eng
Выпуск #1/2018
Е.В.Орлова В.С.Орлова, А.И.Марахова, Я.М.Станишевский
Комплексный нуклеотидный препарат из дрожжей saccharomyces cerevisiae – активатор CA2+-зависимой NO-синтазы
Комплексный нуклеотидный препарат из дрожжей saccharomyces cerevisiae – активатор CA2+-зависимой NO-синтазы
Просмотры: 2182
Получен комплексный нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14. Определены оптимальные условия для выделения продуктов аутоферментативного гидролиза нуклеиновых кислот. Проанализирован состав биологически активных веществ препарата и выявлено содержание адениновых нуклеотидов, а также других биологически активных веществ. Проведена оценка активирующего действия нуклеотидного препарата на Са2+-зависимую NO-синтазу по сравнению с Т-активином.
УДК:615.339; ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2018.38.1.64.68
УДК:615.339; ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2018.38.1.64.68
Теги: amino acids biologically active substances fatty acids vitamins биологически активные вещества витамины жирные кисоты нуклеиновые кислоты
Получен комплексный нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14. Определены оптимальные условия для выделения продуктов аутоферментативного гидролиза нуклеиновых кислот. Проанализирован состав биологически активных веществ препарата и выявлено содержание адениновых нуклеотидов, а также других биологически активных веществ: аминокислот, витаминов, микро- и макроэлементов, жирных кислот, в том числе полиненасыщенных. Проведена оценка активирующего действия нуклеотидного препарата на Са2+-зависимую NO-синтазу по сравнению с Т-активином. Приведена схема автоматизированной установки для получения субстанции.
Известно, что Ca2+-зависимая NO-синтаза является одним из ключевых ферментов антиоксидантной защиты организма [1]. Снижение ее активности сопровождает возникновение и развитие таких заболеваний, как диабет, атеросклероз, инфаркт миокарда, сердечная недостаточность [2, 3]. В этой связи особую актуальность приобретает поиск активаторов Ca2+-зависимой NO-синтазы (NOS). Среди них наиболее перспективны для использования в качестве лекарственных средств производные адениннуклеотидов, полученные из различных биологических объектов, в частности из дрожжей Saccharomyces cerevisiae [4].
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для получения нуклеотидного препарата использованы пять штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, которые выращивали на питательной среде следующего состава:
• макроэлементы, г/л:
KH2PO4 – 1,0;
K2HPO4 – 0,13;
MgSO4·7H2O – 0,7;
NaCl – 0,1;
(NH4)2SO4 – 3,5;
• микроэлементы, мг/л:
ZnSO4 ·6H2O – 0,18;
CuSO4·5H2O – 0,15;
MnSO4·5H2O – 0,15;
CoCl2 – 0,18;
• витамины, мг/л: тиамин – 0,4; биотин – 0,1;
• источник углеродного питания глюкоза – 10,0 г/л.
Активность Са2+-зависимой NOS в тимоцитах крыс Wistar определяли по методу [5] с некоторыми модификациями. В основу положено измерение активности NOS по конечному продукту NO, который после перевода в NO2– количественно определяется с помощью реактива Грисса. Реактив Грисса готовили из сульфаниловой кислоты и α-нафтилэтиламина, взятых в соотношении 1 : 1 (по массе) с последующим растворением 10 г смеси в 90 мл 12%-ной уксусной кислоты.
К 800 мкл полученного супернатанта (тимоцитов) добавляли в строго определенном порядке: сначала 100 мкл 20 мМ K2-фосфатного буфера рН = 7,4; затем – 50 мкл L-аргинина и в конце – 50 мкл 5,4 · 10–4 М NADPH (Sigma, США). NADPH “запускает” ферментную реакцию, поэтому нарушение последовательности внесения в смесь реактивов может приводить к заниженным результатам [5]. Кинетические параметры ферментативных реакций рассчитывали по уравнению Михаэлиса – Ментен с использованием пакета программ SPLab4. Определяли значение кажущейся константы Михаэлиса (Kmapp) и удельную скорость (vуд) NOS-катализируемой реакции [6].
