поиска вариаций числа генетических копий (CNV) у больных аутизмом и психозами с ранним началом в рамках проекта PsychCNVs [19]. Возможность эффективного поиска редких вариабельных последовательностей появилась после разработки микрочипа HumanCNV370 (deCODE genetics), позволяющего выявлять десятки тысяч последовательностей ДНК, связанных с этими заболеваниями. Эта разработка, включающая в себя высокотехнологичное программное обеспечение, является одной из наиболее эффективных в мире для анализа вариабельных последовательностей ДНК [19]. Описано применение биочипов для определения чувствительности раковых клеток к применяемым противораковым препаратам [24], что служит еще одним шагом к применению препаратов, эффективных именно для данного больного.
ДНК-микрочипы позволяют диагностировать широкий спектр заболеваний, таких как шизофрения, склероз, ишемическая и неишемическая кардиомиопатии, болезнь Крона, ревматоидный артрит [12, 20].
Биочипы применяются в иммунодиагностике для обнаружения антигенов и антител к ним при инфекционных и аутоиммунных заболеваниях, а также для обнаружения биомаркеров, то есть веществ, наличие которых указывает на развитие какого-либо заболевания раньше, чем проявятся клинические признаки.
Показана возможность одновременного количественного определения девяти онкомаркеров: альфа-фетопротеина, раково-эмбрионального антигена, хорионического гонадотропина человека, раковых антигенов СА125, СА15-3, СА19-9, двух форм простат-специфического антигена (ПСАобщ и ПСАсвоб) [5]. В работе А.В.Шишкина [21] описано применение исследовательско-диагностического комплекса для изучения нормальных и опухолевых клеток крови на основе иммунобиочипов с возможностью одновременного проведения иммуноморфологических и иммуноцитохимических исследований клеток [21]. Этот комплекс пригоден для решения задач различного уровня сложности в лабораториях с разным уровнем оснащенности.
Была показана возможность использования биочипов в диагностике аутоимунных заболеваний, например, буллезного эпидермолиза [22], вульгарной пузырчатки (Pemphigus vulgaris) [23].
Вирусология и бактериология. Биочипы активно разрабатываются и применяются в вирусологии и микробиологии [26–27].
Показана эффективность применения биологических ДНК-микрочипов для этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы [27]. Авторам удалось одновременно выявить и идентифицировать ДНК патогенных и условно-патогенных возбудителей острых кишечных инфекций: Shigella spp.+EIEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis [27].
Ю.-Ч Чанг (Yu-Ch. Chiang) и соавт. [26] разработали биочип для определения пяти главных сероваров Salmonella (Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Hadar, Virchow) и показали возможность его использования для быстрого и надежного выявления клеток сальмонелл.
Разработан биочип, позволяющий идентифицировать 15 вариантов гемагглютинина (Н1-Н15) и два варианта нейраминидазы (N1, N2) вируса гриппа А [28]. Процедура определения вирусного подтипа не требует выполнения предварительных стадий культивирования вируса, а результаты анализа могут быть получены в течение 10 ч. На выборке из 41-го образца были определены специфичность и чувствительность предложенного метода идентификации вирусного подтипа (100% и 76%, соответственно). Аналитическая чувствительность метода составила 10 ЭИДзо/мл. В этой работе было показано, что предложенный подход обладает высокой специфичностью и может использоваться для разработки ДНК-микрочипов, нацеленных на генотипирование вирусов, характеризующихся высокой изменчивостью [28]. Необходимое оборудование установлено в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского в г. Москве и используется для определения этиологического агента эпизоотий и эпидемиологического мониторинга вирусов гриппа.
