eng
Выпуск #1/2018
Е.В.Сергунова, А.И.Марахова
Изучение качественного и количественного состава биологически активных веществ в плодах малины различных способов консервации
Изучение качественного и количественного состава биологически активных веществ в плодах малины различных способов консервации
Просмотры: 2672
Проведен сравнительный анализ влияния способа консервации на сохранение качества плодов малины обыкновенной, включая содержание биологически активных веществ: флавоноидов, антоцианов, полисахаридов, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ и органических кислот. Исследования проводили различными методами, в том числе ТСХ, кулонометрическим, спектрофотометрическим, гравиметрическим, перманганатометрическим титрованием и др.
УДК 615.322, 615.074; ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2018.38.1.70.76
УДК 615.322, 615.074; ВАК 02.00.02
DOI: 10.22184/2227-572X.2018.38.1.70.76
Теги: biologically active substances comparative analysis conservation биологически активные вещества консервация сравнительный анализ
Изучали влияние замораживания и высушивания на содержание биологически активных веществ (БАВ) в плодах малины обыкновенной: флавоноидов, антоцианов, полисахаридов, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ и органических кислот. Качественный анализ проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для количественного анализа органических кислот применяли кулонометрический способ. Дубильные вещества определяли перманганатометрическим титрованием. Содержание антоцианов устанавливали спектрофотометрически, полисахаридов – методом гравиметрии. Проведен сравнительный анализ влияния способа консервации на сохранение качества плодов малины обыкновенной.
ВВЕДЕНИЕ
Использование биологически активных веществ растений в их природной композиции обеспечивает широкий спектр фармацевтического воздействия, необходимый для лечения органов и систем организма человека.
Для получения водных извлечений (настоев и отваров), настоек, экстрактов, таблетированных форм лекарственное растительное сырье (ЛРС) чаще всего используют в высушенном виде. Непосредственно после сбора ЛРС перерабатывают для производства сока и экстракционных препаратов. Свежесобранное ЛРС содержит комплекс действующих веществ, входящих в состав растений в естественном состоянии, которые еще не подверглись гидролитическому разложению и воздействию ферментов.
В аллопатической практике свежее растительное сырье широкого применения не нашло [1, 2], главным образом из-за невозможности долгого хранения и необходимости его быстрой переработки практически сразу после сбора.
Проблема консервации свежего ЛРС достаточно актуальна как для аллопатии, так и для гомеопатии. Действующие вещества многих лекарственных растений (ЛР) во время сушки и последующего хранения подвергаются превращениям вследствие ферментативных процессов, действия света и кислорода воздуха. Методом консервации ЛРС может служить замораживание, обеспечивающее полное или частичное превращение клеточного сока в лед [3].
Плоды – одна из морфологических групп ЛРС, которая достаточно широко используется в медицине. В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации ХIII изд., ОФС.1.5.1.0007.15 "Плоды"[1], официально разрешено применение плодов как в высушенном, так и в свежем виде. Наиболее богатый состав БАВ имеют свежие плоды, в том числе малины обыкновенной. Однако в связи с большим содержанием влаги хранить сочные плоды в свежем виде затруднительно. Согласно инструкции по заготовке срок хранения свежего сырья составляет не более трех суток. Сегодня замораживание является наиболее оптимальным способом консервации для сочных плодов. Его широко применяют в пищевой промышленности [4, 5], но почти не используют в фармации, поэтому исследования влияния низких температур на качество ЛРС весьма актуальны.
ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель работы состояла в проведении комплексных исследований влияния способов консервации на состав и содержание отдельных групп БАВ в плодах малины обыкновенной и полученных из них водных и водно-спиртовых извлечений.
Объектами исследования служили образцы свежих, замороженных и высушенных плодов малины обыкновенной (Rubus idaeus L.), собранные на территории Ботанического сада Первого МГМУ им. И.М.Сеченова и Московской области (Истринский, Щелковский, Дмитровский районы).
Сушку исследуемых образцов проводили в сушильном шкафу при температуре 60–80 °С согласно инструкции по заготовке и сушке ЛРС. Готовое сырье помещали в бумажные пакеты и хранили в соответствии с требованиями общей фармакопейной статьи ОФС.1.1.0011.15 ГФ XIII изд., т. 1 "Хранение лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов" в сухом, чистом, хорошо вентилируемом помещении.
Образцы сырья замораживали согласно ГОСТ Р 53956-2010. "Фрукты быстрозамороженные". Плоды упаковывали в полиэтиленовые пакеты и хранили в морозильной камере при температуре –18 °С. Все исследования проводили с сырьем, которое размораживали в соответствии с указанным ГОСТ в бытовом холодильнике при температуре 6–8 °С в течение 2,5 ч.
Отвары из плодов изучаемых объектов изготавливали согласно общей фармакопейной статье ОФС.1.4.1.0018.15 ГФ XIII изд., т. 2 "Настои и отвары".
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Качественное определение БАВ в плодах малины различных способов консервации
Качественное обнаружение кислоты аскорбиновой проводили методом ТСХ. Готовили водные извлечения из плодов: 1,0 г измельченного сырья (гомогенизированная взвесь из замороженных или свежих плодов) заливали экстрагентом (вода) в соотношении 1 : 10 и настаивали при комнатной температуре в течение 1–2 ч, затем их фильтровали и подвергали анализу.