Подготовленную реакционную смесь инкубировали на водяной бане с вибрацией при температуре 37 °C в течение 10 мин, после чего реакцию останавливали добавлением 300 мкл реактива Грисса (Sigma). Пробы извлекали из водяной бани и оставляли при комнатной температуре (20 °C) на 30 мин для максимального развития окраски [6].
Концентрацию NO2– определяли на спектрофотометре Beckman DU-65 (США) при длине волны 548 нм по интенсивности окраски фиолетово-красного азокомплекса, образовавшегося в результате реакции между сульфаниловой кислотой, NO2– и α-нафтилэтиламином. Чувствительность метода – 10–7 М NO2–.
Состав и содержание аминокислот в препарате измеряли на аминокислотном анализаторе Varian (США).
Микро- и макроэлементы определяли методом атомно-адсорбционной спектроскопии, используя спектрометр фирмы Varian (США).
Витамины, нуклеиновые кислоты и углеводы определяли с помощью жидкостного хроматографа компании Waters (США). Колонки Symmetry C18 (Waters) использовали для анализа водорастворимых витаминов (В1 – тиамин, В2 – рибофлавин, В3 – ниацин, витамин PP, В4 – холин, В5 – пантотеновая кислота, В6 – пиридоксин, В9 – фолиевая кислота, Н – биотин) и углеводов. Колонки Nucleosil C18 производства Macherey-Nagel (Германия) применяли для определения содержания жирорастворимых витаминов E (токоферол) и K (филлохинон, пренилменахинон). Жирные кислоты измеряли на обращенно-фазовой колонке C-8 (Shimadzu, Япония). Для анализа нуклеиновых кислот применяли DEAE–анионообменную колонку Nucleogen 4000-7 (Macherey-Nagel) [8].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Высокая устойчивость рибонуклеаз к воздействию денатурирующих факторов, в том числе и сильно кислой среды [8], была положена в основу разработанного нами метода денуклеинизации биомассы дрожжей [4]. Биомассу дрожжей использовали в стационарной фазе роста, когда происходило максимальное образование нуклеиновых кислот (НК) [7, 10]. Условия выбраны экспериментальным путем, контроль роста биомассы проводили микроскопически при помощи инвертированного микроскопа с камерой Nicon. На рис.1а приведена микрофотография дрожжевых колоний в конце первых суток культивирования (фото в отраженном свете). На третий день после начала выращивания прирост дрожжевых клеток достигает оптимального значения при большом числе делящихся колоний (рис.1б – фото в поляризованном свете).
Дрожжевую биомассу с концентрацией 40 г/л (по влажному весу) и рН = 6,8–7,0 при постоянном перемешивании нагревали при 90 °С в течение 20 мин. На этой стадии происходила денатурация протеолитических ферментов и рибосом, в то время как эндогенные нуклеазы сохраняли свою активность и в дальнейшем участвовали в процессе расщепления НК. Это подтверждается материалами опубликованных работ [7, 9, 10]. Затем нагревание прекращали и суспензию дрожжевой биомассы выдерживали 3 ч при 34 °С, постоянно перемешивая. На этой стадии эндогенные нуклеазы дрожжевых клеток деполимеризировали большую часть НК до олигонуклеотидов. По окончании этого времени рН среды доводили до 1,0 с помощью 1Н HCl и одновременно прогревали суспензию до 80–85 °С в течение часа. Это позволяло сделать оболочки дрожжевых клеток проницаемыми для деполимеризованных НК и других веществ, входящих в клеточный пул: витаминов, свободных внутриклеточных аминокислот, микро- и макроэлементов, углеводов и жирных кислот, кроме белков. Стадия выделения продуктов аутоферментативного гидролиза НК должна происходить при соблюдении рН 1,0–1,5 и температурного режима 80–85 °С. Об этом свидетельствуют экспериментальные данные, представленные на рис.2. Наименьшее количество нуклеиновых кислот в биомассе зафиксировано при температуре 80–90 °С (рис.2а). При рН = 1,0 через час выделяется наибольшее количество нуклеиновых кислот, а в биомассе их остаток минимален (рис.2б).
