eng
Выпуск #6/2017
Д.А.Фармаковский
Количественное определение иммунодепрессантов в цельной крови методом тандемной жидкостной масс-спектрометрии
Количественное определение иммунодепрессантов в цельной крови методом тандемной жидкостной масс-спектрометрии
Просмотры: 2152
Компания Shimadzu предлагает аппаратный комплекс для высокочувствительного количественного определения иммунодепрессантов в цельной крови методом тандемной жидкостной масс-спектрометрии с полностью автоматизированной пробоподготовкой и с использованием высококачественных 13С-стандартов. Описаны примеры применения новой высокоточной, чувствительной и селективной методики анализа.
УДК 543.51; ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.37.6.30.34
УДК 543.51; ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.37.6.30.34
Иммунодепрессанты (рис.2) играют важную роль в трансплантологии, а также используются для лечения расстройств иммунной системы и не аутоиммунных воспалительных реакций. Терапевтический диапазон концентраций этих лекарственных средств, как правило, достаточно узок, поэтому для правильной дозировки необходим тщательный и постоянный контроль их содержания в крови пациента. Традиционное определение иммунодепрессантов, основанное на иммуноферментном анализе, отличается невысокой специфичностью и чувствительностью, поэтому сегодня все большее значение приобретает жидкостная тандемная масс-спектрометрия как наиболее быстрый, чувствительный и селективный метод. Однако две основные проблемы затрудняют широкое внедрение масс-спектрометрии в практику клинического лабораторного анализа: длительная и трудоемкая подготовка образцов и достаточно высокие требования к квалификации операторов масс-спектрометрического оборудования. Поэтому масс-спектрометрия пока проигрывает иммунохимии по таким показателям, как производительность, удобство и простота работы.
Использование системы Shimadzu CLAM-2000 для автоматизированной подготовки образцов к последующему масс-спектрометрическому анализу позволяет практически полностью избавиться от проблем с пробоподготовкой и сделать работу на масс-спектрометре такой же простой и производительной, как на традиционных иммунохимических анализаторах. Об этой системе мы рассказывали в предыдущих выпусках журнала[1]. Приведем пример полностью автоматизированного количественного определения четырех основных иммунодепрессантов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для количественного определения иммунодепрессантов использовали коммерческий набор Dosimmune (Alsachim, Франция), включающий раствор для экстракции определяемых компонентов из цельной крови и изотопно-меченые (13С) внутренние стандарты целевых иммунодепрессантов (далее 13С-стандарты). Подготовку образцов цельной крови осуществляли в автоматическом режиме при помощи модуля CLAM-2000 (рис.1), а анализ проводили на УВЭЖХ-системе Nexera X2 с тандемным масс-спектрометрическим детектором LCMS-8050 (все производства Shimadzu, Япония). Список целевых веществ и стандартов представлен в табл.1.
CLAM-2000 осуществляет следующие операции: дозирование образцов, реагентов и внутренних стандартов; перемешивание и/или встряхивание; фильтрацию; инкубирование при заданной температуре; автоматическую загрузку подготовленных к анализу проб в автодозатор ВЭЖХ-МС/МС системы.
Пробирки с образцами цельной крови помещали в соответствующую турель CLAM-2000. Автоматизированная пробоподготовка включала добавление к 5 мкл образца 12,5 мкл раствора внутренних стандартов и 175 мкл раствора для экстракции с последующим 30-секундным перемешиванием и финальной фильтрацией в течение минуты. Полученный фильтрат поступал в автодозатор системы Nexera X2 и далее немедленно начинался анализ.
Условия УВЭЖХ-анализа: Nexera X2 и набор Dosimmune
Колонка-ловушка: Ascentis C8 4,6 Ч 30 мм, 5 мкм.
Аналитическая колонка: Ascentis C18 2,1 Ч 50 мм, 5 мкм.
Объем пробы: 20 мкл.
Подвижная фаза А: 90% 3 мМ раствора формиата аммония (pH=3,6) + 10% метанола.
Подвижная фаза В: 10% 3 мМ раствора формиата аммония (pH=3,6) + 90% метанола.
Поток подвижной фазы А: 2 мл/мин (колонка-ловушка).
Поток подвижной фазы В: 0,8 мл/мин (аналитическая колонка).
Температура термостата колонок: 65°С.
Условия МС/МС: LCMS-8050
Поток газа-распылителя: 3 л/мин (азот).
Поток горячего газа: 10 л/мин (воздух).
Поток газа-осушителя: 10 л/мин (азот).
Температура интерфейса: 200°C.
Температура линии десольватации: 250°C.
Температура нагревательного блока: 200°C.
Пауза между регистрациями сигнала: 1 мс.
Время переключения полярности ионизации: 5 мс.
Количество точек данных на пик: >30.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как правило, в количественном масс-спектрометрическом анализе используют дейтерированные внутренние стандарты. Однако они отличаются сравнительно невысоким уровнем изотопного обогащения, что зачастую приводит к некорректным количественным результатам (завышение концентрации нативных соединений). В настоящей работе использовали 13С-стандарты для трех иммунодепрессантов, что обеспечило более высокую точность результатов вкупе с существенным снижением матричного эффекта. Разработанная методика анализа обеспечивала линейный отклик в терапевтическом диапазоне концентраций 0,5–40,0 нг/мл (для такролимуса, сиролимуса и эверолимуса) и 5–1 500 нг/мл для циклоспорина-А (рис.3). Для всех целевых соединений линейность (R2) была выше 0,99, а отношение сигнал / шум при определении концентраций на уровне LLOQ (нижний предел количественного обнаружения) превышало 25 : 1 (рис.4). Предел количественного обнаружения составил 0,5 нг/мл (для такролимуса, сиролимуса и эверолимуса) и 5 нг/мл для циклоспорина-А. Анализ образцов цельной крови с известной концентрацией иммунодепрессантов показал, что точность (сходимость) результатов во всем диапазоне находится на очень хорошем уровне и составляет 85–115% (табл.2).
