eng
Выпуск #6/2017
Г.А.Калабин, В.Г.Васильев, В.А.Ивлев, Н.А.Комаров, Р.А.Абрамович
Быстрый скрининг лекарственных средств без стандартных образцов: ренессанс низкопольных спектрометров ЯМР
Быстрый скрининг лекарственных средств без стандартных образцов: ренессанс низкопольных спектрометров ЯМР
Просмотры: 2327
Предложено применение современных низкопольных спектрометров ЯМР 1Н на рабочей частоте 60 МГц для контроля подлинности лекарственных средств. Для валидации и верификации разрабатываемых методик бесстандартного скрининга рекомендован тандем низкопольной и высокопольной (более 300 МГц для 1Н) аппаратуры ЯМР.
УДК 543.51, 543.429.23; ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.37.6.44.50
УДК 543.51, 543.429.23; ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2017.37.6.44.50
Для защиты здоровья потребителей несомненна важность быстрого скрининга лекарственных средств, поступающих в аптечную сеть и лечебные учреждения. Для доказательства подлинности и качества ЛС в фармакопейных статьях содержатся валидированные методики с применением стандартных образцов. В отличие от них скрининговые методы должны отвечать следующим требованиям: простота или отсутствие пробоподготовки, не сложная и не продолжительная процедура измерения, возможность быстро идентифицировать интересующую компоненту (обычно лекарственную субстанцию) и оценить ее содержание для оперативного принятия решения [1]. С позиций универсальности, информативности и фундаментальности среди известных методов анализа такими возможностями в наибольшей степени обладает единственный – количественная спектроскопия ядерного магнитного резонанса.
ПОДБОР ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ СКРИНИНГА
В международной системе СИ спектроскопия ЯМР признана прямым методом определения мольной доли веществ в растворах. Сегодня – это общепринятый уникальный метод обнаружения, идентификации строения и определения содержания компонентов сложных смесей, какими являются ЛС. Метод широко используется в фармакопеях развитых стран и входит в Государственную фармакопею РФ около 20 лет. Однако, его применение в отечественной практике контроля ЛС по состоянию на 2017 год, помимо контроля подлинности стандартных образцов, ограничивается всего двумя фармакопейными статьями, относящимися к анализу гепарина и карбогидратов вакцин. Такое осторожное отношение к методу ЯМР можно объяснить высокой стоимостью и жесткими условиями эксплуатации современных высокопольных исследовательских спектрометров ЯМР, которые требуют, в частности, бесперебойного снабжения их криожидкостями (гелий, азот)[1]. Немаловажен и человеческий фактор: из-за недостатков профессиональной подготовки отечественных специалистов-фармацевтов среди них распространены ошибочные представления о сложности регистрации и интерпретации ЯМР-спектров.
После появления в 1960-х первой генерации коммерческих спектрометров ЯМР с резонансными частотами для протонов 40–100 МГц на базе электромагнитов весом несколько тонн и без фурье-преобразования потребовалось около 50 лет для технического ренессанса в производстве нового поколения низкопольного аналитического оборудования ЯМР. Сегодня предлагается несколько серийных моделей фурье-спектрометров с рабочей частотой для ядер 1Н 60 МГц, главная особенность которых – новые компактные и легкие постоянные магниты вместо электромагнитов. Преимущества таких приборов перед высокопольными системами с криомагнитами: отсутствует необходимость в криожидкостях, малые энергопотребление, размер и вес, предельная простота использования, совершенное программное обеспечение и, как результат, сниженная на порядок и более стоимость. Однако уменьшение резонансной частоты влечет за собой неизбежные последствия: чувствительность уменьшается в несколько десятков раз, а спектры усложняются, поскольку мультиплетные сигналы отдельных протонов перекрываются значительно сильнее. Тем не менее, широкие возможности, очевидную эффективность и перспективность нового поколения низкопольного оборудования уже показали примеры их использования для решения учебно-образовательных, научно-прикладных и индустриальных задач в химическом анализе [2–5], мониторинге реакций [6], оценке качества [7], хемометрике на основе корреляций "строение – свойства", а также для непрерывного контроля процессов в промышленности [8, 9]. В фармацевтической химии также появились единичные публикации, посвященные идентификации наиболее простых по составу лекарственных субстанций [10], выявлению фальсификаций синтетическими компонентами некоторых парафармацевтиков – ингибиторов ФДЭ-5 и средств снижения веса [11], выявлению природы и строения используемых в фармацевтике растительных масел [12]. Во всех случаях использовали методики быстрого скрининга со временами регистрации спектров ЯМР 1Н (зависит от концентрации аналита, характера задачи, уровня выявляемых примесей), не превышающими нескольких десятков минут.
Наша научная группа разрабатывает новую методологию фармакопейного анализа на основе сочетания методов спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии (см., например, [13] и ссылки в ней). С начала 2017 года проходит апробацию фурье-спектрометр ЯМР Pulsar (рис.1) компании Oxford Instruments (Великобритания) с рабочей частотой 60 МГц для 1Н, обладающий среди приборов такого класса наиболее высокой чувствительностью (S/N > 150 для раствора 1% этилбензола в хлороформе) и разрешением (лучше 0,5 Гц). Близкие характеристики имеет настольный ЯМР-спектрометр Spinsolve компании Magritek, параметры которого подробно описаны в [14]. Спектрометр Pulsar укомплектован мультиядерным датчиком 1Н, 19F, 13C, может работать в режиме двумерных гомо- и гетероядерных экспериментов, использует стандартные ампулы для ЯМР диаметром 5 мм, имеет пакет программного обеспечения Mnova NMR от MestreLab. Проведена оценка его возможностей по идентификации и количественному анализу различных гипертензивных ЛС, антибиотиков, олигопептидных препаратов, флавоногликозидов, исследованных ранее на высокопольном оборудовании с рабочими частотами 400 и 600 МГц. В представленной работе в качестве объектов быстрого скрининга рассмотрено несколько популярных коммерческих антибиотиков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Все анализируемые ЛС приобретены в аптечных сетях.