Оценена возможность использования ДНК-микрочипов для быстрого определения наиболее распространенных β-лактамаз, плазмид-опосредованных цефалоспориназ и карбапенемаз у Enterobacteriaceae, Pseudomonas и Acinetobacter [29]. Показана эффективность использования нового ДНК-чипа низкой плотности Check-MDR CT103 XL (Check-Points, Нидерланды) в определении наиболее значимых генов β-лактамаз – ESBLs (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaBEL, blaPER, blaGES and blaVEB), pAmpCs (blaCMY-2-like, blaDHA, blaFOX, blaACC-1, blaACT/MIR и blaCMY-1-like/MOX) и карбапенемаз (blaKPC, blaOXA-48, blaVIM, blaIMP, blaNDM, blaGIM, blaSPM, blaOXA-23, -24 и -58) в культуре бактерий.
В 2011 году М.М.Уляшова продемонстрировала эффективность использования колориметрических ДНК-микрочипов для генотипирования β-лактамаз молекулярного класса А на основе определения ОНП кодирующих их генов [30]. Оптимизированы условия проведения гибридизационного анализа биотинилированной ДНК на микрочипах с колориметрической детекцией. Предел обнаружения биотинилированных олигонуклеотидов составил 0,025 ± 0,005 нМ на микрочипах из стекла и 0,04 ± 0,01 нМ на мембранных микрочипах. Апробация экспериментальной серии ДНК-микрочипов на 97-ми клинических штаммах семейства Enterobacteriaceae показала 96%-ное совпадение с результатами ДНК-секвенирования [30].
В.М.Михайловичем [31] были разработаны тест-системы на основе олигонуклеотидных микрочипов. Эти тест-системы могут применяться для выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду, идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от близких видов рода Bacillus, идентификации ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину, идентификации и количественного определения вирусов ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови, обнаружения штаммов ВИЧ-1, устойчивых к ингибиторам вирусных протеаз, а также для определения субтипов вируса гриппа А. Представленные в работе подходы позволили рационально объединить преимущества чувствительных и эффективных ферментативных реакций и гибридизационного анализа с удобной и экономичной платформой биологического микрочипа. В настоящее время четыре такие тест-системы прошли государственную сертификацию и применяются более чем в 20-ти научных и медицинских учреждениях.
М.Дж.Хан (M.J.Khan) и его коллеги [32] показали эффективность использования платформы ДНК-микрочипов (SMAvirusChip) для обнаружения смеси вирусов путем анализа четырех пулов: 1) вирусы из разных семейств, в том числе BSQV (Flaviviridae), MAYV (Togaviridae), PIRYV (Rhabdoviridae); 2) вирусы семейства Flavivirus (DENV-2, ROCV, SLEV); 3) четыре серотипа вируса денге (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4); 4) вирусы, вызывавшие эпидемии в Бразилии (CHIKV, DENV-1, ZIKV).
Проводятся исследования, направленные на разработку молекулярно-генетических диагностических технологий в микологии на основе биочипов [33]. Биочипы позволяют определять грибковые патогены с высокой специфичностью и чувствительностью (15 пг/мл). Так, микрочип, основанный на технологии Arrayed-primer extension (APEX) [34], может использоваться для анализа 24-х штаммов 10-ти видов патогенных грибов (в том числе кандиды, трихофитон и др.), включая дифференцированную диагностику близкородственных штаммов кандиды – C. parapsilosis, C. orthopsilosis и C. metapsilosis. Б.Спиесс (B.Spiess) с соавт. [35] разработали метод, основанный на комбинации мультипраймерной ПЦР и гибридизации на биочипах, для анализа 14-ти грибковых патогенов в крови, бронхоальвиальном лаваже и образцах ткани пациентов с высоким риском иммунодефицитных состояний.
Токсикология. М.А.Филиппова (Институт молекулярной биологии РАН) [36] показала, что биочип позволяет проводить эффективный количественный анализ пятнадцати белковых биотоксинов бактериального и растительного происхождения одновременно: летального фактора и протективного антигена сибиреязвенного токсина, холерного и дифтерийного токсинов, рицина, термолабильного токсина из Е. coli, семи типов стафилококковых энтеротоксинов (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE, SEI, SEG) и двух типов ботулинических нейротоксинов (BNTA, BNTE). Аналитическая чувствительность для этих биотоксинов находилась в пределах от 0,5 до 10 нг/мл. В исследованиях Р.Плотана (R.Plotan) и его коллег [37] было доказано, что технология биочипов служит точным инструментом для надежного и быстрого обнаружения более 20-ти видов микотоксинов всех основных групп, включая афлатоксины, охратоксины, фумонины, трихотецены типа А и В, зеараленоны.
ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
Технология микрочипов открывает возможности для точной идентификации пищевых патогенных микроорганизмов, что находит применение при оценке безопасности и качества пищевых продуктов [26, 38]. В 2016 году Г.Г.Шин (H.H.Shin) с соавт. [38] разработали метод 16S рРНК-ген-биочип, который может быть успешно использован для быстрого и одновременного обнаружения 16-ти патогенных бактерий, часто выделяемых из зараженных продуктов. Использование биочипов позволяет быстро и с высокой точностью выявлять наличие клеток сальмонелл в пищевой продукции [26] и детектировать более 20-ти видов микотоксинов [37]. Кроме того, эта технология позволяет определять остаточные количества ветеринарных препаратов в животноводческой продукции, наличие остаточных количеств пестицидов и других вредных веществ в растительной продукции [39, 40].
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
Технология ДНК-микрочипов может применяться в селекции растений, позволяя значительно ускорять процессы создания новых сортов сельскохозяйственных культур, отличающихся высокой продуктивностью и устойчивостью к болезням, вредителям и абиотическим стрессовым факторам среды [41]. Скрининг мультимикотоксинов облегчает проверку соответствия исходного растительного материала приемлемым стандартам безопасности [37]. Кроме того, к настоящему времени разработана визуальная система ДНК-микрочипов в сочетании с мультиплексной ПЦР (м-ПЦР) для быстрого обнаружения двенадцати генетически модифицированных (ГМ) сортов кукурузы (GMM: Bt176, Bt11, MON810, GA21, T25, MON88017, NK603, MON863, MON89034, DAS-59122-7, TC1507, MIR604), ГМ хлопка (MON1445, MON15985), ГМ сои (MRRs 40-3-2). Высокая специфичность и чувствительность позволяют эффективно использовать этот метод при рутинном анализе генетически модифицированных организмов (ГМО) [42]. ГМ сорта сои и кукурузы также могут быть выявлены с помощью олигонуклеотидных микрочипов с высокой плотностью [43]. Показана возможность применения биочипов для быстрой идентификации пестицидов без использования меток, в частности, четырех разных концентраций пестицида имидаклоприда [39].
ВЕТЕРИНАРИЯ И ЗООТЕХНИКА
Компаниями Affymetrix и Bovigen созданы биочипы для выявления генов, ассоциированных с качественными характеристиками мяса крупного рогатого скота (КРС), а также биочипы для контроля происхождения животных. Разработанные биочипы позволяют выявлять однонуклеотидный полиморфизм по 20 тыс. сайтов в различных участках геномов КРС молочных и мясных пород и идентифицировать те мононуклеотидные замены, которые связаны с желательным проявлением характеристик продуктивности. В 2009 году был расшифрован геном свиньи и разработан ОНП-чип (вариант ДНК-микрочипа), содержащий 60 тыс. генетических маркеров генома. Образец ДНК свиньи можно тестировать на наличие или отсутствие практически всех важных точечных мутаций, определяющих продуктивные признаки. Эти достижения привели к внедрению технологии – геномной селекции [44]. Разработанные методы с использованием микрочипов могут успешно применяться и для идентификации вирусов, вызывающих эпизоотию среди животных [28]. Показано, что мультиплексная ПЦР в сочетании с ДНК-биочипом является полезным инструментом для выявления патогенов и профилактики болезней животных, а также для использования службами карантина животных [40]. Биочип, описанный Ю.-Ч. Чианг (Y.-Ch. Chiang) и коллективом авторов [26], может применяться для быстрого и надежного выявления клеток бактерий рода Salmonella (Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Hadar, Virchow) в птицеводстве, как у птиц, так и в производимой продукции [26].