После завершения процесса денуклеинизации добавляли 20–40% NaOH для доведения рН среды до 6,0–7,0; центрифугировали при 3 000 об/мин 10 мин и получали целевой продукт – комплексный нуклеотидный препарат. О полноте денуклеинизации судили по снижению НК в биомассе и наличии аденинового пула в центрифугате. Это подтверждали аналитически по спектрам поглощения образцов центрифугата, в качестве стандарта использовали аденин (Sigma). На рис.3 представлен типичный спектр поглощения адениновой компоненты в образце препарата. Абсорбционный спектр характеризуется максимумом поглощения при длине волны 257 нм и минимумом при 230 нм. Это позволяет принять 257 нм за аналитическую длину волны.
Оценку влияния полученного образца нуклеотидного препарата на способность активировать Са2+-зависимую NOS в сравнении с иммуностимулятором Т-активином проводили на тимоцитах крыс Wistar. При этом Т-активин применяли в эффективных терапевтических дозах, а тестируемые образцы нуклеотидного препарата – в сравнимых с рекомендуемыми для нуклеината натрия количествах [10]. Эксперименты показали, что нуклеотидный препарат при трехкратном внутрибрюшинном введении дозы 10 мг/кг оказывает выраженное активирующее действие на Са2+-зависимую NOS из тимоцитов крыс (табл.1).
По степени активирующего действия нуклеотидный препарат превосходит Т-активин, о чем свидетельствует уменьшение Kmapp для препарата в 2,7 раза по сравнению с Kmapp реакции Т-активина с Са2+-зависимой NOS. Скорость NOS-катализируемой реакции выше у нуклеотидного препарата по сравнению с Т-активином (см. табл.1), то есть в рекомендованной дозе 10 мг/кг он является более сильным активатором Са2+-зависимой NOS.
В полученном нуклеотидном препарате определены некоторые биологически активные вещества: адениновые нуклеотиды, аминокислоты, витамины, микро- и макроэлементы (табл.2).
Успешные исследования по выделению нуклеотидного препарата, содержащего комплекс биологически активных веществ, а также доказательства его положительного влияния на иммунную систему, обусловили актуальность создания автоматизированного промышленного комплекса для выделения субстанции. Конструкция установки (рис.4) предполагает наличие ферментера (1) для выращивания культуры клеток, снабженного насосом (2), который соединен с центрифужным сепаратором (3) для отделения дрожжевых клеток. После сепарации дрожжевые клетки с помощью клапана (4) попадают в резервуар, который имеет открывающееся дно (7) и предфильтр (10). Резервуар снабжен паровой рубашкой (9) для нагрева до нужной температуры, а также мешалкой (8). С помощью насоса через входной патрубок в резервуар подается раствор НCl (6). После проведения описанных выше процедур полупродукт сливается через выходной патрубок (11), после чего центрифугируется. Далее центрифугат подвергают лиофильной сушке. В настоящий момент проходит этап конструирования промышленного образца установки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Получен комплексный нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, определено содержание адениновых нуклеотидов, а также других биологически активных веществ – аминокислот, витаминов, микро- и макроэлементов. Выявлено, что оптимальными условиями для выделения продуктов аутоферментативного гидролиза нуклеиновых кислот является рН 1,0–1,5 и температурный режим 80–85 °С.
Нуклеотидный препарат не содержит в своем составе компонентов, не соответствующих обмену веществ человека и животных. Полученная субстанция оказывает активирующее действие на Са2+-зависимую NO-синтазу, играющую важную роль в функционировании системы иммунитета и в процессах оксидативного стресса.