Офлоксацин (I) – синтетический антибактериальный препарат широкого спектра действия из группы фторхинолонов, содержащий смесь энантиомеров, активным веществом является левовращающий изомер – левофлоксацин. Химическая формула: ( ± )-9-фтор-2,3-дигидро-3-метил-10-(4-метил-1-пиперазинил)-7-оксо-7H-пиридо[1,2,3-de]1,4-бензоксазин-6-карбоновая кислота гемигидрат. Брутто-формула: C18H20FN3O4, М = 361,4 г/моль. Структурная формула представлена на рис.2. Изучены таблетки дженерика "Офлоксацин" (производитель ООО "Озон", серия 030516, годен до 06.19) с указанным содержанием субстанции 200 мг на таблетку. Вспомогательные вещества – целлюлоза микрокристаллическая, крахмал картофельный, повидон (поливинилпирролидон), кроскармеллоза натрия, магния стеарат.
Левофлоксацин (II), левовращающий изомер офлаксацина. Изучены таблетки дженерика "Таваник" (производитель "Санофи Винтроп Индустрия", серия 4CF5C, годен до 31.03.19) с указанным содержанием лекарственной субстанции 500 мг на таблетку. Вспомогательные вещества – кросповидон, гипромеллоза, целлюлоза микрокристаллическая, натрия стеарилфумарат.
Тетрациклин (III) – бактериостатический антибиотик группы тетрациклинов. Химическое название: [4S-(4альфа,4а альфа,5а альфа,6бета,12а альфа)]-4-(диметиламино)-1,4,4а,5,5а,6,11,12а-октагидро-3,6,10,12,12а-пентагидрокси-6-метил-1,11-диоксо-2-нафтаценкарбоксамид (в виде гидрохлорида или тригидрата). Брутто-формула C22H24N2O8, М = 444,35 г/моль. Структурная формула представлена на рис.3. Изучены таблетки дженерика "Тетрациклин" (производитель РУП "Белмедпрепараты", серия 030116, годен до 02.19), содержащие тетрациклин 100 мг на таблетку. Вспомогательные вещества – сахароза, краситель арбутин Е-122 и другие, указанные в спецификации.
Комбинация сульфаметоксазола (IV) и триметоприма (V) – бактерицидные препараты широкого спектра действия. Химические названия: 4-амино-N-(5-метилизоксазол-3-ил)-бензолсульфонамид и 5-(3,4,5-триметоксибензил)пиримидин-2,4-диамин, соответственно. Брутто-формулы и молярные массы С10Н11N3O3S, M = 253 г/моль и С14Н18N4O3, M = 290 г/моль, соответственно; структурные формулы на рис.4. Изучены таблетки препарата "Бисептол" (производитель "Польфа" (Польша), номер серии 41611062, срок годности – до 01.07.2019), содержащие на одну таблетку специфицированное содержание 400 мг сульфаметоксазола и 80 мг триметоприма, соответственно. Вспомогательные вещества – картофельный крахмал, тальк, магния стеарат, поливиниловый спирт, пропиленгликоль, метил-п-гидроксибензоат, пропил-п-гидроксибензоат.
В работе использованы следующие растворители и стандарты: хлороформ-d1 (99,8%, Sigma-Aldrich), метанол-d4 (99,9%, Sigma-Aldrich), гексаметилдисилоксан (ГМДС) (99,8%, Sigma-Aldrich), трифторуксусная кислота (ХЧ), диметилсульфон (ДМСО2) (ХЧ).
Стандартная пробоподготовка: измельчение таблеток в ступке, отбор точной навески, рассчитанной на 30 мг лекарственной субстанции в 1 мл растворителя, растворение в выбранном растворителе, встряхивание, обработка в УЗ-бане, отделение нерастворимых веществ центрифугированием, перенесение надосадочной жидкости в ампулы для ЯМР, добавление точной навески калибровочного соединения (если в качестве него не используется сигнал точно измеренных остаточных протонов дейтерированного растворителя). Доказательство полноты экстракции лекарственной субстанции из ЛС всегда контролировали по отсутствию ее сигналов в спектре ЯМР 1Н раствора перерастворенного осадка.
Для подтверждения отнесения сигналов в спектре ЯМР на 60 МГц и верификации количественных результатов использовали ЯМР-спектрометр JNM ECA 600 (Jeol, Япония) с рабочей частотой для ядер 1Н 600 МГц.
Общие условия регистрации спектров ЯМР на 60 и 600 МГц: ширина фильтра 18 м.д. с установкой несущей частоты 7,0 м.д., импульс 90°, задержка между импульсами 30 с, 32 тыс. точек на спектр, автоматическая настройка фазы и базовой линии. Спектры регистрировали при температуре 23 °С на частоте 600 МГц и 36 °С – на 60 МГц. Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Mnova NMR (MestreLab, Испания). Другие условия регистрации спектров для разных объектов могут определяться используемым растворителем, его концентрацией, выбором калибровочного сигнала для количественного определения интересующих соединений.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Офлоксацин и левофлоксацин. Спектры ЯМР 1Н левофлоксацина в ДМСО-d6 [15] и D2O [16] опубликованы ранее, хотя отнесение сигналов в обоих случаях содержало ошибки. Так, для группы СООН в ДМСО-d6 указано положение сигнала в области 4,5–5,0 м.д., что не соответствует реальному спектру (15,03 м.д.). Обнаружено, что в качестве растворителя для офлоксацина и левофлоксацина лучше подходит CDCl3, в растворе которого разрешаются все сигналы 1Н на 600 МГц и их большинство на 60 МГц. Использовали CDCl3 с точно измеренным содержанием остаточных протонов 0,2%, то есть 0,125 моль/мл.
Спектр ЯМР 1Н ЛС "Таваник" на частоте 600 МГц (рис.2а) содержит следующие сигналы (CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 1,58 (3Н, д, J = 7,0 Гц, С3Н–СН3); 2,34 (3Н, с, N–CН3); 2,46–2,58 (4Н, м, H-13’, H-14’); 3,30–3,44 (4Н, м, H-11’, H-12’); 4,34 (1Н, д, J = 11,1 Гц, Н-2); 4.43 (1Н, д, J = 11,1 Гц, Н-2); 4,52–4,59 (1Н, м, 3-Н); 7,63 (1Н, д, J = 12,3 Гц, Н-8); 8,62 (1Н, с, Н-5); 15,03 (1Н, уш.с., COOH).