В ходе ТСХ-анализа проведена работа по выбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющих разделить и идентифицировать БАВ в свежих, замороженных и высушенных плодах. Хроматографическое разделение проводили на пластинках "Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ" размером 10 Ч 15 см. Насыщали хроматографическую камеру парами растворителя в течение часа.
Для обнаружения аскорбиновой кислоты использовали систему растворителей этилацетат – ледяная уксусная кислота (80 : 20). Детектирование проводили раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Аскорбиновая кислота проявлялась в виде белых пятен на розовом фоне с фактором удерживания Rf около 0,62 на уровне пятна-свидетеля аскорбиновой кислоты. Зоны адсорбции аскорбиновой кислоты присутствовали во всех извлечениях (рис.1).
Органические кислоты – широко распространенная группа БАВ в растительном сырье, а в плодах она доминирует. Качественный анализ органических кислот в исследуемых образцах проводили методом ТСХ [10]. В качестве неподвижной фазы использовали пластинки "Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ" размером 10 Ч 15 см, а подвижной фазы – систему органических растворителей спирт этиловый 95% – аммиак концентрированный (16 : 4,5). Насыщение камеры парами подвижной фазы осуществляли не менее часа.
На линию старта пластинки с помощью микрошприца наносили по 10 мкл водных извлечений из свежих, замороженных и высушенных плодов малины обыкновенной. В качестве стандартных образцов (свидетелей) использовали водные растворы яблочной, лимонной, щавелевой, янтарной и сорбиновой кислот в концентрации 2 мг/мл. Пластинки с нанесенными пробами сушили на воздухе в течение 10 мин, помещали в камеру со смесью вышеуказанных растворителей и хроматографировали восходящим способом. Время хроматографирования определялось прохождением системой растворителей фронта – 12 см.
Детектирование хроматограммы проводили после опрыскивания пластинки 0,4%-ным спиртовым раствором бромкрезолового зеленого и последующего нагревания в сушильном шкафу при 105 °С в течение 5 мин. Зоны адсорбции проявлялись в виде желтых и синих пятен на бледно-голубом фоне (рис.2). Извлечения из плодов малины обыкновенной характеризовались зонами с Rf около 0,10 (лимонная кислота); 0,30 (яблочная кислота); около 0,39 (янтарная кислота). С целью установления природы соединений, проявлявшихся в виде синих зон адсорбции с Rf около 0,47 и 0,65 хроматограммы были обработаны 0,25%-ным раствором нингидрина. После высушивания указанные пятна проявлялись в виде зон красно-малинового цвета, что свидетельствует об их принадлежности к веществам аминокислотного характера.
Отличий в числе зон на хроматограммах свежих, замороженных и высушенных плодов не наблюдали. При этом интенсивность зон яблочной и лимонной кислот на хроматограммах извлечений из высушенных плодов была заметно слабее, чем в замороженном и свежем сырье, что может говорить о различном количественном содержании этих компонентов в образцах.
Изучение компонентного состава фенолкарбоновых кислот проводили с помощью тонкослойной хроматографии. Для ТСХ-анализа были получены спиртовые извлечения из свежих, замороженных и высушенных плодов: 1,0 г измельченного сырья заливали 70%-ным этиловым спиртом в соотношении 1 : 10 и нагревали в течение 30 мин. Полученные извлечения фильтровали и подвергали анализу. В качестве неподвижной фазы использовали пластинки "Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ" размером 10 Ч 15 см. Наилучшее разделение наблюдалось в системе растворителей бутанол – кислота уксусная ледяная – вода (9 : 1 : 0,5).
Известно, что плоды малины обыкновенной обладают богатым составом и высоким содержанием фенолкарбоновых кислот. Эти соединения могут находиться в растительном сырье в свободном или связанном виде – в форме простых и сложных эфиров. Поэтому для идентификации фенолкарбоновых кислот в плодах малины были получены извлечения с проведением предварительного щелочного гидролиза для разрушения связанных форм кислот по следующей методике. 10,0 г измельченных высушенных плодов малины (гомогенизированная взвесь из замороженных или свежих плодов) помещали в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 300 мл, приливали 150 мл 70%-ного этилового спирта и нагревали с обратным холодильником на водяной бане в течение часа. Полученное извлечение охлаждали и фильтровали через двойной слой марли с подложенным тампоном ваты в колбу вместимостью 500 мл. К фильтрату приливали 150 мл 2-молярного раствора гидроксида натрия и выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем содержимое колбы переносили в делительную воронку объемом 500 мл, приливали 150 мл этилацетата и встряхивали в течение 15 мин. После полного расслоения желтый этилацетатный слой собирали в колбу вместимостью 300 мл. Обработку этилацетатом повторяли дважды. Полученное этилацетатное извлечение упаривали под вакуумом на ротационном испарителе до объема 30 мл.
С помощью микрошприца на стартовую линию хроматографической пластинки наносили по 20 мкл полученных этилацетатных извлечений и хроматографировали восходящим способом в системе растворителей толуол – метиловый спирт – кислота уксусная ледяная (90 : 16 : 4). После прохождения фронтом растворителей 12 см пластинку вынимали из камеры, высушивали на воздухе в течение 5 мин и опрыскивали раствором хлорида железа с последующим нагреванием в сушильном шкафу при 105 °С в течение 5 мин. Полученные результаты представлены на рис.3.
