eng
Выпуск #2/2018
Г.А.Калабин, В.А.Ивлев, Н.А.Комаров, А.Ю.Колеснов
Комплексный 2Н/1Н ЯМР-скрининг дейтерия в компонентах водно-органических растворов
Комплексный 2Н/1Н ЯМР-скрининг дейтерия в компонентах водно-органических растворов
Просмотры: 6156
Предложен алгоритм использования совокупности спектроскопии ЯМР ядер протия 1Н и дейтерия 2Н(D) для быстрой идентификации и определения компонентного и дифференциального изотопного состава водно-органических растворов, в том числе этанола и воды в винной и коньячной продукции, соках, безалкогольных напитках и других продуктах. Метод не требует пробоподготовки и использования аттестованных стандартных образцов. Представлены примеры применения предлагаемого подхода для аутентификации и контроля качества винодельческой продукции.
DOI: 10.22184/2227-572X.2018.39.2.42.48
DOI: 10.22184/2227-572X.2018.39.2.42.48
ВВЕДЕНИЕ
Состав любых водно-органических растворов (ВОР), например, алкогольных напитков, молока, вин, соков и др., содержащих элементы H, C, N, O и S может быть охарактеризован на различных иерархических уровнях – компонентном, фрагментном, атомном и изотопном. Комплексный анализ полученных взаимодополняющих данных позволяет идентифицировать компоненты и происхождение ВОР с высокой степенью точности. Наибольшее распространение для этих целей получили методы элементного и компонентного анализа. Последний преимущественно использует различные виды хроматографии, которая в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием обладает высокой чувствительностью и при наличии аттестованных стандартных образцов (АСО) дает возможность идентифицировать и количественно измерять содержание макро- и микрокомпонентов. При изучении ВОР неизвестного состава несомненными достоинствами обладает количественная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 1Н и 13С, не тре¬бующая использования АСО. Однако даже сочетание этих методов не обеспечивает строгого доказательства соответствия компонентов ВОР заявленному сортовому, географическому (агроклиматическому) и/или технологическому происхождению, например, вина защищенного географического указания (ВЗГУ) или защищенного наименования места происхождения (ВЗНМП), минеральной воды – источнику, соков – способу их приготовления (прямой отжим или восстановление из концентрированного сырья), молока – цельному, разбавленному или восстановленному. Компонентный состав ВОР, если это экономически оправдано, можно имитировать, подготовив раствор из произвольной чистой воды и всех необходимых и широкодоступных неорганических и органических компонентов. Однако фальсификат даже при тщательном изготовлении и подборе рецептуры не будет соответствовать подлинному продукту по содержанию минорных стабильных изотопов водорода (2Н), углерода (13С), азота (15N), кислорода (17О и 18О) и серы (33S и 34S). Выявить подделку можно лишь методами изотопного анализа.
Ведущее место в изотопном анализе занимает масс-спектрометрия изотопных отношений (МСИО – IRMS/SIRA) благодаря ее высочайшей чувствительности и прецизионности. Первоначальные трудности в применении этого метода были связаны с наиболее сложным этапом – выделением компонентов объекта и их очисткой для последующей аутентификации. Развитие инструментария МСИО, например, появление ГХ- (для исследования летучих соединений) и ВЭЖХ-систем (для исследования нелетучих соединений), комбинированных с соответствующими изотопными интерфейсами, позволило исключить трудоемкие операции по извлечению аналитов из матрицы. Как правило, методом МСИО определяют так называемые интегральные отношения изотопов 2H/1H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S. Например, для молекулы этилового спирта CH3CH2OH в составе вина можно измерить только одно значение 2H/1H (δ2H(D)) или 13C/12C (δ13C). Однако, для этих изотопов характерно неравновесное распределение в отдельных фрагментах молекулы, то есть три и два разных значения для водорода и углерода соответственно. Соотношение между ними отражает специфику агроклиматических условий географического региона выращивания винограда. Кроме того, при исследовании, например, спиртосодержащих дистиллятов необходимо учитывать присутствие воды, которая влияет на достоверность результатов при измерении изотопии водорода (2H(D)/1H) и кислорода (18O/16O) в спирте. При исследовании изотопии легких элементов с помощью МСИО невозможно установить различия между этанолом из углеводов любого представителя группы растений С3-пути фотосинтеза (сахарной свеклы, яблок, пшеницы, картофеля и др.), в которую входит и виноград, если они произрастают в одном агроклиматическом регионе. Причина заключается в том, что все они обладают единым механизмом изотопного обмена в метаболических процессах.
В то же время последние разработки в этой области позволяют проводить селективные измерения общего состава изотопов водорода 2Н/1Н в метильной и метиленовой группах молекулы этанола после его дегидратации (метод EIM-IRMS/SIRA).
МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОМПЛЕКСНОГО СКРИНИНГА ЯМР 2Н/1Н (CUMULATIVE SCREENING NMR/CS-NMR)
Спектроскопия ЯМР минорных изотопов 2H, 13C, 15N, 17O и 33S обеспечивает в общем случае измерение их дифференциального распределения во фрагментах молекул. На практике этот способ можно использовать только для водорода, у которого диапазон вариации природного содержания значителен (около 150 млн–1). В природных водах он составляет почти 100 млн–1, а его дифференциация даже в отдельных фрагментах органических молекул (например, α-пинена) достигает 150 млн–1. Неравновесное распределение изотопа водорода – дейтерия (2Н(D)) в органических молекулах является изотопным паспортом, подделка которого практически невозможна. Однако этот метод трудно применять для изотопов других элементов из-за малой вариабельности их содержания в природных объектах по отношению к прецизионности измерений интегральных интенсивностей сигналов ЯМР.