Спектр полностью соответствует структурной формуле субстанции, сигналов вспомогательных веществ не обнаружено. Расчет содержания субстанции выполнен по соотношению интегральных интенсивностей ее сигналов и пиков протонов остаточных молекул CHCl3 в растворителе по уравнению, рекомендованному в Государственной Фармакопее РФ, XIII издание (ОФС. 1.2.1.1.0007.15) и учитывающему массы компонентов (m), их молярные массы (М), интенсивность отдельных сигналов, нормированных по числу эквивалентных протонов (I):
m(С) = [m(CHCl3)/M(CHCl3)] Ч [I(C)/I(CHCl3)] Ч M(C).
Средний результат трех независимых измерений содержания субстанции – (497,7 ± 2,9) мг на таблетку. Для левофлоксацина в качестве индикаторных приняты сигналы протонов у С5 и С8 при 8,62 м.д. и 7,63 м.д., соответственно. Для количественного определения субстанции при 600 МГц также удобно использовать сигнал метильной группы С–СН3, имеющий химический сдвиг 1,58 м.д.
Спектр ЯМР 1Н на частоте 60 МГц (рис.2б) содержит те же группы пиков и с теми же химическими сдвигами, однако некоторые (протоны у С2 и С3 в области около 4,5 м.д. и группы СН2 и СН3 около 2,5 м.д.) перекрываются из-за возросшего влияния спин-спинового взаимодействия на вид спектра. Наиболее очевидно это проявляется для сигналов протонов у С8, являющегося дублетом с константой J = 12,3 Гц, за счет вицинального взаимодействия с ядром 19F и С–СH3-группы. Над каждым пиком в спектре ЯМР 1Н на частоте 60 МГц указано число протонов, ответственных за него. Число и положение пиков в спектре на частоте 60 МГц, как и стехиометрическое соответствие их интенсивностей строению молекулы обеспечивают однозначную идентификацию левофлоксацина.
Количественное определение субстанции в таблетке по спектру 60 МГц сделано путем усреднения трех независимых измерений по трем отдельным сигналам протонов у С5 и С8 и С–СН3-группы. Результаты: (484,8 ± 5,0); (485,3 ± 5,0) и (486,5 ± 5,0) мг на таблетку, соответственно, то есть отклонение не более 3% от заявленного производителем.
На рабочей частоте ЯМР 1Н 60 МГц проведен быстрый скрининг подлинности и качества таблеток "Офлоксацин" производства ООО "Озон" с заявленным содержанием субстанции на таблетку 200 мг. Спектры ЯМР 1Н энантиомеров проявляются одинаково, поэтому спектр хлороформного экстракта таблеток "Офлоксацин" на частоте 60 МГц идентичен представленному на рис.2б. Однако, сравнение интегральных интенсивностей остаточных сигналов протонов CHCl3 и протонов у С5 и С8 привело к выводу, что содержание субстанции на таблетку составляет не 200 мг, а (95,6 ± 1,5) мг (по Н5) или (96,4 ± 1,5) мг (по Н8). Спектр ЯМР 1Н раствора после повторной экстракции из осадка, оставшегося после пробоподготовки, показал отсутствие в нем субстанции. Верификация результата на спектрометре 600 МГц также подтвердила почти двойное недовложение субстанции в таблетке – (97,8 ± 1,0) мг. За неимением стандартного образца доказательство фальсификации таблеток "Офлоксацин" методом ВЭЖХ проводили с использованием навески препарата "Таваник", содержащей известное количество лекарственной субстанции.
Тетрациклин. ЯМР-спектр на 600 МГц ЛС в растворителе CD3OD (рис.3а) содержит следующие сигналы (δ, м.д., J/Гц): 1,62 (c, 3H, CH3); 1,93 (дд, 1Н, Н-5); 2,10 (ддд, 1Н, Н-5’); 2,66 (ддд, 1Н, Н-4а); 2,72 (c, 6H, N(CH3)2); 2,97 (дд, 1Н, Н-5а); 3,44-3.52 (уш. сигнал, 1Н, Н-4); 6,90 (д, 1H, J = 8,2; H-9); 7,14 (д, 1H, J = 7,7; H-7); 7.49 (т, 1H, J = 8,1; H-8). Его характеристики полностью совпадают с известными данными [17]. Помимо сигналов субстанции, спектр ЯМР 1Н содержит ряд минорных пиков вспомогательных веществ в областях от 0,8 до 5,4 м.д. Для их устранения регистрацию спектра на 60 МГц выполнили также для экстракта из ЛС растворителем ДМСО-d6. Положение сигналов протонов незначительно изменилось, но появились пики отсутствующих в CD3OD протонов ОН-групп, которые дополнительно подтверждают формулу и согласуются с литературными данными [18].
Спектр в CD3OD на 60 МГц выглядит существенно сложнее из-за перекрывания мультиплетов отдельных протонов за исключением сигнала группы С6–СН3. Подтверждение строения субстанции в серии проб удобно выполнять путем сравнения профилей их спектров и уже подтвержденного (см. рис.3б) образца. Этот прием аналогичен широко используемому в Фармакопеях различных стран для спектров ИК. То есть представленный на рис.3б спектр в CD3OD может быть рекомендован как вторичный стандарт при идентификации других препаратов тетрациклина.
Количественное определение субстанции в растворе в CD3OD выполнено путем сравнения интенсивности сигнала добавленной навески гексаметилдисилоксана с суммарной интегральной интенсивностью трех ароматических протонов Н7, Н8 и Н9 в области 6,5–7,7 м.д. При измерении на 600 МГц рассчитано содержание субстанции – (101,4 ± 1,6), а для 60 МГц – (96,8 ± 3,5) мг на таблетку, что соответствует декларированному количеству. В обоих случаях результаты являются усредненными значениями для трех независимых образцов.
Композиция сульфаметоксазол – триметоприм. Выполнен скрининг подлинности таблеток комбинированного антимикробного препарата "Бисептол", содержащего на одну таблетку (~660 мг) специфицированное содержание 400 мг сульфаметоксазола (IV) и 80 мг триметоприма (V).
Интерпретация спектра ЯМР 1Н раствора ЛС "Бисептол" в ДМСО-d6 на частоте 600 МГц и вопрос количественного определения компонент обсуждались нами ранее [13].