***
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ по Программе реализации комплексных проектов по созданию высокотехнологичного производства (Постановление Правительства РФ № 218 oт 09.04.2010 г., шифр конкурса 2016-218-09). Договор
№ 03.G25.310258.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Vallance P., Leone A., Calver A., Collier J., Moncada S. Accumulation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in chronic renal failure . – Lancet., 1992. P. 235–240.
2. Catravas John D., Callow Allan D., Ryan Una S. Vascular Endothelium: Physiological Basis of Clinical Problems II. (NATO ASI Series A: Life Sciences Vol. 257). 1994. 230 p.
3. Chade A.R., Rodriguez-Porcel M., Herrmann J., Zhu X.,
Grande J.P., Napoli C., Lerman A., Lerman L.O. Antioxidant intervention blunts renal injury in experimental renovascular disease // J. Am. Soc. Nephrol. 2004. 15(4). P. 958–966.
4. Способ получения биомассы микроорганизмов с низким содержанием нуклеиновых кислот: пат. 2128218 РФ: МПК: C12N / Орлова В.С. [и др.]; заявители и патентообладатели: Орлова В.С., Орлова Е.В., Уваров Л. А., Евстигнеев А.А.; заявл. 31.08.1994; опубл. 27.03.1999. 5 с.
5. Hwang S., Lopez C.A., Heck D.E., Gardner C.R., Laskin J.D. Osteopontin inhibits induction of nitric oxide synthase gene expression by Inflammatory mediators in mouse kidney epithelial cells // J. of Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 711–715.
6. Bobadoe M.F., Bamisi O.O., Enujiugha V.N. Hypolipidemic and antioxidative effects of african star apple juice (chrysophylum albidum) on rats fed on diets high in cholesterol and oil // Food and Nutrition Sciences. 2016. V. 7. P. 825–843.
7. Орлова Е.В. Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae //
дисс… докт. биол. наук. – М., 2007. 233 с.
8. Nishiyama-Naruke A., Souza J.A., Carnelуs M., Curi R., A. HPLC determination of underivatized fatty acids saponified at 37 °C analysis of fatty acids in oils and tissues // Analytical letters. 1998. V. 31. № 14. P. 2565–2576.
9. Birkenmeier G.F., Ryan C.A. Wound signaling in tomato plants. Evidence that ABA Is not a primary signal for defense gene activation // Plant Physiol. 1998. 117(2). P. 687–693.
10. Farron-Furstenthal F. An inhibitor protein of nuclear protein kinases // Nature (Lond.). 1979. 280. P. 415–417.
11. Машковский М.Д. Лекарственные средства : в 2-х т.: Пособие для врачей / 13-е изд. – Харьков: Торсинг, 1997. 560 с.
Известно, что Ca2+-зависимая NO-синтаза является одним из ключевых ферментов антиоксидантной защиты организма [1]. Снижение ее активности сопровождает возникновение и развитие таких заболеваний, как диабет, атеросклероз, инфаркт миокарда, сердечная недостаточность [2, 3]. В этой связи особую актуальность приобретает поиск активаторов Ca2+-зависимой NO-синтазы (NOS). Среди них наиболее перспективны для использования в качестве лекарственных средств производные адениннуклеотидов, полученные из различных биологических объектов, в частности из дрожжей Saccharomyces cerevisiae [4].
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для получения нуклеотидного препарата использованы пять штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, которые выращивали на питательной среде следующего состава:
• макроэлементы, г/л:
KH2PO4 – 1,0;
K2HPO4 – 0,13;
MgSO4·7H2O – 0,7;
NaCl – 0,1;
(NH4)2SO4 – 3,5;
• микроэлементы, мг/л:
ZnSO4 ·6H2O – 0,18;
CuSO4·5H2O – 0,15;
MnSO4·5H2O – 0,15;
CoCl2 – 0,18;
• витамины, мг/л: тиамин – 0,4; биотин – 0,1;
• источник углеродного питания глюкоза – 10,0 г/л.