Приведенные примеры подтверждают высокие точность, чувствительность и селективность предложенной методики анализа. Таким образом, количественное определение важнейших иммунодепрессантов в цельной крови методом тандемной жидкостной масс-спектрометрии с полностью автоматизированной пробоподготовкой и с использованием высококачественных 13С-стандартов обеспечивает более высокое качество получаемых результатов по сравнению с традиционными способами анализа. ■
Использование системы Shimadzu CLAM-2000 для автоматизированной подготовки образцов к последующему масс-спектрометрическому анализу позволяет практически полностью избавиться от проблем с пробоподготовкой и сделать работу на масс-спектрометре такой же простой и производительной, как на традиционных иммунохимических анализаторах. Об этой системе мы рассказывали в предыдущих выпусках журнала[1]. Приведем пример полностью автоматизированного количественного определения четырех основных иммунодепрессантов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для количественного определения иммунодепрессантов использовали коммерческий набор Dosimmune (Alsachim, Франция), включающий раствор для экстракции определяемых компонентов из цельной крови и изотопно-меченые (13С) внутренние стандарты целевых иммунодепрессантов (далее 13С-стандарты). Подготовку образцов цельной крови осуществляли в автоматическом режиме при помощи модуля CLAM-2000 (рис.1), а анализ проводили на УВЭЖХ-системе Nexera X2 с тандемным масс-спектрометрическим детектором LCMS-8050 (все производства Shimadzu, Япония). Список целевых веществ и стандартов представлен в табл.1.
CLAM-2000 осуществляет следующие операции: дозирование образцов, реагентов и внутренних стандартов; перемешивание и/или встряхивание; фильтрацию; инкубирование при заданной температуре; автоматическую загрузку подготовленных к анализу проб в автодозатор ВЭЖХ-МС/МС системы.
Пробирки с образцами цельной крови помещали в соответствующую турель CLAM-2000. Автоматизированная пробоподготовка включала добавление к 5 мкл образца 12,5 мкл раствора внутренних стандартов и 175 мкл раствора для экстракции с последующим 30-секундным перемешиванием и финальной фильтрацией в течение минуты. Полученный фильтрат поступал в автодозатор системы Nexera X2 и далее немедленно начинался анализ.
Условия УВЭЖХ-анализа: Nexera X2 и набор Dosimmune
Колонка-ловушка: Ascentis C8 4,6 Ч 30 мм, 5 мкм.
Аналитическая колонка: Ascentis C18 2,1 Ч 50 мм, 5 мкм.
Объем пробы: 20 мкл.
Подвижная фаза А: 90% 3 мМ раствора формиата аммония (pH=3,6) + 10% метанола.
Подвижная фаза В: 10% 3 мМ раствора формиата аммония (pH=3,6) + 90% метанола.
Поток подвижной фазы А: 2 мл/мин (колонка-ловушка).
Поток подвижной фазы В: 0,8 мл/мин (аналитическая колонка).
Температура термостата колонок: 65°С.
Условия МС/МС: LCMS-8050
Поток газа-распылителя: 3 л/мин (азот).
Поток горячего газа: 10 л/мин (воздух).
Поток газа-осушителя: 10 л/мин (азот).
Температура интерфейса: 200°C.
Температура линии десольватации: 250°C.
Температура нагревательного блока: 200°C.
Пауза между регистрациями сигнала: 1 мс.
Время переключения полярности ионизации: 5 мс.
Количество точек данных на пик: >30.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как правило, в количественном масс-спектрометрическом анализе используют дейтерированные внутренние стандарты. Однако они отличаются сравнительно невысоким уровнем изотопного обогащения, что зачастую приводит к некорректным количественным результатам (завышение концентрации нативных соединений). В настоящей работе использовали 13С-стандарты для трех иммунодепрессантов, что обеспечило более высокую точность результатов вкупе с существенным снижением матричного эффекта. Разработанная методика анализа обеспечивала линейный отклик в терапевтическом диапазоне концентраций 0,5–40,0 нг/мл (для такролимуса, сиролимуса и эверолимуса) и 5–1 500 нг/мл для циклоспорина-А (рис.3). Для всех целевых соединений линейность (R2) была выше 0,99, а отношение сигнал / шум при определении концентраций на уровне LLOQ (нижний предел количественного обнаружения) превышало 25 : 1 (рис.4). Предел количественного обнаружения составил 0,5 нг/мл (для такролимуса, сиролимуса и эверолимуса) и 5 нг/мл для циклоспорина-А. Анализ образцов цельной крови с известной концентрацией иммунодепрессантов показал, что точность (сходимость) результатов во всем диапазоне находится на очень хорошем уровне и составляет 85–115% (табл.2).
Приведенные примеры подтверждают высокие точность, чувствительность и селективность предложенной методики анализа. Таким образом, количественное определение важнейших иммунодепрессантов в цельной крови методом тандемной жидкостной масс-спектрометрии с полностью автоматизированной пробоподготовкой и с использованием высококачественных 13С-стандартов обеспечивает более высокое качество получаемых результатов по сравнению с традиционными способами анализа. ■
Отзывы читателей