Все ВОР объединяет главная составляющая – вода. Поэтому сначала рассмотрим вопрос определения содержания в ней дейтерия 2H(D) методом спектроскопии ЯМР. Если объект анализа – природная вода с незначительным содержанием органических и неорганических примесей (до 3,5% в среднеокеанической воде), можно использовать традиционный подход МСИО, в котором водород воды для измерения переводится в газовой фазе в молекулярный при нагревании до 400° в присутствии цинка [1] или иным каталитическим путем [2]. Спектроскопия ЯМР является прямым способом измерения абсолютного содержания дейтерия в воде путем количественного введения в раствор добавок калибровочного соединения с известным содержанием дейтерия (например, тетраметилмочевины или диметилсульфона). Поскольку чувствительность метода ЯМР 2Н на шесть порядков ниже, чем для основного изотопа водорода – протия 1Н, то при исследованиях необходимо минимизировать потери объема анализируемой воды, сокращая долю калибровочных соединений. Для этого мы предлагаем использовать специальные обогащенные на 1–2 порядка дейтерорастворители для ЯМР, что позволяет уменьшить их объемную долю в растворе аналита до 2–3%. В работе [3] в качестве калибровочного соединения применяли триметилсилилпропионат натрия-2,2-3,3-d4 (ТСП), сигналы дейтерия двух метиленовых групп которого имеют химические сдвиги 0,60 и 2,00 м.д. Такой внутренний калибрант при измерении природного содержания дейтерия в воде неудобен из-за необходимости многократно понижать его концентрацию в образце, например, разбавляя в 104–105 раз уксусной кислотой, сигнал гидроксильной группы которой также следует учитывать. В работе [4] предложен иной способ калибровки – с помощью внешнего стандарта. Он содержит обогащенную дейте¬рием воду и реагент трифторметансульфонат европия (Eu[CF3SO3]3), смещающий сигнал дейтерия воды внешнего стандарта в слабое поле на 2–3 м.д., что исклю¬чает его перекрывание с пиком исследуемого образца. Однако работа с внешним стандартом имеет ряд недостатков. Для ампул ЯМР диаметром 5 мм за счет потери объема аналита на 15–20% время каждого измерения увеличивается на 30–40% в зависимости от содержания воды в ВОР. Необходимы тщательно откалиброванные по объему пары ампул (стандартной и капилляра), поэтому усложняется проведение серий экспериментов, особенно с использованием устройств автоматической смены образцов.
Для определения содержания воды в ВОР необходимо знать ее объемную долю, что требует идентификации и измерения остальных компонентов на основе устанавливаемой из ЯМР 1Н их мольной доли. В расчете следует учитывать вклад в интегральную интенсивность сигнала 1Н воды протонов других компонентов, участвующих с ней в быстром обмене. Без учета этих факторов определение по площади сигнала в области 4,8 м.д. всегда дает заниженное значение. Идентификация и количественное определение из спектра ЯМР 1Н сокомпонент в сложных системах позволяют рассчитать содержание непосредственно воды, а из спектра ЯМР 2Н установить ее изотопный состав, важный для исследовательских целей или характеризации подлинности.
КОМПЛЕКСНЫЙ ЯМР-СКРИНИНГ ВОДНОЙ КОМПОНЕНТЫ ВИНОДЕЛЬЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ
Рассмотрим процедуру определения в ВОР содержания дейтерия воды на примере экспертной задачи быстрого скрининга подлинности часто фальсифицируемых натуральных вин. Под скринингом подра¬зумевается проведение оперативного количественного анализа состава объекта простыми методами без пробоподготовки с возможностью немедленного принятия решения [5].
Специфика различий компонентного и изотопного состава вин и другой алкогольной продукции (например, коньяков, коньячных спиртов) обусловлена агроклиматическими и технологическими особенностями региона культивирования и переработки винограда, в том числе количеством осадков, температурой, интенсивностью ирригационных мероприятий, составом поверхностных и подземных вод, почвой и др. Эти факторы влияют, в частности, на содержание в вине минорных компонентов и изотопный состав винограда.
При анализе вина первоначально регистрируется спектр ЯМР 1Н, из которого с необходимой для идентификационных целей достоверностью легко рассчитать содержание воды, этанола, глицерина, основных кислот – винной, яблочной, молочной, лимонной, янтарной, уксусной.
В качестве маркера при измерении содержания определенных минорных компонентов удобно использовать сильнопольный сателлит группы СН3 этанола, который обусловлен присутствием молекул, в состав которых входит изотоп углерода 13С (1,1%). Количественное определение других минорных компонентов сле¬дует выполнять в режиме устранения сателлитных сигналов, то есть регистрируя спектры ЯМР 1Н при облучении образца на частоте ядер 13С. В качестве примера на рис.1 представлен спектр ЯМР 1Н вина "Каберне Совиньон" урожая 2015 года (Анапа), в котором содержание этанола рассчитано по интегральным интенсивностям сигналов групп ОН, СН3 и СН2 (на рис.1 они частично обрезаны) и составляет 13,9 об. %. Видны учитываемые при расчете сигналы многих минорных компонентов, которые характеризуют подлинность вина с позиций компонентного состава.
Хотя спектры ЯМР 1Н прямо характеризуют содержание отдельных компонентов, их недостаточно для признания подлинности вина или его соответствия определенным агроклиматическим условиям выращивания винограда (географическому происхождению). Идентичный представленному на рис.1 спектр ЯМР 1Н можно имитировать искусственной смесью воды, этанола и минорных компонентов. Сигнал воды в спектрах ЯМР 1Н и 2Н имеет характеристическое положение (4,8 м.д.) и не перекрывается с пиками других компонентов. Его интегральную интенсивность в спектре ЯМР 2Н следует использовать для аутентификации вина при учете вклада водорода гидроксильных и карбоксильных групп остальных ингредиентов, в первую очередь этанола. Для строгого заключения желательно знать содержание дейтерия в воде подлинных вин этого региона и агроклиматические условия заявленного года сбора урожая. Более доступный критерий – сравнение содержания дейтерия в воде вина и его усредненного значения в атмосферных осадках и почвенных водах региона. Известно, что количество дейтерия в воде вина на 8–15 млн–1 выше, чем в осадках из-за особенностей изотопного фракционирования в молекулах углеводов (сахаров) винограда при их превращении в этанол в ходе брожения. На территории винодельческих регионов РФ все поверхностные и подземные воды содержат менее 150 млн–1 дейтерия, поэтому в водной фракции вина его должно быть больше 156–158 млн–1. Следовательно, представленный метод ЯМР способен выявлять разбавление вина смесью этанол/вода или водой, а также полную фальсификацию его состава экзогенными компонентами.