На хроматограммах извлечений из свежих и замороженных образцов наблюдалось семь зон адсорбции. Со стандартными образцами идентифицированы галловая (Rf около 0,33), кофейная (Rf около 0,48) и салициловая (Rf около 0,68) кислоты. Отметим, что на хроматограмме извлечения из высушенных плодов малины присутствует дополнительная зона адсорбции с Rf около 0,73 – соединение, которое, возможно, образовалось в результате высушивания сырья.
При изучении состава антоцианов плодов малины различных способов консервации также использовали метод ТСХ. Хроматографическое разделение проводили на пластинках "Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ" размером 10 Ч 15 см. Насыщали хроматографическую камеру парами растворителя в течение часа. Для анализа готовили спиртовые извлечения из плодов: 2,0 г измельченных высушенных плодов (гомогенизированная взвесь из замороженных или свежих плодов) помещали в коническую колбу со шлифом, добавляли 10 мл 95%-ного этилового спирта, содержащего 1% хлороводородной кислоты, закрывали пробкой и перемешивали в течение 30 мин. Извлечения фильтровали через бумажный фильтр и анализировали.
На линию старта пластинки с помощью микрошприца наносили по 20 мкл спиртовых извлечений из свежих, замороженных и высушенных плодов изучаемых объектов и стандартных образцов-свидетелей. Пластинки с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 10 мин, помещали в камеру со смесью растворителей и хроматографировали восходящим способом. Наиболее приемлемой для анализа является система с уксусной кислотой, в которой происходит видимое разделение окрашенных в характерные для антоцианов цвета пятен. Идентификацию антоцианов проводили в системе н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (9 : 1 : 0,5) по величине фактора удерживания Rf. После нагревания пластинки в сушильном шкафу проявились пятна малинового цвета на белом фоне с Rf около 0,37 на уровне пятна стандартного образца цианидин-3,5-дигликозида и зона малинового цвета, идентифицированная как цианидин-3-О-глюкозид (Rf около 0,36) (рис.4). В антоциановом профиле плодов малины обыкновенной присутствуют цианидин-3,5-дигликозид и цианидин-3-О-глюкозид.
Сравнительный качественный анализ свежих, замороженных и высушенных плодов показал, что способ консервации не изменяет химический состав плодов. В замороженном и высушенном сырье сохраняются все группы БАВ, содержащиеся в нативном состоянии в свежем сырье. В плодах малины обыкновенной всех способов консервации обнаружены фенольные соединения: цианидин-3,5-дигликозид, цианидин-3-О-глюкозид, салициловая, кофейная, галловая кислоты; органические кислоты: аскорбиновая, лимонная, яблочная, янтарная.
Влияние способов консервации на количественное содержание БАВ в плодах малины обыкновенной
Для количественной оценки содержания свободных органических кислот в изучаемых плодах выбран метод гальваностатической кулонометрии при постоянной силе тока [9]. Для проведения исследований использовали кулонометр "Эксперт-006" при силе тока 5 мА с встроенным рН-метром. Электрогенерацию гидроксид-ионов осуществляли из насыщенного водного раствора K2SO4, конечную точку титрования определяли рН-метром с помощью лабораторного комбинированного "полумикро"-pH-электрода ЭСК-10614. Реакцию проводили с использованием магнитной мешалки и при постоянной температуре.
Методика. Аналитическую пробу массой 20 г измельченных свежих или замороженных плодов (или 5 г высушенных плодов) помещали в колбу вместимостью 200 мл, приливали 150 мл очищенной воды и выдерживали в течение 2 ч на кипящей водяной бане. Полученное извлечение охлаждали и фильтровали через бумажный складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводили объем очищенной водой до метки и перемешивали. 0,5 мл полученного извлечения вносили в кулонометрическую ячейку, заполненную фоновым электролитом – водным раствором сульфата калия. Титрование проводили гидроксид-ионами, сгенерированными прибором: результат показывал сумму органических кислот в пересчете на яблочную кислоту, содержащуюся в аликвоте извлечения, в микрограммах.
Содержание суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в сырье в процентах (X) рассчитывали по формуле:
%, (*)
где Va – объем извлечения, вводимого в кулонометрическую ячейку, мл;
m – количество органических кислот, полученное при измерении, мкг;
V – общий объем извлечения, мл;
a – масса сырья, г;
W – потеря в массе при высушивании, %.
Полученные результаты (табл.1) показали, что замораживание приводит к незначительному снижению данной группы БАВ в плодах малины обыкновенной – в среднем на 20%, а в процессе сушки – на 30%.
Определение содержания аскорбиновой кислоты также проводили методом кулонометрического титрования [5, 6]. Для проведения исследований использовали кулонометр "Эксперт-006" при силе тока 5 мА со встроенным рH-метром. Проверку эффективности кулонометрического титрования проводили по стандарт-титру "Натрий серноватистокислый 5-водный (Na2S2O3· 5H2O) = 0,1 моль/дм3 (0,1 Н)".
Затраченное на титрование количество электричества на кулонометре "Эксперт-006" рассчитывается по формуле:
Кл,
где m – масса тиосульфата натрия в пробе, найденная кулонометрически, мкг (должно находиться 124,1 мкг). Аскорбиновая кислота взаимодействует с электрогенерированным йодом быстро и в стехиометрических количествах в соотношении 1 : 1.
Методика. Из грубоизмельченной аналитической пробы свежих или замороженных плодов брали навеску массой 20 г (или 5 г высушенных плодов), помещали в фарфоровую ступку, где тщательно растирали со стеклянным порошком (около 5 г), приливали 150 мл очищенной воды и настаивали в течение 10 мин, а затем перемешивали и фильтровали через бумажный складчатый фильтр.