КРИМИНАЛИСТИКА
Биологические микрочипы используют в криминалистике для экспресс-ДНК-дактилоскопии за пределами лаборатории, определения цвета глаз с точностью 94%, а также для идентификации личности. К примеру, создан биологический микрочип (ИЛ-биочип), позволяющий анализировать девять аллелей гена HLA-DOA1, пять аллелей АВО и два аллеля гена AMEL. Проведены исследования основных параметров информативности локусов HLA-DOA1 и АВО, в результате чего было показано, что средняя вероятность идентификации личности с помощью разработанного биочипа составляет 99.6%. При такой вероятности идентификации ИЛ-биочип может быть использован в судебно-медицинской практике, например, помогает сузить круг подозреваемых или опознать тела погибших. При этом ИЛ-биочип позволяет определять группу крови АВО (заменяет серологический анализ крови) и пол индивида [11].
МОНИТОРИНГ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
И БИОБЕЗОПАСНОСТЬ
Технология микрочипов может использоваться национальными органами здравоохранения для обнаружения вирусов и предотвращения развития эпидемий [32]. Так, была показана эффективность использования биочипов для определения этиологических агентов эпизоотий и для эпидемиологического мониторинга вируса гриппа А, циркулирующих в природных резервуарах [28]. Как упоминалось выше, ДНК-микрочипы SMAvirusChip могут также применяться для обнаружения вирусов BSQV (Flaviviridae), MAYV (Togaviridae), PIRYV (Rhabdoviridae), DENV-2, ROCV, SLEV (Flavivirus), DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, CHIKV, DENV-1, ZIKV и предотвращения возникновения эпидемий [32].
ВЫВОДЫ
Таким образом, в настоящее время технология биологических микрочипов может быть использована и используется для решения широкого круга задач в разных областях исследований и диагностики. К числу наиболее доступных биочипов для практического применения можно отнести GeneChip (Affymetrix), AmpliChip CYP450 (Roche), ТБ-БИОЧИП-1,2, HCV-БИОЧИП (ООО "БИОЧИП-ИМБ"). В табл.1–3 приведены основные производители ДНК, РНК, белковых, тканевых и клеточных биочипов. Продолжаются исследования, направленные на совершенствование биочипов и расширение областей их применения. В ближайшем будущем использование технологии биочипов способно заменить целые диагностические лаборатории с многочисленным штатом и дорогостоящим оборудованием, повышая в десятки раз производительность и значительно снижая себестоимость анализов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gupta S., Manubhai K.P., Kulkarni V., Srivastava S. An overview of innovations and industrial solutions in Protein Microarray Technology // Proteomics. 2016. 16:1297–1308.
2. Фесенко Д., Наседкина Т., Мирзабеков А. Бактериальный микрочип: принцип работы на примере обнаружения антибиотиков // Докл. Акад. наук. 2001. 381(6):831–833.
3. Uttamchandani M., Walsh D.P., Yao S.Q., Chang Y-T. Small molecule microarrays: recent advances and applications // Current Opinion in Chemical Biology. 2005. 9:4–13.
4. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века // Вестник Российской академии наук. 2003. 73(5):412.
5. Зубцова Ж.И. Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом биочипе: Автореф. дис. канд. физ.-мат. наук // М., 2010. 25 c.
6. Sun H. Identification of key genes associated with gastric cancer based on DNA microarray data // Oncology Letters. 2016. 11: 525–530.
7. Мызникова А.И., Файзуллин Л.З., Захарова Н.В. и др. Олигонуклеотидные биочипы в диагностике неонатальных вирусных инфекций // Вопросы практ. педиатрии. 2006. 1: 61–64.
8. Stokowski R., Wang E., White K., Batey A., Jacobsson B., Brar H., Balanarasimha M., Hollemon D., Sparks A., Nicolaides K., Musci T.J. Clinical performance of non-invasive prenatal testing (NIPT) using targeted cell-free DNA analysis in maternal plasma with microarrays or next generation sequencing (NGS) is consistent across multiple controlled clinical studies // Prenat Diagn. 2015. 35(12):1243–1246.