Активность Са2+-зависимой NOS в тимоцитах крыс Wistar определяли по методу [5] с некоторыми модификациями. В основу положено измерение активности NOS по конечному продукту NO, который после перевода в NO2– количественно определяется с помощью реактива Грисса. Реактив Грисса готовили из сульфаниловой кислоты и α-нафтилэтиламина, взятых в соотношении 1 : 1 (по массе) с последующим растворением 10 г смеси в 90 мл 12%-ной уксусной кислоты.
К 800 мкл полученного супернатанта (тимоцитов) добавляли в строго определенном порядке: сначала 100 мкл 20 мМ K2-фосфатного буфера рН = 7,4; затем – 50 мкл L-аргинина и в конце – 50 мкл 5,4 · 10–4 М NADPH (Sigma, США). NADPH “запускает” ферментную реакцию, поэтому нарушение последовательности внесения в смесь реактивов может приводить к заниженным результатам [5]. Кинетические параметры ферментативных реакций рассчитывали по уравнению Михаэлиса – Ментен с использованием пакета программ SPLab4. Определяли значение кажущейся константы Михаэлиса (Kmapp) и удельную скорость (vуд) NOS-катализируемой реакции [6].
Подготовленную реакционную смесь инкубировали на водяной бане с вибрацией при температуре 37 °C в течение 10 мин, после чего реакцию останавливали добавлением 300 мкл реактива Грисса (Sigma). Пробы извлекали из водяной бани и оставляли при комнатной температуре (20 °C) на 30 мин для максимального развития окраски [6].
Концентрацию NO2– определяли на спектрофотометре Beckman DU-65 (США) при длине волны 548 нм по интенсивности окраски фиолетово-красного азокомплекса, образовавшегося в результате реакции между сульфаниловой кислотой, NO2– и α-нафтилэтиламином. Чувствительность метода – 10–7 М NO2–.
Состав и содержание аминокислот в препарате измеряли на аминокислотном анализаторе Varian (США).
Микро- и макроэлементы определяли методом атомно-адсорбционной спектроскопии, используя спектрометр фирмы Varian (США).
Витамины, нуклеиновые кислоты и углеводы определяли с помощью жидкостного хроматографа компании Waters (США). Колонки Symmetry C18 (Waters) использовали для анализа водорастворимых витаминов (В1 – тиамин, В2 – рибофлавин, В3 – ниацин, витамин PP, В4 – холин, В5 – пантотеновая кислота, В6 – пиридоксин, В9 – фолиевая кислота, Н – биотин) и углеводов. Колонки Nucleosil C18 производства Macherey-Nagel (Германия) применяли для определения содержания жирорастворимых витаминов E (токоферол) и K (филлохинон, пренилменахинон). Жирные кислоты измеряли на обращенно-фазовой колонке C-8 (Shimadzu, Япония). Для анализа нуклеиновых кислот применяли DEAE–анионообменную колонку Nucleogen 4000-7 (Macherey-Nagel) [8].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Высокая устойчивость рибонуклеаз к воздействию денатурирующих факторов, в том числе и сильно кислой среды [8], была положена в основу разработанного нами метода денуклеинизации биомассы дрожжей [4]. Биомассу дрожжей использовали в стационарной фазе роста, когда происходило максимальное образование нуклеиновых кислот (НК) [7, 10]. Условия выбраны экспериментальным путем, контроль роста биомассы проводили микроскопически при помощи инвертированного микроскопа с камерой Nicon. На рис.1а приведена микрофотография дрожжевых колоний в конце первых суток культивирования (фото в отраженном свете). На третий день после начала выращивания прирост дрожжевых клеток достигает оптимального значения при большом числе делящихся колоний (рис.1б – фото в поляризованном свете).