По 0,5 мл извлечения из плодов и стандартного раствора вносили в кулонометрическую ячейку, заполненную электролитом – 0,1-молярным раствором йодистого калия в хлороводородном буферном растворе (рН = 1,2), и титровали электрогенерированным йодом.
Содержание аскорбиновой кислоты в сырье в процентах в пересчете на абсолютно сухое сырье (Х) рассчитывали по формуле (*).
На основании полученных результатов (см. табл.1) можно сделать вывод, что замораживание обеспечивает сохранение до 95% аскорбиновой кислоты от ее исходного содержания в свежем сырье, а сушка значительно снижает. Потери аскорбиновой кислоты при высушивании составляли до 90%. Таким образом, замораживание как способ консервации предпочтительнее для сохранения аскорбиновой кислоты в плодах малины обыкновенной.
Сумму антоцианов в плодах малины определяли в соответствии со ст. 6 ГФ XI изд., в.2 «Цветки василька синего» методом прямой спектрофотометрии. Пересчет вели на цианидин-3,5-диглюкозид, поскольку максимум его спектра поглощения и спектров извлечений из плодов малины (510–520 нм) совпали (рис.5). Полученные данные (табл.1) свидетельствуют о том, что замораживание предпочтительнее для сохранения указанной группы БАВ в плодах малины обыкновенной: остается в среднем 80% антоцианов, тогда как в сухих плодах всего 10%.
Определение содержания дубильных веществ в пересчете на танин в плодах различных способов консервации проводили методом перманганатометрического титрования согласно методике общей статьи ОФС.1.5.3.0008.15 ГФ XIII изд., т. 2 "Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах" [1]. При низких температурах сохраняется бульшее количество дубильных веществ в сырье по сравнению с высушиванием (см. табл.1). Так, потери дубильных веществ при замораживании плодов малины – до 20%, а при высушивании они разрушаются значительно – до 36–55%. По-видимому, при сушке происходит окисление полифенолов, а также образование нерастворимых флобафенов.
Полисахариды обладают широким спектром фармакологического действия, оказывая влияние на различные органы и ткани, а также участвуют в обменных процессах. Изучаемые плоды лекарственных растений характеризуются высоким содержанием сахаров. Состав и структура полисахаридов различна. Поэтому изучение количественного содержания этой группы БАВ в плодах различных способов консервации представляется интересным.
Определение содержания суммы полисахаридов проводили фармакопейным методом гравиметрии в соответствии с методикой, приведенной в ГФ XIII изд., т. 3, ФС 2.5.0032.15 "Листья подорожника большого". Для количественной оценки сахаров этот метод наиболее доступен и прост в исполнении.
Полисахариды оказались наиболее стабильной группой БАВ из всех изученных. Их содержание как в замороженных, так и в высушенных плодах незначительно отличалось от исходного, хотя тенденция к снижению наблюдалась как при воздействии на плоды высоких, так и низких температур. Объяснить это можно гидролитическими процессами, протекающими в растительном сырье при замораживании и высушивании, а также инверсией сахарозы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе проведенных исследований получены данные о влиянии замораживания и высушивания плодов малины обыкновенной на содержание таких групп БАВ, как флавоноиды, антоцианы, полисахариды, аскорбиновая кислота, дубильные вещества и органические кислоты.
Выявлено, что способ консервации не влияет на качественный состав. После замораживания образцов сырья количественное содержание в них БАВ существенно не менялось или наблюдалось незначительное снижение дубильных веществ, органических кислот и антоцианов – в среднем на 20%.
Под действием высоких температур снижается количество органических кислот на 30%; дубильные вещества, аскорбиновая кислота и антоцианы разрушаются в большей степени, их содержание не превышает 50, 90, 90% соответственно. Высушивание снижает содержание полисахаридов и флавоноидов на 20–25%.
Таким образом, сравнительный анализ влияния на содержание БАВ методов консервации показал, что предпочтительным для сохранения качества плодов малины обыкновенной является замораживание.
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственная фармакопея Российской Федерации: в 3-х т. / XIII изд. – М., 2015.
2. https://www.rosminzdrav.ru/ministry/61/11/materialy-po-deyatelnosti-deparatamenta/stranitsa-856/stranitsa-902
3. Биологически активные вещества, входящие в состав лекарственного растительного сырья / И.М.Коренская [и др.]. – Воронеж: Издательско-полиграфический центр ВГУ, 2010. 66 c.
4. Абдуллина С.Г., Петрова И.К., Лира О.А. Гальваностатическая кулонометрия в анализе лекарственных средств : Учебно-методическое пособие для студентов фармацевтического факультета. – Казань: КГМУ, 2011. 62 c.
5. Агапова Н.М., Абдуллина С.Г., Хазиев Р.Ш. Кулонометрическое определение содержания аскорбиновой кислоты в плодах шиповника // Здоровье и образование в XXI веке. Материалы ХI международного конгресса. – М., 2010. С. 44–45.
6. Агапова Н.М., Абдуллина С.Г., Хазиев Р.Ш. Кулонометрическое определение содержания органических кислот в свежих и сухих плодах // Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров: Материалы Респ. научн.-практ. конф. – Казань, 2010. С. 9–11.