9. Наседкина Т.В. Использование биологических микрочипов в онкогематологии // Онкогематология. 2006. 1–2:25–37.
10. Наседкина Т.В., Гусева Н.А., Митяева О.Н. и др. Микрочипы в диагностике лимфопролиферативных заболеваний // Молекулярная медицина. 2007. 3:54–60.
11. Наседкина Т.В. Анализ генетических изменений у человека в норме и при различных заболеваниях с использованием биочипов: Автореф. дис. докт. биол. наук // М., 2009. 50 c.
12. Щербо С.Н., Щербо Д.С. Лабораторная медицина как основа персонализированной медицины. Применение биочипов в медицине // Клинич. лабор. диагн. 2014. 5:4–11.
13. Шляпников Ю.М. Разработка методов иммобилизации и детекции фрагментов ДНК на микрочипах: Автореф. дис. канд хим. наук // М., 2010. 24 c.
14. Павлова Т.В. Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах: Автореф. дис. канд. биол. наук // М., 2009. 25 c.
15. Gonzalez-Angulo A.M., Hennessy B.T., Mills G.B. Future of personalized medicine in oncology: a systems biology approach // J. Clin. Oncol. 2010. 28:2777–2783.
16. Quackenbush J. Microarray analysis and tumor classification // N.Engl. J. Med. 2006. 354(23):2463–2472.
17. Sotiriou C., Piccart M. Taking gene-expression profiing to the clinic:when will molecular signatures become relevant to patient care? // J. Nat. Rev. Cancer. 2007. 7:545–553.
18. Yu X., Schneiderhan-Marra N., Joos T.O. Protein Microarrays for Personalized Medicine // Clinical Chemistry. 2010. 56(3):376–387.
19. Голимбет В.Е., Корень Е.В. Вариации числа копий в геноме – новая страница в генетических исследованиях в области психиатрии: международный проект PsychCNVs. // Клиническая психиатрия. 2010. 110(1):107–109.
20. Heller R.A., Schena M., Chai A., et al. Discovery and analysis of inflmmatory disease-related genes using cdna microarrays // Proc. natl. acad. sci. USA. 1997. 94:2150–2155.
21. Шишкин А.В. Разработка и применение исследовательско-диагностического комплекса для изучения клеток крови на основе иммунологических биочипов: Автореф. дис. докт. мед. наук // СПб, 2012. 50 c.
22. Marzano A.V., Cozzani E., Biasin M., Russo I., Alaibac M. The use of Biochip immunofluorescence microscopy for the serological diagnosis of epidermolysis bullosa acquisita //Arch Dermatol Res. 2016. 308(4):273–276.
23. Russo I., Saponeri A., Michelotto A., Alaibac M. Salivary Samples for the Diagnosis of Pemphigus vulgaris Using the BIOCHIP Approach: a Pilot Study // In vivo. 2017. 31:97–100.
24. Zembutsu H., Ohnishi Y., Tsunoda T. et al. Genome-wide cDNA microarray screening to correlate gene expression profiles with sensitivity of 85 human cancer xenografts to anticancer drugs // Cancer Res. 2002. 62(2): 518–527.
25. Lu J., Getz G., Miska E.A. MicroRNA expression profiles classify human cancers // Nature. 2005. 435(7043): 834–838.
26. Chiang Y-Ch., Wang H-H., Ramireddy L., Chen H-Y., Shin C-M., Lin C-K., Tsen H-Y. Designing a biochip following multiplex polymerase chain reaction for the detection of Salmonella serovars Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Hadar, and Virchow in poultry products // Journal of food and drug analysis. 2017. Open assess. In press. https://doi.org/10.1016/j.jfda.2016.11.019
27. Айвазян С.Р. Применение биологических ДНК-микрочипов в этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы: Автореф. дис. канд. мед. наук // М., 2009. 25 c.