Дрожжевую биомассу с концентрацией 40 г/л (по влажному весу) и рН = 6,8–7,0 при постоянном перемешивании нагревали при 90 °С в течение 20 мин. На этой стадии происходила денатурация протеолитических ферментов и рибосом, в то время как эндогенные нуклеазы сохраняли свою активность и в дальнейшем участвовали в процессе расщепления НК. Это подтверждается материалами опубликованных работ [7, 9, 10]. Затем нагревание прекращали и суспензию дрожжевой биомассы выдерживали 3 ч при 34 °С, постоянно перемешивая. На этой стадии эндогенные нуклеазы дрожжевых клеток деполимеризировали большую часть НК до олигонуклеотидов. По окончании этого времени рН среды доводили до 1,0 с помощью 1Н HCl и одновременно прогревали суспензию до 80–85 °С в течение часа. Это позволяло сделать оболочки дрожжевых клеток проницаемыми для деполимеризованных НК и других веществ, входящих в клеточный пул: витаминов, свободных внутриклеточных аминокислот, микро- и макроэлементов, углеводов и жирных кислот, кроме белков. Стадия выделения продуктов аутоферментативного гидролиза НК должна происходить при соблюдении рН 1,0–1,5 и температурного режима 80–85 °С. Об этом свидетельствуют экспериментальные данные, представленные на рис.2. Наименьшее количество нуклеиновых кислот в биомассе зафиксировано при температуре 80–90 °С (рис.2а). При рН = 1,0 через час выделяется наибольшее количество нуклеиновых кислот, а в биомассе их остаток минимален (рис.2б).
После завершения процесса денуклеинизации добавляли 20–40% NaOH для доведения рН среды до 6,0–7,0; центрифугировали при 3 000 об/мин 10 мин и получали целевой продукт – комплексный нуклеотидный препарат. О полноте денуклеинизации судили по снижению НК в биомассе и наличии аденинового пула в центрифугате. Это подтверждали аналитически по спектрам поглощения образцов центрифугата, в качестве стандарта использовали аденин (Sigma). На рис.3 представлен типичный спектр поглощения адениновой компоненты в образце препарата. Абсорбционный спектр характеризуется максимумом поглощения при длине волны 257 нм и минимумом при 230 нм. Это позволяет принять 257 нм за аналитическую длину волны.
Оценку влияния полученного образца нуклеотидного препарата на способность активировать Са2+-зависимую NOS в сравнении с иммуностимулятором Т-активином проводили на тимоцитах крыс Wistar. При этом Т-активин применяли в эффективных терапевтических дозах, а тестируемые образцы нуклеотидного препарата – в сравнимых с рекомендуемыми для нуклеината натрия количествах [10]. Эксперименты показали, что нуклеотидный препарат при трехкратном внутрибрюшинном введении дозы 10 мг/кг оказывает выраженное активирующее действие на Са2+-зависимую NOS из тимоцитов крыс (табл.1).
По степени активирующего действия нуклеотидный препарат превосходит Т-активин, о чем свидетельствует уменьшение Kmapp для препарата в 2,7 раза по сравнению с Kmapp реакции Т-активина с Са2+-зависимой NOS. Скорость NOS-катализируемой реакции выше у нуклеотидного препарата по сравнению с Т-активином (см. табл.1), то есть в рекомендованной дозе 10 мг/кг он является более сильным активатором Са2+-зависимой NOS.
В полученном нуклеотидном препарате определены некоторые биологически активные вещества: адениновые нуклеотиды, аминокислоты, витамины, микро- и макроэлементы (табл.2).