7. ГОСТ 29187–91. Плоды и ягоды быстрозамороженные. Общие технические условия [Текст]. – Введ. 1993–01–01. – М.: Изд-во стандартов, 1993. 14 c.
8. ГОСТ 3525-75. Плоды малины [Текст]. – Введ. 1977–07–01. – М.: Изд-во стандартов, 1977. 3 c.
9. Агапова Н.М. Совершенствование фармацевтического анализа лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов с помощью гальваностатической кулонометрии: автореф. дис. канд. фарм. наук: 14.04.02 / Агапова Наталья Михайловна. – М., 2011. С. 24.
10. Вершинина В.В., Куркин В.А. Определение подлинности плодов и сиропа шиповника с использованием тонкослойной хроматографии // Медицинский альманах. 2011. № 2(15). С. 144–146.
ВВЕДЕНИЕ
Использование биологически активных веществ растений в их природной композиции обеспечивает широкий спектр фармацевтического воздействия, необходимый для лечения органов и систем организма человека.
Для получения водных извлечений (настоев и отваров), настоек, экстрактов, таблетированных форм лекарственное растительное сырье (ЛРС) чаще всего используют в высушенном виде. Непосредственно после сбора ЛРС перерабатывают для производства сока и экстракционных препаратов. Свежесобранное ЛРС содержит комплекс действующих веществ, входящих в состав растений в естественном состоянии, которые еще не подверглись гидролитическому разложению и воздействию ферментов.
В аллопатической практике свежее растительное сырье широкого применения не нашло [1, 2], главным образом из-за невозможности долгого хранения и необходимости его быстрой переработки практически сразу после сбора.
Проблема консервации свежего ЛРС достаточно актуальна как для аллопатии, так и для гомеопатии. Действующие вещества многих лекарственных растений (ЛР) во время сушки и последующего хранения подвергаются превращениям вследствие ферментативных процессов, действия света и кислорода воздуха. Методом консервации ЛРС может служить замораживание, обеспечивающее полное или частичное превращение клеточного сока в лед [3].
Плоды – одна из морфологических групп ЛРС, которая достаточно широко используется в медицине. В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации ХIII изд., ОФС.1.5.1.0007.15 "Плоды"[1], официально разрешено применение плодов как в высушенном, так и в свежем виде. Наиболее богатый состав БАВ имеют свежие плоды, в том числе малины обыкновенной. Однако в связи с большим содержанием влаги хранить сочные плоды в свежем виде затруднительно. Согласно инструкции по заготовке срок хранения свежего сырья составляет не более трех суток. Сегодня замораживание является наиболее оптимальным способом консервации для сочных плодов. Его широко применяют в пищевой промышленности [4, 5], но почти не используют в фармации, поэтому исследования влияния низких температур на качество ЛРС весьма актуальны.
ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель работы состояла в проведении комплексных исследований влияния способов консервации на состав и содержание отдельных групп БАВ в плодах малины обыкновенной и полученных из них водных и водно-спиртовых извлечений.
Объектами исследования служили образцы свежих, замороженных и высушенных плодов малины обыкновенной (Rubus idaeus L.), собранные на территории Ботанического сада Первого МГМУ им. И.М.Сеченова и Московской области (Истринский, Щелковский, Дмитровский районы).
Сушку исследуемых образцов проводили в сушильном шкафу при температуре 60–80 °С согласно инструкции по заготовке и сушке ЛРС. Готовое сырье помещали в бумажные пакеты и хранили в соответствии с требованиями общей фармакопейной статьи ОФС.1.1.0011.15 ГФ XIII изд., т. 1 "Хранение лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов" в сухом, чистом, хорошо вентилируемом помещении.
Образцы сырья замораживали согласно ГОСТ Р 53956-2010. "Фрукты быстрозамороженные". Плоды упаковывали в полиэтиленовые пакеты и хранили в морозильной камере при температуре –18 °С. Все исследования проводили с сырьем, которое размораживали в соответствии с указанным ГОСТ в бытовом холодильнике при температуре 6–8 °С в течение 2,5 ч.
Отвары из плодов изучаемых объектов изготавливали согласно общей фармакопейной статье ОФС.1.4.1.0018.15 ГФ XIII изд., т. 2 "Настои и отвары".
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Качественное определение БАВ в плодах малины различных способов консервации
Качественное обнаружение кислоты аскорбиновой проводили методом ТСХ. Готовили водные извлечения из плодов: 1,0 г измельченного сырья (гомогенизированная взвесь из замороженных или свежих плодов) заливали экстрагентом (вода) в соотношении 1 : 10 и настаивали при комнатной температуре в течение 1–2 ч, затем их фильтровали и подвергали анализу.
В ходе ТСХ-анализа проведена работа по выбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющих разделить и идентифицировать БАВ в свежих, замороженных и высушенных плодах. Хроматографическое разделение проводили на пластинках "Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ" размером 10 Ч 15 см. Насыщали хроматографическую камеру парами растворителя в течение часа.
Для обнаружения аскорбиновой кислоты использовали систему растворителей этилацетат – ледяная уксусная кислота (80 : 20). Детектирование проводили раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Аскорбиновая кислота проявлялась в виде белых пятен на розовом фоне с фактором удерживания Rf около 0,62 на уровне пятна-свидетеля аскорбиновой кислоты. Зоны адсорбции аскорбиновой кислоты присутствовали во всех извлечениях (рис.1).