Отметим, что представленный метод ЯМР при исследовании изотопии водорода в водной фракции продукта не позволяет обнаружить добавление в сусло экзогенных сахаров других растений С3- и/или С4-пути фотосинтеза (напр., сахарной свеклы, сахарного тростника, кукурузы, сорго и др.) перед брожением (т.н. "шаптализация") или непосредственное введение в винодельческую продукцию спирта невиноградного происхождения. Для этого необходимо измерить содержание дейтерия в метильной (показатель (D/H)I) и метиленовой (показатель (D/H)II) группах молекулы этанола, выделенного из исследуемого вина. Поэтому измерение содержания дейтерия в воде вина является первым быстрым этапом его детального анализа, обеспечивающего выявление наиболее грубых фальсификаций.
Представленный алгоритм, включающий комплексный анализ спектров ЯМР протия – 1Н и дейтерия – 2Н (D) вина для измерения содержания в его воде изотопа 2Н впервые был предложен нами для дифференциации вин Грузии, России (регион Кубани) и стран Западной Европы 15 лет назад [6]. Основные результаты этого исследования отражает рис.2, на котором за нулевое значение принято содержание дейтерия в международном стандарте VSMOW, соответствующем экваториальной воде мирового океана (D/H = 155,76 млн–1). Количество дейтерия в водной фракции вин Грузии, Испании, Италии, Франции близко, но выше, чем в винах Краснодарского края и Ростовской области. Частично это обусловлено агроклиматическими причинами и, казалось бы, может быть выбрано в качестве критерия при дифференциации вин Грузии и России. Однако в последних содержание дейтерия в водной фракции варьирует в широких пределах. Возможные причины: влияние агроклиматических условий выращивания винограда и интенсивности ирригационных мероприя¬тий, а также добавление в некоторые образцы воды или смеси вода/этанол в типичном для вин соотношении. Из спектров ЯМР 1Н выявлены манипуляции с составом некоторых вин по соотношению в них этанола, глицерина и кислот. Более того, в трех образцах содержание дейтерия в водной фракции вина оказалось ниже значений для поверхностных вод этого региона (145–150 млн–1), что нереально. Такой подход к выявлению фальсификации натуральных вин в последующие годы не применялся, как это следует из обзорной статьи 2015 года [7].
Разработанный нами алгоритм анализа прошел апробацию в 2017 году, когда из конкурсных вин выставки VINORUS, проходившей в Краснодаре совместно с 1-й Международной научно-технической конференцией "Инновационный мир современного виноградарства и виноделия: Россия – InnoWine Russia-2017", были отобраны образцы красного сухого вина сортов винограда "Каберне Совиньон" и "Мерло" 2015 года из различных регионов: Краснодарского края (№ 2–11), Крыма – Бахчисарай (№ 12), Волгоградской области (№ 13), Испании (№ 14). По спектрам ЯМР 1Н образцов измерены содержания в них этанола и глицерина (табл.1). Вклад в сигналы 1Н и 2Н воды гидроксильных и карбоксильных групп глицерина и других минорных компонентов вина не учитывали. В табл.1 приведены измеренные методом ЯМР относительные количества дейтерия в водной фракции различных вин. Для наглядности они представлены на рис.3 вместе с данными по содержанию 2Н в водопроводной воде Краснодара от 28 апреля 2017 года (№ 1). В водной фракции вина всех исследованных проб содержание дейтерия 2Н варьирует в диапазоне 159–167 млн–1. Исключение составили два образца вина "Каберне Совиньон" региона Тамани (№ 2 и 6) с пониженным содержанием дейтерия в воде, что можно объяснить составом воды источника, который использовали для орошения соответствующего винограда.
ЯМР-СПЕКТРОСКОПИЯ ДЕЙТЕРИЯ В ЭТАНОЛЕ ВИНОДЕЛЬЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ
Наиболее широкую известность и прикладное значение метод ЯМР 2Н получил в исследовании содержания дейтерия в метильной (D/H)I и метиленовой (D/H)II группах молекулы этанола для установления его природы.
Характеризация ВОР по содержанию дейтерия во фрагментах молекул этанола вина требует его количественного выделения. Для этого детально разработана соответст¬вующая процедура, так как в различных странах разрешено добавление в виноградное сусло экзогенных сахаров, в том числе из растений других ботанических видов.
В 1990 году Международной межправительственной организацией по виноградарству и виноделию OIV в Евро¬союзе в качестве официального принят впервые описанный в [8] метод SNIF-NMR [9]. К сегодняшнему дню накоплена значительная база научных знаний об интервалах изменения содержания дейтерия в метильной (D/H)I и метиленовой (D/H)II группах молекулы этанола виноградного происхождения. С учетом агроклиматических (географических) и технологических факторов минимальный и максимальный уровни для показателя (D/H)I в виноградном этаноле составляют 98,0 и 106,0 млн–1 соответственно, а для показателя (D/H)II – 121,0 и 136,0 млн–1. В эти диапазоны попадают также этанолы, выделенные из некоторых других фруктов, но не из сахарной свеклы (как и виноград входит в группу растений С3-пути фотосинтеза) и растений С4-пути фотосинтеза (кукуруза, сахарный тростник, сорго и др.) [10–11].
Метод SNIF-NMR требует использования спектрометров ЯМР, с рабочей частотой не менее 400 МГц для ядер 1Н и оснащенных датчиком для ампул 10 мм и системой стабилизации по сигналу ЯМР 19F.
В Центре коллективного пользования (Научно-образовательном центре) РУДН для решения задачи по исследованию природы этанола в продуктах виноделия используется модифицированный метод SNIF-NMR, основанный на авторской разработке [12] для стандартных спектрометров ЯМР.