Содержание лекарственных субстанций по спектру на 600 МГц в ДМСО-d6 легко определять сравнением интегральных интенсивностей сигнала трех протонов CH3-группы IV при 2,27 м.д. и шести протонов двух эквивалентных групп V при 3,72 м.д. с сигналом остаточных протонов молекул растворителя ДМСО-d5 (2,50 м.д.) по приведенной выше формуле. В частности, в навеске массой 52,6 мг (масса таблетки "Бисептола" 666,4 мг) обнаружено сульфаметоксазола 32,2 мг и триметоприма 6,3 мг, что при пересчете на целую таблетку составило содержание сульфаметоксазола и триметоприма (408,7 ± 4,1) и (79,9 ± 0,8) мг соответственно, что согласуется с указанными производителем значениями. Полученные результаты для двух других навесок отличались от представленной не более чем на 2%.
В спектре ЯМР 1Н на частоте 60 МГц в растворителе ДМСО-d6 разрешение некоторых сигналов оказалось существенно хуже из-за близости отдельных групп и мультиплетности. Использование сигнала остаточных протонов молекул ДМСО-d5 для количественного определения субстанций в ЛС оказалось невозможным из-за его перекрывания с сигналом протонов CH3-группы IV при 2,27 м.д. Поэтому выполнена регистрация спектра раствора ЛС в трифторуксусной кислоте с добавкой (CH3)2SO2 около 3,0 м.д в качестве калибровочного пика. С этим сигналом сравнивали нормированные интегральные интенсивности трех протонов CH3-группы IV при 2,27 м.д. и совокупности одиннадцати протонов V в области 3,5–4,0 м.д. (рис.4). Расчет – (401,2 ± 8,0) мг IV и (77,6 ± 2,0) мг V на таблетку – хорошо согласуется как с измерениями для 600 МГц, так и с заявленными значениями.
Обобщенные результаты количественного определения рассмотренных субстанций в ЛС представлены в табл.1.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представлено три примера быстрого скрининга ЛС с использованием спектроскопии ЯМР 1Н на рабочей частоте 60 МГц для идентификации и определения содержания лекарственных субстанций. В первом (офлоксацин, левофлоксацин) характер спектра позволяет полностью его интерпретировать и количественно измерить содержание лекарственных субстанций. Во втором (тетрациклин) усложненная спектральная картина требует для однозначной идентификации строения предварительного анализа спектра 1Н на более высоких частотах. Спектр на 60 МГц используется в формате "отпечатка пальцев" с количественным определением субстанции путем сравнения интенсивностей совокупности выделенных индикаторных и калибровочного сигналов. Для отдельных ЛС, содержащих композицию лекарственных субстанций (сульфаметоксазол + триметоприм), усложнение количественной интерпретации спектра на 60 МГц может быть преодолено сменой растворителя и калибранта.
Представленные результаты демонстрируют возможности спектрометра ЯМР 1Н 60 МГц для быстрой идентификации и измерения в ЛС содержания лекарственных субстанций без применения стандартных образцов. Для верификации результатов при создании валидированных методик, требующих выполнения необходимых тестов, целесообразно привлечение, как стандартных образцов, так и спектроскопии ЯМР в сильных магнитных полях. По экономичности, быстроте и информативности методики на основе спектров ЯМР на рабочей частоте 60 МГц могут заметно превосходить применяемые ныне хроматографические и оптические. Приготовление трех независимых проб, регистрация их спектров и расчет результатов без использования стандартных образцов занимает менее часа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Varcarcel M., Caerdenas S., Gallego M. Sample screening systems in analytical chemistry // Trends in Anal. Chem. 1999. 18 (11). P. 685–694.
2. Danieli E., Mauler J., Perlo J., Blumich B., Casanova F. Mobile sensor for high resolution NMR spectroscopy and imaging // J. Mag. Res. 2009. 198 (1). P. 80–87.
3. Danieli E., Perlo J., Blumich B., Casanova F. Small magnets for portable NMR spectrometers // Angewandte Chemie. 2010. 49 (24). P. 4133–4135.
4. Jacobsen N.E. NMR spectroscopy explained: simplified theory, applications and examples for organic chemistry and structural biology // John Wiley&Sons, New Jersey. 2007.
5. Friebolin H. Basic one – and two-dimentional NMR spectroscopy. 5th edition // Wiley-VCH, Germany. 2011.
6. Berger S., Braun S. 200 and more NMR experiments. A practical course // Wiley-VCH, Germany. 2004.
7. Dalitz F., Cudaj M., Maiwald M., Guthausen G. Process and reaction monitoring by low-field NMR spectroscopy // Prog. Nuc. Mag. Res. Spec. 2012. 60. P. 52–70.
8. Edwards J.C., Giammatteo P.J. Progress NMR spectroscopy: technology and on-line applications. Chapter 10 in process analytical technology: spectroscopic tools and Implementation strategies for the chemical and pharmaceutical industries, 2nd ed. // Blackwell-Wiley. 2010.
9. Edwards J.C. A review of applications of NMR spectroscopy in petroleum chemistry. Chapter 16 in monograph 9 on spectroscopic analysis of petroleum products and lubricants // ASTM Books. 2011.
10. Gonilleux B., Cherrie B. Ultrafast 2D NMR on a benchtop spectrometer: application and perspectives // Trends in Anal. Chem. 2016. 83. P. 65–75.
11. Pages G., Gerdova A., Williamson D., Gilard V., Martino R., Malet-Martino M. Evaluation of a benchtop cryogen-free low-field 1H NMR spectrometer for the analysis of sexual enhancement and weight loss dietary supplements adulterated with pharmaceutical substances // Anal. Chem. 2014. 86. P. 11897–11904.
12. Parker T., Limer E., Watson A.D., Defernez M., Williamson D., Kamsley E.K. 60 MHz 1H NMR spectroscopy for the analysis of edible oils // Trends in Anal. Chem. 2014. 57. P. 147–158.
13. Калабин Г., Васильев В., Чернецова Е., Прокопьев А., Абрамович Р., Ивлев В., Митео И. Экспертиза качества лекарственных средств без стандартных образцов // АНАЛИТИКА. 2017. № 2. С. 106–112.
14. Кудякова В., Чазов А. Полноценный ЯМР-анализ на лабораторном столе: ЯМР-спектрометры Spinsolve компании Magritek // АНАЛИТИКА. 2017. № 2. С. 80–83.
15. Salem A.A., Mossa H.A., Barsoum B.N. Quantitative determination of levofloxacin and rifampicin in pharmaceutical and urine samples using nuclear magnetic resonance spectroscopy // Spectrochimica Acta Part A. 2005. 62. P. 466–472.