Органические кислоты – широко распространенная группа БАВ в растительном сырье, а в плодах она доминирует. Качественный анализ органических кислот в исследуемых образцах проводили методом ТСХ [10]. В качестве неподвижной фазы использовали пластинки "Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ" размером 10 Ч 15 см, а подвижной фазы – систему органических растворителей спирт этиловый 95% – аммиак концентрированный (16 : 4,5). Насыщение камеры парами подвижной фазы осуществляли не менее часа.
На линию старта пластинки с помощью микрошприца наносили по 10 мкл водных извлечений из свежих, замороженных и высушенных плодов малины обыкновенной. В качестве стандартных образцов (свидетелей) использовали водные растворы яблочной, лимонной, щавелевой, янтарной и сорбиновой кислот в концентрации 2 мг/мл. Пластинки с нанесенными пробами сушили на воздухе в течение 10 мин, помещали в камеру со смесью вышеуказанных растворителей и хроматографировали восходящим способом. Время хроматографирования определялось прохождением системой растворителей фронта – 12 см.
Детектирование хроматограммы проводили после опрыскивания пластинки 0,4%-ным спиртовым раствором бромкрезолового зеленого и последующего нагревания в сушильном шкафу при 105 °С в течение 5 мин. Зоны адсорбции проявлялись в виде желтых и синих пятен на бледно-голубом фоне (рис.2). Извлечения из плодов малины обыкновенной характеризовались зонами с Rf около 0,10 (лимонная кислота); 0,30 (яблочная кислота); около 0,39 (янтарная кислота). С целью установления природы соединений, проявлявшихся в виде синих зон адсорбции с Rf около 0,47 и 0,65 хроматограммы были обработаны 0,25%-ным раствором нингидрина. После высушивания указанные пятна проявлялись в виде зон красно-малинового цвета, что свидетельствует об их принадлежности к веществам аминокислотного характера.
Отличий в числе зон на хроматограммах свежих, замороженных и высушенных плодов не наблюдали. При этом интенсивность зон яблочной и лимонной кислот на хроматограммах извлечений из высушенных плодов была заметно слабее, чем в замороженном и свежем сырье, что может говорить о различном количественном содержании этих компонентов в образцах.
Изучение компонентного состава фенолкарбоновых кислот проводили с помощью тонкослойной хроматографии. Для ТСХ-анализа были получены спиртовые извлечения из свежих, замороженных и высушенных плодов: 1,0 г измельченного сырья заливали 70%-ным этиловым спиртом в соотношении 1 : 10 и нагревали в течение 30 мин. Полученные извлечения фильтровали и подвергали анализу. В качестве неподвижной фазы использовали пластинки "Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ" размером 10 Ч 15 см. Наилучшее разделение наблюдалось в системе растворителей бутанол – кислота уксусная ледяная – вода (9 : 1 : 0,5).
Известно, что плоды малины обыкновенной обладают богатым составом и высоким содержанием фенолкарбоновых кислот. Эти соединения могут находиться в растительном сырье в свободном или связанном виде – в форме простых и сложных эфиров. Поэтому для идентификации фенолкарбоновых кислот в плодах малины были получены извлечения с проведением предварительного щелочного гидролиза для разрушения связанных форм кислот по следующей методике. 10,0 г измельченных высушенных плодов малины (гомогенизированная взвесь из замороженных или свежих плодов) помещали в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 300 мл, приливали 150 мл 70%-ного этилового спирта и нагревали с обратным холодильником на водяной бане в течение часа. Полученное извлечение охлаждали и фильтровали через двойной слой марли с подложенным тампоном ваты в колбу вместимостью 500 мл. К фильтрату приливали 150 мл 2-молярного раствора гидроксида натрия и выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем содержимое колбы переносили в делительную воронку объемом 500 мл, приливали 150 мл этилацетата и встряхивали в течение 15 мин. После полного расслоения желтый этилацетатный слой собирали в колбу вместимостью 300 мл. Обработку этилацетатом повторяли дважды. Полученное этилацетатное извлечение упаривали под вакуумом на ротационном испарителе до объема 30 мл.
С помощью микрошприца на стартовую линию хроматографической пластинки наносили по 20 мкл полученных этилацетатных извлечений и хроматографировали восходящим способом в системе растворителей толуол – метиловый спирт – кислота уксусная ледяная (90 : 16 : 4). После прохождения фронтом растворителей 12 см пластинку вынимали из камеры, высушивали на воздухе в течение 5 мин и опрыскивали раствором хлорида железа с последующим нагреванием в сушильном шкафу при 105 °С в течение 5 мин. Полученные результаты представлены на рис.3.
На хроматограммах извлечений из свежих и замороженных образцов наблюдалось семь зон адсорбции. Со стандартными образцами идентифицированы галловая (Rf около 0,33), кофейная (Rf около 0,48) и салициловая (Rf около 0,68) кислоты. Отметим, что на хроматограмме извлечения из высушенных плодов малины присутствует дополнительная зона адсорбции с Rf около 0,73 – соединение, которое, возможно, образовалось в результате высушивания сырья.
При изучении состава антоцианов плодов малины различных способов консервации также использовали метод ТСХ. Хроматографическое разделение проводили на пластинках "Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ" размером 10 Ч 15 см. Насыщали хроматографическую камеру парами растворителя в течение часа. Для анализа готовили спиртовые извлечения из плодов: 2,0 г измельченных высушенных плодов (гомогенизированная взвесь из замороженных или свежих плодов) помещали в коническую колбу со шлифом, добавляли 10 мл 95%-ного этилового спирта, содержащего 1% хлороводородной кислоты, закрывали пробкой и перемешивали в течение 30 мин. Извлечения фильтровали через бумажный фильтр и анализировали.