Одна из его особенностей состоит в том, что стабилизация условий резонанса по сигналу 19F не применяется, поэтому за счет небольшого дрейфа сигналов измерение содержания дейтерия в СН2- (D/H)II и СН3- (D/H)I фрагментах молекул этанола по высоте соответствующих пиков имеет большие погрешности. Однако это практически не влияет на площади, измеряемые, как это принято в количественной спектроскопии ЯМР, по интегральной, а не пиковой интенсивности. Несомненное преимущество такого подхода перед методом [9] состоит в том, что содержание дейтерия в гидроксильной группе ОН выделенного этанола или остаточной воды можно измерять по интенсивности сигналов, которые за счет обменных процессов всегда имеют большую ширину, чем у дейтерия 2Н в метильной СН3 (D/H)I и метиленовой СН2 (D/H)II групп. Поскольку содержание дейтерия в гидроксильной группе определяется исключительно водной фракцией вина, в детальном анализе спектра ЯМР 1Н необходимости нет. Достаточно измерить плотность раствора аналита для оценки содержания в этаноле остаточной воды. Другая особенность разработанного метода при измерении природного содержания изотопа 2Н – применение в качестве калибровочной добавки обезвоженного диметилсульфоксида (ДМСО) с повышенным на два порядка содержанием дейтерия, что в 10 раз (с 30 об. % в случае метода [9] до 3 об. %) уменьшает объемную долю калибровочного вещества и, тем самым, вдвое сокращает время регистрации ЯМР-спектра. Суммарная погрешность такого способа обеспечивает прецизионность измеряемых значений ± 3%, что вполне достаточно для оценки природы этанола.
Разработку метода и его апробацию выполняли на спектрометре JEOL JNM-ECA 600 (Япония) с рабочей частотой для ядер 1Н 600 МГц и для ядер 2Н 92,102 МГц. Прибор снабжен системой автоматической замены образцов и имеет датчики 5 и 10 мм (рис.4). В работе использовали откалиброванные ампулы диаметром (4,97 ± 0,013) мм и длиной 178 мм. В качестве внутреннего стандарта для количественного определения компонентов при регистрации спектров ЯМР 1Н использовали триметилсилилпропианат натрия-d4 (ТСП), отклик метильных протонов которого не перекрывается с сигналами анализируемых образцов. При регистрации спектров ЯМР 2Н в качестве внутреннего стандарта (3% об.) использовали ДМСО с искусственно повышенным на два порядка содержанием дейтерия. Типичный спектр представлен на рис.5. Для регистрации спектров на ядрах 2H выбраны следующие условия эксперимента: импульс 45°, усиление 72, смещение 5 м.д., развертка 11 м.д., 16К точек на спектр, время наблюдения спада свободной индукции 2 с, число сканирований 800, время задержки между импульсами 5 ∙ T1 (2D2O) ≥ 5 с. Для обработки спектра использовалась автоматическая коррекция базовой линии, ручная настройка фазы, экспонен¬циальное умножение на значение 2,0.
В табл.1 представлены усредненные данные пяти измерений содержания дейтерия 2Н в каждом образце, относительное стандартное отклонение для которых состав¬ляет 2%.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предложен новый метод совокупного ЯМР-скрининг-анализа (CS-NMR) для определения содержания дейтерия в воде различных водно-органических растворов, в том числе вина, винодельческой продукции, соков и т.п. Первый этап – регистрация количественных спектров ЯМР 1Н для определения содержания воды в образце, с учетом других идентифицированных компонентов раствора. Затем – получение спектра ЯМР 2Н, из которого рассчитывается содержание изотопа 2Н воды, как важной характеристики происхождения или аутентичности с контрольным образцом. Не требующий пробоподготовки метод удобен при быстром скрининге многих водно-органических объектов. Детальное определение изотопного состава водорода других компонентов ВОР после их выделения может выполняться на стандартном оборудовании по более быстрой оригинальной методике.
Для исследования природы этанола винодельческой и другой спиртосодержащей продукции в Центре коллективного пользования (НОЦ) РУДН применяется модифицированный метод ЯМР, который основан на определении содержания дейтерия в метильной (показатель (D/H)I) и метиленовой (показатель (D/H)II) группах молекулы спирта. Количественные данные о содержании дейтерия в метильной группе (D/H)I) спирта позволяют сделать вывод не только о ботаническом виде растения, но и о географическом регионе его происхождения, а также о природе воды, участвовавшей в процессе брожения углеводов с образованием этанола. Данные о дейтерии в метиленовой группе (D/H)II спирта свидетельствуют о климатических условиях произрастания растения (например, винограда).
* Публикация подготовлена при поддержке Программы РУДН "5-100".
ЛИТЕРАТУРА
1. Hachey D.I., Wong W.W., Boutton T.W., Klein P.D. Isotope ratio measurements in nutrition and biomedical research // Mass Spectrometry Reviews. 1987. V. 6. P. 289–328. DOI 10.1002/mas.1280060203
2. Scrimgeour C.M., Rollo M.M., Mudambo S.M., Handley L.I., Prosser S.J. A simplified method for deuterium/hydrogen isotope ratio measurements on water samples of biological origin // Biological Mass Spectrometry/ 1993. 22. P. 383–387. DOI 10.1002/bms.1200220704
3. Ma X., Deng P., Wang X., Zhang C., Hou X. Direct determination of deuterium of wide concentration range in water by Nuclear Magnetic Resonance // Talanta. 2012. 97. P. 450–455.
4. Джимак С.С., Басов А.А., Федулова Л.В., Быков И.М., Ивлев В.А., Мелконян К.И., Тимаков А.А. Определение концентрации дейтерия в биологических жидкостях с помощью ЯМР-спектроскопии // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2016. 50(3). C. 42–47.
5. Varcarcel M., Caerdenas S., Gallego M. Sample screening systems in analytical chemistry // Trends in Analytical Chemistry. 1999. 18(11). P. 685–694.