28. Фесенко Е.Е. Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе: Автореф. дис. канд. биол. наук // Пущино, 2009. 26 c.
29. Bogaerts P. et al. Evaluation of a DNA Microarray for Rapid Detection of the Most Prevalent Extended-Spectrum β-Lactamases, Plasmid-Mediated Cephalosporinases and Carbapenemases in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter // Int J Antimicrob Agents. 2016. 48(2): 189–193.
30. Уляшова М.М. ДНК-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А: Автореф. дис. канд. хим. наук // М., 2011. 25 c.
31. Михайлович В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: Автореф. дис. докт. биол. наук // М., 2009. 51 c.
32. Khan M.J., Trabuco A.C., Alfonso H.L., Figueiredo M.L., Batista W.C., Badra S.J., Figueiredo L.T., Lavrador M.A., Aquino V.H. DNA Microarray Platform for Detection and Surveillance of Viruses Transmitted by Small Mammals and Arthropods // J. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2016. Open assess. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005017
33. Huang A., Li J., Shen Z., Wang X., Jin M. High-throughput identification of clinical pathogenic fungi by hybridization to an oligonucleotide microarray // J. Clin. Microb. 2006. 44(9): 3299–3305.
34. Campa D., Tavanti A., Gemignani F. et al. DNA microarray based on arrayed-primer extension technique for identification of pathogenic fungi responsible for invasive and superficial mycoses // J. Clin. Microbiol. 2008. 46(3): 909–915.
35. Spiess B., Seifarth W., Hummel M. et al. DNA microarray-based detection and identification of fungal pathogens in clinical samples from neutropenic patients // J. Clin. Microbiol. 2007. 45(11):3743–3753.
36. Филиппова М.А. Одновременный количественный анализ бактериальных и растительных биотоксинов на гидрогелевых микрочипах: Автореф. дис. канд. хим. наук // М., 2011. 25 c.
37. Plotan R., Devlin J., Porter M., Benchikh M.L., Rodrнguez R.I., McConnell S.P FitzGerald. The Use of Biochip Array Technology for Rapid Multimycotoxin Screening // Journal of AOAC InternatIonal. 2016. 99(4):878–889.
38. Shin H.H., Hwang B.H., Cha H.J. Multiplex 16S rRNA-derived geno-biochip for detection of 16 bacterial pathogens from contaminated foods // Biotechnol. J. 2016. 11:1–10.
39. Lee K., You M., Tsai C., Lin E., Hsieh S., Ho M., Hsu J., Wei P. Nanoplasmonic biochips for rapid label-free detection of imidacloprid pesticides with a smartphone // Biosensors and Bioelectronics. 2016. 75: 88–95.
40. Tung H., Chen W.-Ch., Ou B., Yeh J., Cheng Y., Tsng P., Hsu M., Tsai M.-Sh., Liang Y.-Ch. Simultaneous detection of multiple pathogens by multiplex PC coupled with DNA biochip hybridization // Laboratory Animals. 2017. 0(0): 1–10.
41. Sikandar U., Ahmed H., Hayat F., Mumtaz H.M.A., Jabbar M.A., Haider S., Khan M.N. Modern techniques in plant breeding // Research Journal of Innovative Ideas and Thoughts. 2015. 3(1):45–70.
42. Li Y., Xiong T., Wu H., Yang Y. Visual DNA Microarray Coupled with Multiplex-PC for the Rapid Detection of Twelve Genetically Modified Maize // BioChip Journal. 2016. 10(1): 42–47.
43. Turkec A., Lucas S.J., Karacanli B., Baykut A., Yuksel H. Assessment of a direct hybridization microarray strategy for comprehensive monitoring of genetically modified organisms (GMOs) // Food Chemistry. 2016. 194:399–409.
44. Глазко В.И. Молекулярная биология для животноводства // FarmAnimals. 2011. 1:24–29.
45. https://www.moleculardevices.com/systems/microarray-systems/array-suppliers#tab-0
Отзывы читателей