16. Salem A.A., Mossa H.A. Method validation and determinations of levofloxacin, metronidazole and sulfamethoxazole in an aqueous pharmaceutical, urine and blood plasma samples using quantitative nuclear magnetic resonance spectrometry // Talanta. 2012. 88. P. 104–114.
17. Othersen O.G., Waibel R., Lanig H., Gmeiner P. and Clark T. SCRF-DFT and NMR comparison of tetracycline and 5a,6-anhydrotetracycline in solution // J. Phys. Chem. B. 2006. 110. P. 24766–24774.
18. Casy A.F., Yasin A. Stereochemical studies of tetracicline antibiotics and their common impurities by 400 MHz 1H NMR spectroscopy // Mag. Res.in Chem. 1985. 23 (9). P. 767–770.
[1] Высокопольными принято называть спектрометры ЯМР, в которых источниками магнитного поля служат сверхпроводящие магниты с криогенным охлаждением.
ПОДБОР ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ СКРИНИНГА
В международной системе СИ спектроскопия ЯМР признана прямым методом определения мольной доли веществ в растворах. Сегодня – это общепринятый уникальный метод обнаружения, идентификации строения и определения содержания компонентов сложных смесей, какими являются ЛС. Метод широко используется в фармакопеях развитых стран и входит в Государственную фармакопею РФ около 20 лет. Однако, его применение в отечественной практике контроля ЛС по состоянию на 2017 год, помимо контроля подлинности стандартных образцов, ограничивается всего двумя фармакопейными статьями, относящимися к анализу гепарина и карбогидратов вакцин. Такое осторожное отношение к методу ЯМР можно объяснить высокой стоимостью и жесткими условиями эксплуатации современных высокопольных исследовательских спектрометров ЯМР, которые требуют, в частности, бесперебойного снабжения их криожидкостями (гелий, азот)[1]. Немаловажен и человеческий фактор: из-за недостатков профессиональной подготовки отечественных специалистов-фармацевтов среди них распространены ошибочные представления о сложности регистрации и интерпретации ЯМР-спектров.
После появления в 1960-х первой генерации коммерческих спектрометров ЯМР с резонансными частотами для протонов 40–100 МГц на базе электромагнитов весом несколько тонн и без фурье-преобразования потребовалось около 50 лет для технического ренессанса в производстве нового поколения низкопольного аналитического оборудования ЯМР. Сегодня предлагается несколько серийных моделей фурье-спектрометров с рабочей частотой для ядер 1Н 60 МГц, главная особенность которых – новые компактные и легкие постоянные магниты вместо электромагнитов. Преимущества таких приборов перед высокопольными системами с криомагнитами: отсутствует необходимость в криожидкостях, малые энергопотребление, размер и вес, предельная простота использования, совершенное программное обеспечение и, как результат, сниженная на порядок и более стоимость. Однако уменьшение резонансной частоты влечет за собой неизбежные последствия: чувствительность уменьшается в несколько десятков раз, а спектры усложняются, поскольку мультиплетные сигналы отдельных протонов перекрываются значительно сильнее. Тем не менее, широкие возможности, очевидную эффективность и перспективность нового поколения низкопольного оборудования уже показали примеры их использования для решения учебно-образовательных, научно-прикладных и индустриальных задач в химическом анализе [2–5], мониторинге реакций [6], оценке качества [7], хемометрике на основе корреляций "строение – свойства", а также для непрерывного контроля процессов в промышленности [8, 9]. В фармацевтической химии также появились единичные публикации, посвященные идентификации наиболее простых по составу лекарственных субстанций [10], выявлению фальсификаций синтетическими компонентами некоторых парафармацевтиков – ингибиторов ФДЭ-5 и средств снижения веса [11], выявлению природы и строения используемых в фармацевтике растительных масел [12]. Во всех случаях использовали методики быстрого скрининга со временами регистрации спектров ЯМР 1Н (зависит от концентрации аналита, характера задачи, уровня выявляемых примесей), не превышающими нескольких десятков минут.
Наша научная группа разрабатывает новую методологию фармакопейного анализа на основе сочетания методов спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии (см., например, [13] и ссылки в ней). С начала 2017 года проходит апробацию фурье-спектрометр ЯМР Pulsar (рис.1) компании Oxford Instruments (Великобритания) с рабочей частотой 60 МГц для 1Н, обладающий среди приборов такого класса наиболее высокой чувствительностью (S/N > 150 для раствора 1% этилбензола в хлороформе) и разрешением (лучше 0,5 Гц). Близкие характеристики имеет настольный ЯМР-спектрометр Spinsolve компании Magritek, параметры которого подробно описаны в [14]. Спектрометр Pulsar укомплектован мультиядерным датчиком 1Н, 19F, 13C, может работать в режиме двумерных гомо- и гетероядерных экспериментов, использует стандартные ампулы для ЯМР диаметром 5 мм, имеет пакет программного обеспечения Mnova NMR от MestreLab. Проведена оценка его возможностей по идентификации и количественному анализу различных гипертензивных ЛС, антибиотиков, олигопептидных препаратов, флавоногликозидов, исследованных ранее на высокопольном оборудовании с рабочими частотами 400 и 600 МГц. В представленной работе в качестве объектов быстрого скрининга рассмотрено несколько популярных коммерческих антибиотиков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Все анализируемые ЛС приобретены в аптечных сетях.
Офлоксацин (I) – синтетический антибактериальный препарат широкого спектра действия из группы фторхинолонов, содержащий смесь энантиомеров, активным веществом является левовращающий изомер – левофлоксацин. Химическая формула: ( ± )-9-фтор-2,3-дигидро-3-метил-10-(4-метил-1-пиперазинил)-7-оксо-7H-пиридо[1,2,3-de]1,4-бензоксазин-6-карбоновая кислота гемигидрат. Брутто-формула: C18H20FN3O4, М = 361,4 г/моль. Структурная формула представлена на рис.2. Изучены таблетки дженерика "Офлоксацин" (производитель ООО "Озон", серия 030516, годен до 06.19) с указанным содержанием субстанции 200 мг на таблетку. Вспомогательные вещества – целлюлоза микрокристаллическая, крахмал картофельный, повидон (поливинилпирролидон), кроскармеллоза натрия, магния стеарат.
Левофлоксацин (II), левовращающий изомер офлаксацина. Изучены таблетки дженерика "Таваник" (производитель "Санофи Винтроп Индустрия", серия 4CF5C, годен до 31.03.19) с указанным содержанием лекарственной субстанции 500 мг на таблетку. Вспомогательные вещества – кросповидон, гипромеллоза, целлюлоза микрокристаллическая, натрия стеарилфумарат.