6. Калабин Г.А., Козлов Ю.П., Рыков Р.С., Кулагина Н.В., Кушнарев Д.Ф., Рохин А.В. Новый алгоритм идентификации натуральных вин Грузии методом спектроскопии ЯМР // Вестник РУДН. Серия "Экология и безопасность жизнедеятельности". 2003. 9. C. 77–82.
7. Christoph N., Hermann A., Wachter H. 25 Years authentication of wine with stable isotope analysis in the European Union – Review and outlook // BIO Web of Conferences. 2015. 5. 02020. 8 p.
8. Martin G.J., Martin M.L., Mabon F., Michon M.J. Identification of the origin of natural alcohols by natural abundance hydrogen-2 nuclear magnetic resonance // Analytical Chemistry. 1982. 54. P. 2380–2382.
9. EC-Regulation 2676/1990 // Official Journal of the European Community. 1990. 64. L272.
10. Christoph C.B., Wachter H., Christoph N., Rossmann A., Adam L. Assignment of raw material and authentication of spirits by gas chromatography, hydrogen- and carbon-isotope ratio measurements I. Analytical methods and results of a study of commercial products // Zeitschrift fuer Lebensmitteluntersuchung und – forschung A. 1997. 204. P. 445–452.
11. Perini M., Guzzon R., Simoni M., Malacarne M., Lar¬cher R., Camin F. The effect of stopping alcoholic fermentation on the variability of H, C and O stable isotope ratios of ethanol // Food Control. 2014. 40. P. 368–373.
12. Калабин Г.А., Кулагина Н.В., Рыков Р.С., Козлов Ю.П., Кушнарев Д.Ф., Рохин А.В. Идентификация сырьевой природы этанола методом спектроскопии ЯМР // Вестник РУДН. Серия "Экология и безопасность жизнедеятельности". 2003. 7. С. 87–98.
Состав любых водно-органических растворов (ВОР), например, алкогольных напитков, молока, вин, соков и др., содержащих элементы H, C, N, O и S может быть охарактеризован на различных иерархических уровнях – компонентном, фрагментном, атомном и изотопном. Комплексный анализ полученных взаимодополняющих данных позволяет идентифицировать компоненты и происхождение ВОР с высокой степенью точности. Наибольшее распространение для этих целей получили методы элементного и компонентного анализа. Последний преимущественно использует различные виды хроматографии, которая в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием обладает высокой чувствительностью и при наличии аттестованных стандартных образцов (АСО) дает возможность идентифицировать и количественно измерять содержание макро- и микрокомпонентов. При изучении ВОР неизвестного состава несомненными достоинствами обладает количественная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 1Н и 13С, не тре¬бующая использования АСО. Однако даже сочетание этих методов не обеспечивает строгого доказательства соответствия компонентов ВОР заявленному сортовому, географическому (агроклиматическому) и/или технологическому происхождению, например, вина защищенного географического указания (ВЗГУ) или защищенного наименования места происхождения (ВЗНМП), минеральной воды – источнику, соков – способу их приготовления (прямой отжим или восстановление из концентрированного сырья), молока – цельному, разбавленному или восстановленному. Компонентный состав ВОР, если это экономически оправдано, можно имитировать, подготовив раствор из произвольной чистой воды и всех необходимых и широкодоступных неорганических и органических компонентов. Однако фальсификат даже при тщательном изготовлении и подборе рецептуры не будет соответствовать подлинному продукту по содержанию минорных стабильных изотопов водорода (2Н), углерода (13С), азота (15N), кислорода (17О и 18О) и серы (33S и 34S). Выявить подделку можно лишь методами изотопного анализа.
Ведущее место в изотопном анализе занимает масс-спектрометрия изотопных отношений (МСИО – IRMS/SIRA) благодаря ее высочайшей чувствительности и прецизионности. Первоначальные трудности в применении этого метода были связаны с наиболее сложным этапом – выделением компонентов объекта и их очисткой для последующей аутентификации. Развитие инструментария МСИО, например, появление ГХ- (для исследования летучих соединений) и ВЭЖХ-систем (для исследования нелетучих соединений), комбинированных с соответствующими изотопными интерфейсами, позволило исключить трудоемкие операции по извлечению аналитов из матрицы. Как правило, методом МСИО определяют так называемые интегральные отношения изотопов 2H/1H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S. Например, для молекулы этилового спирта CH3CH2OH в составе вина можно измерить только одно значение 2H/1H (δ2H(D)) или 13C/12C (δ13C). Однако, для этих изотопов характерно неравновесное распределение в отдельных фрагментах молекулы, то есть три и два разных значения для водорода и углерода соответственно. Соотношение между ними отражает специфику агроклиматических условий географического региона выращивания винограда. Кроме того, при исследовании, например, спиртосодержащих дистиллятов необходимо учитывать присутствие воды, которая влияет на достоверность результатов при измерении изотопии водорода (2H(D)/1H) и кислорода (18O/16O) в спирте. При исследовании изотопии легких элементов с помощью МСИО невозможно установить различия между этанолом из углеводов любого представителя группы растений С3-пути фотосинтеза (сахарной свеклы, яблок, пшеницы, картофеля и др.), в которую входит и виноград, если они произрастают в одном агроклиматическом регионе. Причина заключается в том, что все они обладают единым механизмом изотопного обмена в метаболических процессах.
В то же время последние разработки в этой области позволяют проводить селективные измерения общего состава изотопов водорода 2Н/1Н в метильной и метиленовой группах молекулы этанола после его дегидратации (метод EIM-IRMS/SIRA).
МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОМПЛЕКСНОГО СКРИНИНГА ЯМР 2Н/1Н (CUMULATIVE SCREENING NMR/CS-NMR)
Спектроскопия ЯМР минорных изотопов 2H, 13C, 15N, 17O и 33S обеспечивает в общем случае измерение их дифференциального распределения во фрагментах молекул. На практике этот способ можно использовать только для водорода, у которого диапазон вариации природного содержания значителен (около 150 млн–1). В природных водах он составляет почти 100 млн–1, а его дифференциация даже в отдельных фрагментах органических молекул (например, α-пинена) достигает 150 млн–1. Неравновесное распределение изотопа водорода – дейтерия (2Н(D)) в органических молекулах является изотопным паспортом, подделка которого практически невозможна. Однако этот метод трудно применять для изотопов других элементов из-за малой вариабельности их содержания в природных объектах по отношению к прецизионности измерений интегральных интенсивностей сигналов ЯМР.