Успешные исследования по выделению нуклеотидного препарата, содержащего комплекс биологически активных веществ, а также доказательства его положительного влияния на иммунную систему, обусловили актуальность создания автоматизированного промышленного комплекса для выделения субстанции. Конструкция установки (рис.4) предполагает наличие ферментера (1) для выращивания культуры клеток, снабженного насосом (2), который соединен с центрифужным сепаратором (3) для отделения дрожжевых клеток. После сепарации дрожжевые клетки с помощью клапана (4) попадают в резервуар, который имеет открывающееся дно (7) и предфильтр (10). Резервуар снабжен паровой рубашкой (9) для нагрева до нужной температуры, а также мешалкой (8). С помощью насоса через входной патрубок в резервуар подается раствор НCl (6). После проведения описанных выше процедур полупродукт сливается через выходной патрубок (11), после чего центрифугируется. Далее центрифугат подвергают лиофильной сушке. В настоящий момент проходит этап конструирования промышленного образца установки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Получен комплексный нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, определено содержание адениновых нуклеотидов, а также других биологически активных веществ – аминокислот, витаминов, микро- и макроэлементов. Выявлено, что оптимальными условиями для выделения продуктов аутоферментативного гидролиза нуклеиновых кислот является рН 1,0–1,5 и температурный режим 80–85 °С.
Нуклеотидный препарат не содержит в своем составе компонентов, не соответствующих обмену веществ человека и животных. Полученная субстанция оказывает активирующее действие на Са2+-зависимую NO-синтазу, играющую важную роль в функционировании системы иммунитета и в процессах оксидативного стресса.
***
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ по Программе реализации комплексных проектов по созданию высокотехнологичного производства (Постановление Правительства РФ № 218 oт 09.04.2010 г., шифр конкурса 2016-218-09). Договор
№ 03.G25.310258.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Vallance P., Leone A., Calver A., Collier J., Moncada S. Accumulation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in chronic renal failure . – Lancet., 1992. P. 235–240.
2. Catravas John D., Callow Allan D., Ryan Una S. Vascular Endothelium: Physiological Basis of Clinical Problems II. (NATO ASI Series A: Life Sciences Vol. 257). 1994. 230 p.
3. Chade A.R., Rodriguez-Porcel M., Herrmann J., Zhu X.,
Grande J.P., Napoli C., Lerman A., Lerman L.O. Antioxidant intervention blunts renal injury in experimental renovascular disease // J. Am. Soc. Nephrol. 2004. 15(4). P. 958–966.
4. Способ получения биомассы микроорганизмов с низким содержанием нуклеиновых кислот: пат. 2128218 РФ: МПК: C12N / Орлова В.С. [и др.]; заявители и патентообладатели: Орлова В.С., Орлова Е.В., Уваров Л. А., Евстигнеев А.А.; заявл. 31.08.1994; опубл. 27.03.1999. 5 с.
5. Hwang S., Lopez C.A., Heck D.E., Gardner C.R., Laskin J.D. Osteopontin inhibits induction of nitric oxide synthase gene expression by Inflammatory mediators in mouse kidney epithelial cells // J. of Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 711–715.
6. Bobadoe M.F., Bamisi O.O., Enujiugha V.N. Hypolipidemic and antioxidative effects of african star apple juice (chrysophylum albidum) on rats fed on diets high in cholesterol and oil // Food and Nutrition Sciences. 2016. V. 7. P. 825–843.
7. Орлова Е.В. Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae //
дисс… докт. биол. наук. – М., 2007. 233 с.
8. Nishiyama-Naruke A., Souza J.A., Carnelуs M., Curi R., A. HPLC determination of underivatized fatty acids saponified at 37 °C analysis of fatty acids in oils and tissues // Analytical letters. 1998. V. 31. № 14. P. 2565–2576.
9. Birkenmeier G.F., Ryan C.A. Wound signaling in tomato plants. Evidence that ABA Is not a primary signal for defense gene activation // Plant Physiol. 1998. 117(2). P. 687–693.
10. Farron-Furstenthal F. An inhibitor protein of nuclear protein kinases // Nature (Lond.). 1979. 280. P. 415–417.
11. Машковский М.Д. Лекарственные средства : в 2-х т.: Пособие для врачей / 13-е изд. – Харьков: Торсинг, 1997. 560 с.
Отзывы читателей