Тетрациклин (III) – бактериостатический антибиотик группы тетрациклинов. Химическое название: [4S-(4альфа,4а альфа,5а альфа,6бета,12а альфа)]-4-(диметиламино)-1,4,4а,5,5а,6,11,12а-октагидро-3,6,10,12,12а-пентагидрокси-6-метил-1,11-диоксо-2-нафтаценкарбоксамид (в виде гидрохлорида или тригидрата). Брутто-формула C22H24N2O8, М = 444,35 г/моль. Структурная формула представлена на рис.3. Изучены таблетки дженерика "Тетрациклин" (производитель РУП "Белмедпрепараты", серия 030116, годен до 02.19), содержащие тетрациклин 100 мг на таблетку. Вспомогательные вещества – сахароза, краситель арбутин Е-122 и другие, указанные в спецификации.
Комбинация сульфаметоксазола (IV) и триметоприма (V) – бактерицидные препараты широкого спектра действия. Химические названия: 4-амино-N-(5-метилизоксазол-3-ил)-бензолсульфонамид и 5-(3,4,5-триметоксибензил)пиримидин-2,4-диамин, соответственно. Брутто-формулы и молярные массы С10Н11N3O3S, M = 253 г/моль и С14Н18N4O3, M = 290 г/моль, соответственно; структурные формулы на рис.4. Изучены таблетки препарата "Бисептол" (производитель "Польфа" (Польша), номер серии 41611062, срок годности – до 01.07.2019), содержащие на одну таблетку специфицированное содержание 400 мг сульфаметоксазола и 80 мг триметоприма, соответственно. Вспомогательные вещества – картофельный крахмал, тальк, магния стеарат, поливиниловый спирт, пропиленгликоль, метил-п-гидроксибензоат, пропил-п-гидроксибензоат.
В работе использованы следующие растворители и стандарты: хлороформ-d1 (99,8%, Sigma-Aldrich), метанол-d4 (99,9%, Sigma-Aldrich), гексаметилдисилоксан (ГМДС) (99,8%, Sigma-Aldrich), трифторуксусная кислота (ХЧ), диметилсульфон (ДМСО2) (ХЧ).
Стандартная пробоподготовка: измельчение таблеток в ступке, отбор точной навески, рассчитанной на 30 мг лекарственной субстанции в 1 мл растворителя, растворение в выбранном растворителе, встряхивание, обработка в УЗ-бане, отделение нерастворимых веществ центрифугированием, перенесение надосадочной жидкости в ампулы для ЯМР, добавление точной навески калибровочного соединения (если в качестве него не используется сигнал точно измеренных остаточных протонов дейтерированного растворителя). Доказательство полноты экстракции лекарственной субстанции из ЛС всегда контролировали по отсутствию ее сигналов в спектре ЯМР 1Н раствора перерастворенного осадка.
Для подтверждения отнесения сигналов в спектре ЯМР на 60 МГц и верификации количественных результатов использовали ЯМР-спектрометр JNM ECA 600 (Jeol, Япония) с рабочей частотой для ядер 1Н 600 МГц.
Общие условия регистрации спектров ЯМР на 60 и 600 МГц: ширина фильтра 18 м.д. с установкой несущей частоты 7,0 м.д., импульс 90°, задержка между импульсами 30 с, 32 тыс. точек на спектр, автоматическая настройка фазы и базовой линии. Спектры регистрировали при температуре 23 °С на частоте 600 МГц и 36 °С – на 60 МГц. Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Mnova NMR (MestreLab, Испания). Другие условия регистрации спектров для разных объектов могут определяться используемым растворителем, его концентрацией, выбором калибровочного сигнала для количественного определения интересующих соединений.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Офлоксацин и левофлоксацин. Спектры ЯМР 1Н левофлоксацина в ДМСО-d6 [15] и D2O [16] опубликованы ранее, хотя отнесение сигналов в обоих случаях содержало ошибки. Так, для группы СООН в ДМСО-d6 указано положение сигнала в области 4,5–5,0 м.д., что не соответствует реальному спектру (15,03 м.д.). Обнаружено, что в качестве растворителя для офлоксацина и левофлоксацина лучше подходит CDCl3, в растворе которого разрешаются все сигналы 1Н на 600 МГц и их большинство на 60 МГц. Использовали CDCl3 с точно измеренным содержанием остаточных протонов 0,2%, то есть 0,125 моль/мл.
Спектр ЯМР 1Н ЛС "Таваник" на частоте 600 МГц (рис.2а) содержит следующие сигналы (CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 1,58 (3Н, д, J = 7,0 Гц, С3Н–СН3); 2,34 (3Н, с, N–CН3); 2,46–2,58 (4Н, м, H-13’, H-14’); 3,30–3,44 (4Н, м, H-11’, H-12’); 4,34 (1Н, д, J = 11,1 Гц, Н-2); 4.43 (1Н, д, J = 11,1 Гц, Н-2); 4,52–4,59 (1Н, м, 3-Н); 7,63 (1Н, д, J = 12,3 Гц, Н-8); 8,62 (1Н, с, Н-5); 15,03 (1Н, уш.с., COOH).
Спектр полностью соответствует структурной формуле субстанции, сигналов вспомогательных веществ не обнаружено. Расчет содержания субстанции выполнен по соотношению интегральных интенсивностей ее сигналов и пиков протонов остаточных молекул CHCl3 в растворителе по уравнению, рекомендованному в Государственной Фармакопее РФ, XIII издание (ОФС. 1.2.1.1.0007.15) и учитывающему массы компонентов (m), их молярные массы (М), интенсивность отдельных сигналов, нормированных по числу эквивалентных протонов (I):
m(С) = [m(CHCl3)/M(CHCl3)] Ч [I(C)/I(CHCl3)] Ч M(C).
Средний результат трех независимых измерений содержания субстанции – (497,7 ± 2,9) мг на таблетку. Для левофлоксацина в качестве индикаторных приняты сигналы протонов у С5 и С8 при 8,62 м.д. и 7,63 м.д., соответственно. Для количественного определения субстанции при 600 МГц также удобно использовать сигнал метильной группы С–СН3, имеющий химический сдвиг 1,58 м.д.