Все ВОР объединяет главная составляющая – вода. Поэтому сначала рассмотрим вопрос определения содержания в ней дейтерия 2H(D) методом спектроскопии ЯМР. Если объект анализа – природная вода с незначительным содержанием органических и неорганических примесей (до 3,5% в среднеокеанической воде), можно использовать традиционный подход МСИО, в котором водород воды для измерения переводится в газовой фазе в молекулярный при нагревании до 400° в присутствии цинка [1] или иным каталитическим путем [2]. Спектроскопия ЯМР является прямым способом измерения абсолютного содержания дейтерия в воде путем количественного введения в раствор добавок калибровочного соединения с известным содержанием дейтерия (например, тетраметилмочевины или диметилсульфона). Поскольку чувствительность метода ЯМР 2Н на шесть порядков ниже, чем для основного изотопа водорода – протия 1Н, то при исследованиях необходимо минимизировать потери объема анализируемой воды, сокращая долю калибровочных соединений. Для этого мы предлагаем использовать специальные обогащенные на 1–2 порядка дейтерорастворители для ЯМР, что позволяет уменьшить их объемную долю в растворе аналита до 2–3%. В работе [3] в качестве калибровочного соединения применяли триметилсилилпропионат натрия-2,2-3,3-d4 (ТСП), сигналы дейтерия двух метиленовых групп которого имеют химические сдвиги 0,60 и 2,00 м.д. Такой внутренний калибрант при измерении природного содержания дейтерия в воде неудобен из-за необходимости многократно понижать его концентрацию в образце, например, разбавляя в 104–105 раз уксусной кислотой, сигнал гидроксильной группы которой также следует учитывать. В работе [4] предложен иной способ калибровки – с помощью внешнего стандарта. Он содержит обогащенную дейте¬рием воду и реагент трифторметансульфонат европия (Eu[CF3SO3]3), смещающий сигнал дейтерия воды внешнего стандарта в слабое поле на 2–3 м.д., что исклю¬чает его перекрывание с пиком исследуемого образца. Однако работа с внешним стандартом имеет ряд недостатков. Для ампул ЯМР диаметром 5 мм за счет потери объема аналита на 15–20% время каждого измерения увеличивается на 30–40% в зависимости от содержания воды в ВОР. Необходимы тщательно откалиброванные по объему пары ампул (стандартной и капилляра), поэтому усложняется проведение серий экспериментов, особенно с использованием устройств автоматической смены образцов.
Для определения содержания воды в ВОР необходимо знать ее объемную долю, что требует идентификации и измерения остальных компонентов на основе устанавливаемой из ЯМР 1Н их мольной доли. В расчете следует учитывать вклад в интегральную интенсивность сигнала 1Н воды протонов других компонентов, участвующих с ней в быстром обмене. Без учета этих факторов определение по площади сигнала в области 4,8 м.д. всегда дает заниженное значение. Идентификация и количественное определение из спектра ЯМР 1Н сокомпонент в сложных системах позволяют рассчитать содержание непосредственно воды, а из спектра ЯМР 2Н установить ее изотопный состав, важный для исследовательских целей или характеризации подлинности.
КОМПЛЕКСНЫЙ ЯМР-СКРИНИНГ ВОДНОЙ КОМПОНЕНТЫ ВИНОДЕЛЬЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ
Рассмотрим процедуру определения в ВОР содержания дейтерия воды на примере экспертной задачи быстрого скрининга подлинности часто фальсифицируемых натуральных вин. Под скринингом подра¬зумевается проведение оперативного количественного анализа состава объекта простыми методами без пробоподготовки с возможностью немедленного принятия решения [5].
Специфика различий компонентного и изотопного состава вин и другой алкогольной продукции (например, коньяков, коньячных спиртов) обусловлена агроклиматическими и технологическими особенностями региона культивирования и переработки винограда, в том числе количеством осадков, температурой, интенсивностью ирригационных мероприятий, составом поверхностных и подземных вод, почвой и др. Эти факторы влияют, в частности, на содержание в вине минорных компонентов и изотопный состав винограда.
При анализе вина первоначально регистрируется спектр ЯМР 1Н, из которого с необходимой для идентификационных целей достоверностью легко рассчитать содержание воды, этанола, глицерина, основных кислот – винной, яблочной, молочной, лимонной, янтарной, уксусной.
В качестве маркера при измерении содержания определенных минорных компонентов удобно использовать сильнопольный сателлит группы СН3 этанола, который обусловлен присутствием молекул, в состав которых входит изотоп углерода 13С (1,1%). Количественное определение других минорных компонентов сле¬дует выполнять в режиме устранения сателлитных сигналов, то есть регистрируя спектры ЯМР 1Н при облучении образца на частоте ядер 13С. В качестве примера на рис.1 представлен спектр ЯМР 1Н вина "Каберне Совиньон" урожая 2015 года (Анапа), в котором содержание этанола рассчитано по интегральным интенсивностям сигналов групп ОН, СН3 и СН2 (на рис.1 они частично обрезаны) и составляет 13,9 об. %. Видны учитываемые при расчете сигналы многих минорных компонентов, которые характеризуют подлинность вина с позиций компонентного состава.