На линию старта пластинки с помощью микрошприца наносили по 20 мкл спиртовых извлечений из свежих, замороженных и высушенных плодов изучаемых объектов и стандартных образцов-свидетелей. Пластинки с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 10 мин, помещали в камеру со смесью растворителей и хроматографировали восходящим способом. Наиболее приемлемой для анализа является система с уксусной кислотой, в которой происходит видимое разделение окрашенных в характерные для антоцианов цвета пятен. Идентификацию антоцианов проводили в системе н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (9 : 1 : 0,5) по величине фактора удерживания Rf. После нагревания пластинки в сушильном шкафу проявились пятна малинового цвета на белом фоне с Rf около 0,37 на уровне пятна стандартного образца цианидин-3,5-дигликозида и зона малинового цвета, идентифицированная как цианидин-3-О-глюкозид (Rf около 0,36) (рис.4). В антоциановом профиле плодов малины обыкновенной присутствуют цианидин-3,5-дигликозид и цианидин-3-О-глюкозид.
Сравнительный качественный анализ свежих, замороженных и высушенных плодов показал, что способ консервации не изменяет химический состав плодов. В замороженном и высушенном сырье сохраняются все группы БАВ, содержащиеся в нативном состоянии в свежем сырье. В плодах малины обыкновенной всех способов консервации обнаружены фенольные соединения: цианидин-3,5-дигликозид, цианидин-3-О-глюкозид, салициловая, кофейная, галловая кислоты; органические кислоты: аскорбиновая, лимонная, яблочная, янтарная.
Влияние способов консервации на количественное содержание БАВ в плодах малины обыкновенной
Для количественной оценки содержания свободных органических кислот в изучаемых плодах выбран метод гальваностатической кулонометрии при постоянной силе тока [9]. Для проведения исследований использовали кулонометр "Эксперт-006" при силе тока 5 мА с встроенным рН-метром. Электрогенерацию гидроксид-ионов осуществляли из насыщенного водного раствора K2SO4, конечную точку титрования определяли рН-метром с помощью лабораторного комбинированного "полумикро"-pH-электрода ЭСК-10614. Реакцию проводили с использованием магнитной мешалки и при постоянной температуре.
Методика. Аналитическую пробу массой 20 г измельченных свежих или замороженных плодов (или 5 г высушенных плодов) помещали в колбу вместимостью 200 мл, приливали 150 мл очищенной воды и выдерживали в течение 2 ч на кипящей водяной бане. Полученное извлечение охлаждали и фильтровали через бумажный складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводили объем очищенной водой до метки и перемешивали. 0,5 мл полученного извлечения вносили в кулонометрическую ячейку, заполненную фоновым электролитом – водным раствором сульфата калия. Титрование проводили гидроксид-ионами, сгенерированными прибором: результат показывал сумму органических кислот в пересчете на яблочную кислоту, содержащуюся в аликвоте извлечения, в микрограммах.
Содержание суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в сырье в процентах (X) рассчитывали по формуле:
%, (*)
где Va – объем извлечения, вводимого в кулонометрическую ячейку, мл;
m – количество органических кислот, полученное при измерении, мкг;
V – общий объем извлечения, мл;
a – масса сырья, г;
W – потеря в массе при высушивании, %.
Полученные результаты (табл.1) показали, что замораживание приводит к незначительному снижению данной группы БАВ в плодах малины обыкновенной – в среднем на 20%, а в процессе сушки – на 30%.
Определение содержания аскорбиновой кислоты также проводили методом кулонометрического титрования [5, 6]. Для проведения исследований использовали кулонометр "Эксперт-006" при силе тока 5 мА со встроенным рH-метром. Проверку эффективности кулонометрического титрования проводили по стандарт-титру "Натрий серноватистокислый 5-водный (Na2S2O3· 5H2O) = 0,1 моль/дм3 (0,1 Н)".
Затраченное на титрование количество электричества на кулонометре "Эксперт-006" рассчитывается по формуле:
Кл,
где m – масса тиосульфата натрия в пробе, найденная кулонометрически, мкг (должно находиться 124,1 мкг). Аскорбиновая кислота взаимодействует с электрогенерированным йодом быстро и в стехиометрических количествах в соотношении 1 : 1.
Методика. Из грубоизмельченной аналитической пробы свежих или замороженных плодов брали навеску массой 20 г (или 5 г высушенных плодов), помещали в фарфоровую ступку, где тщательно растирали со стеклянным порошком (около 5 г), приливали 150 мл очищенной воды и настаивали в течение 10 мин, а затем перемешивали и фильтровали через бумажный складчатый фильтр.
По 0,5 мл извлечения из плодов и стандартного раствора вносили в кулонометрическую ячейку, заполненную электролитом – 0,1-молярным раствором йодистого калия в хлороводородном буферном растворе (рН = 1,2), и титровали электрогенерированным йодом.
Содержание аскорбиновой кислоты в сырье в процентах в пересчете на абсолютно сухое сырье (Х) рассчитывали по формуле (*).