Спектр ЯМР 1Н на частоте 60 МГц (рис.2б) содержит те же группы пиков и с теми же химическими сдвигами, однако некоторые (протоны у С2 и С3 в области около 4,5 м.д. и группы СН2 и СН3 около 2,5 м.д.) перекрываются из-за возросшего влияния спин-спинового взаимодействия на вид спектра. Наиболее очевидно это проявляется для сигналов протонов у С8, являющегося дублетом с константой J = 12,3 Гц, за счет вицинального взаимодействия с ядром 19F и С–СH3-группы. Над каждым пиком в спектре ЯМР 1Н на частоте 60 МГц указано число протонов, ответственных за него. Число и положение пиков в спектре на частоте 60 МГц, как и стехиометрическое соответствие их интенсивностей строению молекулы обеспечивают однозначную идентификацию левофлоксацина.
Количественное определение субстанции в таблетке по спектру 60 МГц сделано путем усреднения трех независимых измерений по трем отдельным сигналам протонов у С5 и С8 и С–СН3-группы. Результаты: (484,8 ± 5,0); (485,3 ± 5,0) и (486,5 ± 5,0) мг на таблетку, соответственно, то есть отклонение не более 3% от заявленного производителем.
На рабочей частоте ЯМР 1Н 60 МГц проведен быстрый скрининг подлинности и качества таблеток "Офлоксацин" производства ООО "Озон" с заявленным содержанием субстанции на таблетку 200 мг. Спектры ЯМР 1Н энантиомеров проявляются одинаково, поэтому спектр хлороформного экстракта таблеток "Офлоксацин" на частоте 60 МГц идентичен представленному на рис.2б. Однако, сравнение интегральных интенсивностей остаточных сигналов протонов CHCl3 и протонов у С5 и С8 привело к выводу, что содержание субстанции на таблетку составляет не 200 мг, а (95,6 ± 1,5) мг (по Н5) или (96,4 ± 1,5) мг (по Н8). Спектр ЯМР 1Н раствора после повторной экстракции из осадка, оставшегося после пробоподготовки, показал отсутствие в нем субстанции. Верификация результата на спектрометре 600 МГц также подтвердила почти двойное недовложение субстанции в таблетке – (97,8 ± 1,0) мг. За неимением стандартного образца доказательство фальсификации таблеток "Офлоксацин" методом ВЭЖХ проводили с использованием навески препарата "Таваник", содержащей известное количество лекарственной субстанции.
Тетрациклин. ЯМР-спектр на 600 МГц ЛС в растворителе CD3OD (рис.3а) содержит следующие сигналы (δ, м.д., J/Гц): 1,62 (c, 3H, CH3); 1,93 (дд, 1Н, Н-5); 2,10 (ддд, 1Н, Н-5’); 2,66 (ддд, 1Н, Н-4а); 2,72 (c, 6H, N(CH3)2); 2,97 (дд, 1Н, Н-5а); 3,44-3.52 (уш. сигнал, 1Н, Н-4); 6,90 (д, 1H, J = 8,2; H-9); 7,14 (д, 1H, J = 7,7; H-7); 7.49 (т, 1H, J = 8,1; H-8). Его характеристики полностью совпадают с известными данными [17]. Помимо сигналов субстанции, спектр ЯМР 1Н содержит ряд минорных пиков вспомогательных веществ в областях от 0,8 до 5,4 м.д. Для их устранения регистрацию спектра на 60 МГц выполнили также для экстракта из ЛС растворителем ДМСО-d6. Положение сигналов протонов незначительно изменилось, но появились пики отсутствующих в CD3OD протонов ОН-групп, которые дополнительно подтверждают формулу и согласуются с литературными данными [18].
Спектр в CD3OD на 60 МГц выглядит существенно сложнее из-за перекрывания мультиплетов отдельных протонов за исключением сигнала группы С6–СН3. Подтверждение строения субстанции в серии проб удобно выполнять путем сравнения профилей их спектров и уже подтвержденного (см. рис.3б) образца. Этот прием аналогичен широко используемому в Фармакопеях различных стран для спектров ИК. То есть представленный на рис.3б спектр в CD3OD может быть рекомендован как вторичный стандарт при идентификации других препаратов тетрациклина.
Количественное определение субстанции в растворе в CD3OD выполнено путем сравнения интенсивности сигнала добавленной навески гексаметилдисилоксана с суммарной интегральной интенсивностью трех ароматических протонов Н7, Н8 и Н9 в области 6,5–7,7 м.д. При измерении на 600 МГц рассчитано содержание субстанции – (101,4 ± 1,6), а для 60 МГц – (96,8 ± 3,5) мг на таблетку, что соответствует декларированному количеству. В обоих случаях результаты являются усредненными значениями для трех независимых образцов.
Композиция сульфаметоксазол – триметоприм. Выполнен скрининг подлинности таблеток комбинированного антимикробного препарата "Бисептол", содержащего на одну таблетку (~660 мг) специфицированное содержание 400 мг сульфаметоксазола (IV) и 80 мг триметоприма (V).
Интерпретация спектра ЯМР 1Н раствора ЛС "Бисептол" в ДМСО-d6 на частоте 600 МГц и вопрос количественного определения компонент обсуждались нами ранее [13].
Содержание лекарственных субстанций по спектру на 600 МГц в ДМСО-d6 легко определять сравнением интегральных интенсивностей сигнала трех протонов CH3-группы IV при 2,27 м.д. и шести протонов двух эквивалентных групп V при 3,72 м.д. с сигналом остаточных протонов молекул растворителя ДМСО-d5 (2,50 м.д.) по приведенной выше формуле. В частности, в навеске массой 52,6 мг (масса таблетки "Бисептола" 666,4 мг) обнаружено сульфаметоксазола 32,2 мг и триметоприма 6,3 мг, что при пересчете на целую таблетку составило содержание сульфаметоксазола и триметоприма (408,7 ± 4,1) и (79,9 ± 0,8) мг соответственно, что согласуется с указанными производителем значениями. Полученные результаты для двух других навесок отличались от представленной не более чем на 2%.