Хотя спектры ЯМР 1Н прямо характеризуют содержание отдельных компонентов, их недостаточно для признания подлинности вина или его соответствия определенным агроклиматическим условиям выращивания винограда (географическому происхождению). Идентичный представленному на рис.1 спектр ЯМР 1Н можно имитировать искусственной смесью воды, этанола и минорных компонентов. Сигнал воды в спектрах ЯМР 1Н и 2Н имеет характеристическое положение (4,8 м.д.) и не перекрывается с пиками других компонентов. Его интегральную интенсивность в спектре ЯМР 2Н следует использовать для аутентификации вина при учете вклада водорода гидроксильных и карбоксильных групп остальных ингредиентов, в первую очередь этанола. Для строгого заключения желательно знать содержание дейтерия в воде подлинных вин этого региона и агроклиматические условия заявленного года сбора урожая. Более доступный критерий – сравнение содержания дейтерия в воде вина и его усредненного значения в атмосферных осадках и почвенных водах региона. Известно, что количество дейтерия в воде вина на 8–15 млн–1 выше, чем в осадках из-за особенностей изотопного фракционирования в молекулах углеводов (сахаров) винограда при их превращении в этанол в ходе брожения. На территории винодельческих регионов РФ все поверхностные и подземные воды содержат менее 150 млн–1 дейтерия, поэтому в водной фракции вина его должно быть больше 156–158 млн–1. Следовательно, представленный метод ЯМР способен выявлять разбавление вина смесью этанол/вода или водой, а также полную фальсификацию его состава экзогенными компонентами.
Отметим, что представленный метод ЯМР при исследовании изотопии водорода в водной фракции продукта не позволяет обнаружить добавление в сусло экзогенных сахаров других растений С3- и/или С4-пути фотосинтеза (напр., сахарной свеклы, сахарного тростника, кукурузы, сорго и др.) перед брожением (т.н. "шаптализация") или непосредственное введение в винодельческую продукцию спирта невиноградного происхождения. Для этого необходимо измерить содержание дейтерия в метильной (показатель (D/H)I) и метиленовой (показатель (D/H)II) группах молекулы этанола, выделенного из исследуемого вина. Поэтому измерение содержания дейтерия в воде вина является первым быстрым этапом его детального анализа, обеспечивающего выявление наиболее грубых фальсификаций.
Представленный алгоритм, включающий комплексный анализ спектров ЯМР протия – 1Н и дейтерия – 2Н (D) вина для измерения содержания в его воде изотопа 2Н впервые был предложен нами для дифференциации вин Грузии, России (регион Кубани) и стран Западной Европы 15 лет назад [6]. Основные результаты этого исследования отражает рис.2, на котором за нулевое значение принято содержание дейтерия в международном стандарте VSMOW, соответствующем экваториальной воде мирового океана (D/H = 155,76 млн–1). Количество дейтерия в водной фракции вин Грузии, Испании, Италии, Франции близко, но выше, чем в винах Краснодарского края и Ростовской области. Частично это обусловлено агроклиматическими причинами и, казалось бы, может быть выбрано в качестве критерия при дифференциации вин Грузии и России. Однако в последних содержание дейтерия в водной фракции варьирует в широких пределах. Возможные причины: влияние агроклиматических условий выращивания винограда и интенсивности ирригационных мероприя¬тий, а также добавление в некоторые образцы воды или смеси вода/этанол в типичном для вин соотношении. Из спектров ЯМР 1Н выявлены манипуляции с составом некоторых вин по соотношению в них этанола, глицерина и кислот. Более того, в трех образцах содержание дейтерия в водной фракции вина оказалось ниже значений для поверхностных вод этого региона (145–150 млн–1), что нереально. Такой подход к выявлению фальсификации натуральных вин в последующие годы не применялся, как это следует из обзорной статьи 2015 года [7].
Разработанный нами алгоритм анализа прошел апробацию в 2017 году, когда из конкурсных вин выставки VINORUS, проходившей в Краснодаре совместно с 1-й Международной научно-технической конференцией "Инновационный мир современного виноградарства и виноделия: Россия – InnoWine Russia-2017", были отобраны образцы красного сухого вина сортов винограда "Каберне Совиньон" и "Мерло" 2015 года из различных регионов: Краснодарского края (№ 2–11), Крыма – Бахчисарай (№ 12), Волгоградской области (№ 13), Испании (№ 14). По спектрам ЯМР 1Н образцов измерены содержания в них этанола и глицерина (табл.1). Вклад в сигналы 1Н и 2Н воды гидроксильных и карбоксильных групп глицерина и других минорных компонентов вина не учитывали. В табл.1 приведены измеренные методом ЯМР относительные количества дейтерия в водной фракции различных вин. Для наглядности они представлены на рис.3 вместе с данными по содержанию 2Н в водопроводной воде Краснодара от 28 апреля 2017 года (№ 1). В водной фракции вина всех исследованных проб содержание дейтерия 2Н варьирует в диапазоне 159–167 млн–1. Исключение составили два образца вина "Каберне Совиньон" региона Тамани (№ 2 и 6) с пониженным содержанием дейтерия в воде, что можно объяснить составом воды источника, который использовали для орошения соответствующего винограда.
ЯМР-СПЕКТРОСКОПИЯ ДЕЙТЕРИЯ В ЭТАНОЛЕ ВИНОДЕЛЬЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ
Наиболее широкую известность и прикладное значение метод ЯМР 2Н получил в исследовании содержания дейтерия в метильной (D/H)I и метиленовой (D/H)II группах молекулы этанола для установления его природы.
Характеризация ВОР по содержанию дейтерия во фрагментах молекул этанола вина требует его количественного выделения. Для этого детально разработана соответст¬вующая процедура, так как в различных странах разрешено добавление в виноградное сусло экзогенных сахаров, в том числе из растений других ботанических видов.
В 1990 году Международной межправительственной организацией по виноградарству и виноделию OIV в Евро¬союзе в качестве официального принят впервые описанный в [8] метод SNIF-NMR [9]. К сегодняшнему дню накоплена значительная база научных знаний об интервалах изменения содержания дейтерия в метильной (D/H)I и метиленовой (D/H)II группах молекулы этанола виноградного происхождения. С учетом агроклиматических (географических) и технологических факторов минимальный и максимальный уровни для показателя (D/H)I в виноградном этаноле составляют 98,0 и 106,0 млн–1 соответственно, а для показателя (D/H)II – 121,0 и 136,0 млн–1. В эти диапазоны попадают также этанолы, выделенные из некоторых других фруктов, но не из сахарной свеклы (как и виноград входит в группу растений С3-пути фотосинтеза) и растений С4-пути фотосинтеза (кукуруза, сахарный тростник, сорго и др.) [10–11].