На основании полученных результатов (см. табл.1) можно сделать вывод, что замораживание обеспечивает сохранение до 95% аскорбиновой кислоты от ее исходного содержания в свежем сырье, а сушка значительно снижает. Потери аскорбиновой кислоты при высушивании составляли до 90%. Таким образом, замораживание как способ консервации предпочтительнее для сохранения аскорбиновой кислоты в плодах малины обыкновенной.
Сумму антоцианов в плодах малины определяли в соответствии со ст. 6 ГФ XI изд., в.2 «Цветки василька синего» методом прямой спектрофотометрии. Пересчет вели на цианидин-3,5-диглюкозид, поскольку максимум его спектра поглощения и спектров извлечений из плодов малины (510–520 нм) совпали (рис.5). Полученные данные (табл.1) свидетельствуют о том, что замораживание предпочтительнее для сохранения указанной группы БАВ в плодах малины обыкновенной: остается в среднем 80% антоцианов, тогда как в сухих плодах всего 10%.
Определение содержания дубильных веществ в пересчете на танин в плодах различных способов консервации проводили методом перманганатометрического титрования согласно методике общей статьи ОФС.1.5.3.0008.15 ГФ XIII изд., т. 2 "Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах" [1]. При низких температурах сохраняется бульшее количество дубильных веществ в сырье по сравнению с высушиванием (см. табл.1). Так, потери дубильных веществ при замораживании плодов малины – до 20%, а при высушивании они разрушаются значительно – до 36–55%. По-видимому, при сушке происходит окисление полифенолов, а также образование нерастворимых флобафенов.
Полисахариды обладают широким спектром фармакологического действия, оказывая влияние на различные органы и ткани, а также участвуют в обменных процессах. Изучаемые плоды лекарственных растений характеризуются высоким содержанием сахаров. Состав и структура полисахаридов различна. Поэтому изучение количественного содержания этой группы БАВ в плодах различных способов консервации представляется интересным.
Определение содержания суммы полисахаридов проводили фармакопейным методом гравиметрии в соответствии с методикой, приведенной в ГФ XIII изд., т. 3, ФС 2.5.0032.15 "Листья подорожника большого". Для количественной оценки сахаров этот метод наиболее доступен и прост в исполнении.
Полисахариды оказались наиболее стабильной группой БАВ из всех изученных. Их содержание как в замороженных, так и в высушенных плодах незначительно отличалось от исходного, хотя тенденция к снижению наблюдалась как при воздействии на плоды высоких, так и низких температур. Объяснить это можно гидролитическими процессами, протекающими в растительном сырье при замораживании и высушивании, а также инверсией сахарозы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе проведенных исследований получены данные о влиянии замораживания и высушивания плодов малины обыкновенной на содержание таких групп БАВ, как флавоноиды, антоцианы, полисахариды, аскорбиновая кислота, дубильные вещества и органические кислоты.
Выявлено, что способ консервации не влияет на качественный состав. После замораживания образцов сырья количественное содержание в них БАВ существенно не менялось или наблюдалось незначительное снижение дубильных веществ, органических кислот и антоцианов – в среднем на 20%.
Под действием высоких температур снижается количество органических кислот на 30%; дубильные вещества, аскорбиновая кислота и антоцианы разрушаются в большей степени, их содержание не превышает 50, 90, 90% соответственно. Высушивание снижает содержание полисахаридов и флавоноидов на 20–25%.
Таким образом, сравнительный анализ влияния на содержание БАВ методов консервации показал, что предпочтительным для сохранения качества плодов малины обыкновенной является замораживание.
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственная фармакопея Российской Федерации: в 3-х т. / XIII изд. – М., 2015.
2. https://www.rosminzdrav.ru/ministry/61/11/materialy-po-deyatelnosti-deparatamenta/stranitsa-856/stranitsa-902
3. Биологически активные вещества, входящие в состав лекарственного растительного сырья / И.М.Коренская [и др.]. – Воронеж: Издательско-полиграфический центр ВГУ, 2010. 66 c.
4. Абдуллина С.Г., Петрова И.К., Лира О.А. Гальваностатическая кулонометрия в анализе лекарственных средств : Учебно-методическое пособие для студентов фармацевтического факультета. – Казань: КГМУ, 2011. 62 c.
5. Агапова Н.М., Абдуллина С.Г., Хазиев Р.Ш. Кулонометрическое определение содержания аскорбиновой кислоты в плодах шиповника // Здоровье и образование в XXI веке. Материалы ХI международного конгресса. – М., 2010. С. 44–45.
6. Агапова Н.М., Абдуллина С.Г., Хазиев Р.Ш. Кулонометрическое определение содержания органических кислот в свежих и сухих плодах // Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров: Материалы Респ. научн.-практ. конф. – Казань, 2010. С. 9–11.
7. ГОСТ 29187–91. Плоды и ягоды быстрозамороженные. Общие технические условия [Текст]. – Введ. 1993–01–01. – М.: Изд-во стандартов, 1993. 14 c.
8. ГОСТ 3525-75. Плоды малины [Текст]. – Введ. 1977–07–01. – М.: Изд-во стандартов, 1977. 3 c.
9. Агапова Н.М. Совершенствование фармацевтического анализа лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов с помощью гальваностатической кулонометрии: автореф. дис. канд. фарм. наук: 14.04.02 / Агапова Наталья Михайловна. – М., 2011. С. 24.
10. Вершинина В.В., Куркин В.А. Определение подлинности плодов и сиропа шиповника с использованием тонкослойной хроматографии // Медицинский альманах. 2011. № 2(15). С. 144–146.
Отзывы читателей