В спектре ЯМР 1Н на частоте 60 МГц в растворителе ДМСО-d6 разрешение некоторых сигналов оказалось существенно хуже из-за близости отдельных групп и мультиплетности. Использование сигнала остаточных протонов молекул ДМСО-d5 для количественного определения субстанций в ЛС оказалось невозможным из-за его перекрывания с сигналом протонов CH3-группы IV при 2,27 м.д. Поэтому выполнена регистрация спектра раствора ЛС в трифторуксусной кислоте с добавкой (CH3)2SO2 около 3,0 м.д в качестве калибровочного пика. С этим сигналом сравнивали нормированные интегральные интенсивности трех протонов CH3-группы IV при 2,27 м.д. и совокупности одиннадцати протонов V в области 3,5–4,0 м.д. (рис.4). Расчет – (401,2 ± 8,0) мг IV и (77,6 ± 2,0) мг V на таблетку – хорошо согласуется как с измерениями для 600 МГц, так и с заявленными значениями.
Обобщенные результаты количественного определения рассмотренных субстанций в ЛС представлены в табл.1.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представлено три примера быстрого скрининга ЛС с использованием спектроскопии ЯМР 1Н на рабочей частоте 60 МГц для идентификации и определения содержания лекарственных субстанций. В первом (офлоксацин, левофлоксацин) характер спектра позволяет полностью его интерпретировать и количественно измерить содержание лекарственных субстанций. Во втором (тетрациклин) усложненная спектральная картина требует для однозначной идентификации строения предварительного анализа спектра 1Н на более высоких частотах. Спектр на 60 МГц используется в формате "отпечатка пальцев" с количественным определением субстанции путем сравнения интенсивностей совокупности выделенных индикаторных и калибровочного сигналов. Для отдельных ЛС, содержащих композицию лекарственных субстанций (сульфаметоксазол + триметоприм), усложнение количественной интерпретации спектра на 60 МГц может быть преодолено сменой растворителя и калибранта.
Представленные результаты демонстрируют возможности спектрометра ЯМР 1Н 60 МГц для быстрой идентификации и измерения в ЛС содержания лекарственных субстанций без применения стандартных образцов. Для верификации результатов при создании валидированных методик, требующих выполнения необходимых тестов, целесообразно привлечение, как стандартных образцов, так и спектроскопии ЯМР в сильных магнитных полях. По экономичности, быстроте и информативности методики на основе спектров ЯМР на рабочей частоте 60 МГц могут заметно превосходить применяемые ныне хроматографические и оптические. Приготовление трех независимых проб, регистрация их спектров и расчет результатов без использования стандартных образцов занимает менее часа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Varcarcel M., Caerdenas S., Gallego M. Sample screening systems in analytical chemistry // Trends in Anal. Chem. 1999. 18 (11). P. 685–694.
2. Danieli E., Mauler J., Perlo J., Blumich B., Casanova F. Mobile sensor for high resolution NMR spectroscopy and imaging // J. Mag. Res. 2009. 198 (1). P. 80–87.
3. Danieli E., Perlo J., Blumich B., Casanova F. Small magnets for portable NMR spectrometers // Angewandte Chemie. 2010. 49 (24). P. 4133–4135.
4. Jacobsen N.E. NMR spectroscopy explained: simplified theory, applications and examples for organic chemistry and structural biology // John Wiley&Sons, New Jersey. 2007.
5. Friebolin H. Basic one – and two-dimentional NMR spectroscopy. 5th edition // Wiley-VCH, Germany. 2011.
6. Berger S., Braun S. 200 and more NMR experiments. A practical course // Wiley-VCH, Germany. 2004.
7. Dalitz F., Cudaj M., Maiwald M., Guthausen G. Process and reaction monitoring by low-field NMR spectroscopy // Prog. Nuc. Mag. Res. Spec. 2012. 60. P. 52–70.
8. Edwards J.C., Giammatteo P.J. Progress NMR spectroscopy: technology and on-line applications. Chapter 10 in process analytical technology: spectroscopic tools and Implementation strategies for the chemical and pharmaceutical industries, 2nd ed. // Blackwell-Wiley. 2010.
9. Edwards J.C. A review of applications of NMR spectroscopy in petroleum chemistry. Chapter 16 in monograph 9 on spectroscopic analysis of petroleum products and lubricants // ASTM Books. 2011.
10. Gonilleux B., Cherrie B. Ultrafast 2D NMR on a benchtop spectrometer: application and perspectives // Trends in Anal. Chem. 2016. 83. P. 65–75.
11. Pages G., Gerdova A., Williamson D., Gilard V., Martino R., Malet-Martino M. Evaluation of a benchtop cryogen-free low-field 1H NMR spectrometer for the analysis of sexual enhancement and weight loss dietary supplements adulterated with pharmaceutical substances // Anal. Chem. 2014. 86. P. 11897–11904.
12. Parker T., Limer E., Watson A.D., Defernez M., Williamson D., Kamsley E.K. 60 MHz 1H NMR spectroscopy for the analysis of edible oils // Trends in Anal. Chem. 2014. 57. P. 147–158.
13. Калабин Г., Васильев В., Чернецова Е., Прокопьев А., Абрамович Р., Ивлев В., Митео И. Экспертиза качества лекарственных средств без стандартных образцов // АНАЛИТИКА. 2017. № 2. С. 106–112.
14. Кудякова В., Чазов А. Полноценный ЯМР-анализ на лабораторном столе: ЯМР-спектрометры Spinsolve компании Magritek // АНАЛИТИКА. 2017. № 2. С. 80–83.
15. Salem A.A., Mossa H.A., Barsoum B.N. Quantitative determination of levofloxacin and rifampicin in pharmaceutical and urine samples using nuclear magnetic resonance spectroscopy // Spectrochimica Acta Part A. 2005. 62. P. 466–472.
16. Salem A.A., Mossa H.A. Method validation and determinations of levofloxacin, metronidazole and sulfamethoxazole in an aqueous pharmaceutical, urine and blood plasma samples using quantitative nuclear magnetic resonance spectrometry // Talanta. 2012. 88. P. 104–114.
17. Othersen O.G., Waibel R., Lanig H., Gmeiner P. and Clark T. SCRF-DFT and NMR comparison of tetracycline and 5a,6-anhydrotetracycline in solution // J. Phys. Chem. B. 2006. 110. P. 24766–24774.
18. Casy A.F., Yasin A. Stereochemical studies of tetracicline antibiotics and their common impurities by 400 MHz 1H NMR spectroscopy // Mag. Res.in Chem. 1985. 23 (9). P. 767–770.
[1] Высокопольными принято называть спектрометры ЯМР, в которых источниками магнитного поля служат сверхпроводящие магниты с криогенным охлаждением.
Отзывы читателей