Метод SNIF-NMR требует использования спектрометров ЯМР, с рабочей частотой не менее 400 МГц для ядер 1Н и оснащенных датчиком для ампул 10 мм и системой стабилизации по сигналу ЯМР 19F.
В Центре коллективного пользования (Научно-образовательном центре) РУДН для решения задачи по исследованию природы этанола в продуктах виноделия используется модифицированный метод SNIF-NMR, основанный на авторской разработке [12] для стандартных спектрометров ЯМР.
Одна из его особенностей состоит в том, что стабилизация условий резонанса по сигналу 19F не применяется, поэтому за счет небольшого дрейфа сигналов измерение содержания дейтерия в СН2- (D/H)II и СН3- (D/H)I фрагментах молекул этанола по высоте соответствующих пиков имеет большие погрешности. Однако это практически не влияет на площади, измеряемые, как это принято в количественной спектроскопии ЯМР, по интегральной, а не пиковой интенсивности. Несомненное преимущество такого подхода перед методом [9] состоит в том, что содержание дейтерия в гидроксильной группе ОН выделенного этанола или остаточной воды можно измерять по интенсивности сигналов, которые за счет обменных процессов всегда имеют большую ширину, чем у дейтерия 2Н в метильной СН3 (D/H)I и метиленовой СН2 (D/H)II групп. Поскольку содержание дейтерия в гидроксильной группе определяется исключительно водной фракцией вина, в детальном анализе спектра ЯМР 1Н необходимости нет. Достаточно измерить плотность раствора аналита для оценки содержания в этаноле остаточной воды. Другая особенность разработанного метода при измерении природного содержания изотопа 2Н – применение в качестве калибровочной добавки обезвоженного диметилсульфоксида (ДМСО) с повышенным на два порядка содержанием дейтерия, что в 10 раз (с 30 об. % в случае метода [9] до 3 об. %) уменьшает объемную долю калибровочного вещества и, тем самым, вдвое сокращает время регистрации ЯМР-спектра. Суммарная погрешность такого способа обеспечивает прецизионность измеряемых значений ± 3%, что вполне достаточно для оценки природы этанола.
Разработку метода и его апробацию выполняли на спектрометре JEOL JNM-ECA 600 (Япония) с рабочей частотой для ядер 1Н 600 МГц и для ядер 2Н 92,102 МГц. Прибор снабжен системой автоматической замены образцов и имеет датчики 5 и 10 мм (рис.4). В работе использовали откалиброванные ампулы диаметром (4,97 ± 0,013) мм и длиной 178 мм. В качестве внутреннего стандарта для количественного определения компонентов при регистрации спектров ЯМР 1Н использовали триметилсилилпропианат натрия-d4 (ТСП), отклик метильных протонов которого не перекрывается с сигналами анализируемых образцов. При регистрации спектров ЯМР 2Н в качестве внутреннего стандарта (3% об.) использовали ДМСО с искусственно повышенным на два порядка содержанием дейтерия. Типичный спектр представлен на рис.5. Для регистрации спектров на ядрах 2H выбраны следующие условия эксперимента: импульс 45°, усиление 72, смещение 5 м.д., развертка 11 м.д., 16К точек на спектр, время наблюдения спада свободной индукции 2 с, число сканирований 800, время задержки между импульсами 5 ∙ T1 (2D2O) ≥ 5 с. Для обработки спектра использовалась автоматическая коррекция базовой линии, ручная настройка фазы, экспонен¬циальное умножение на значение 2,0.
В табл.1 представлены усредненные данные пяти измерений содержания дейтерия 2Н в каждом образце, относительное стандартное отклонение для которых состав¬ляет 2%.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предложен новый метод совокупного ЯМР-скрининг-анализа (CS-NMR) для определения содержания дейтерия в воде различных водно-органических растворов, в том числе вина, винодельческой продукции, соков и т.п. Первый этап – регистрация количественных спектров ЯМР 1Н для определения содержания воды в образце, с учетом других идентифицированных компонентов раствора. Затем – получение спектра ЯМР 2Н, из которого рассчитывается содержание изотопа 2Н воды, как важной характеристики происхождения или аутентичности с контрольным образцом. Не требующий пробоподготовки метод удобен при быстром скрининге многих водно-органических объектов. Детальное определение изотопного состава водорода других компонентов ВОР после их выделения может выполняться на стандартном оборудовании по более быстрой оригинальной методике.
Для исследования природы этанола винодельческой и другой спиртосодержащей продукции в Центре коллективного пользования (НОЦ) РУДН применяется модифицированный метод ЯМР, который основан на определении содержания дейтерия в метильной (показатель (D/H)I) и метиленовой (показатель (D/H)II) группах молекулы спирта. Количественные данные о содержании дейтерия в метильной группе (D/H)I) спирта позволяют сделать вывод не только о ботаническом виде растения, но и о географическом регионе его происхождения, а также о природе воды, участвовавшей в процессе брожения углеводов с образованием этанола. Данные о дейтерии в метиленовой группе (D/H)II спирта свидетельствуют о климатических условиях произрастания растения (например, винограда).
* Публикация подготовлена при поддержке Программы РУДН "5-100".
ЛИТЕРАТУРА
1. Hachey D.I., Wong W.W., Boutton T.W., Klein P.D. Isotope ratio measurements in nutrition and biomedical research // Mass Spectrometry Reviews. 1987. V. 6. P. 289–328. DOI 10.1002/mas.1280060203
2. Scrimgeour C.M., Rollo M.M., Mudambo S.M., Handley L.I., Prosser S.J. A simplified method for deuterium/hydrogen isotope ratio measurements on water samples of biological origin // Biological Mass Spectrometry/ 1993. 22. P. 383–387. DOI 10.1002/bms.1200220704
3. Ma X., Deng P., Wang X., Zhang C., Hou X. Direct determination of deuterium of wide concentration range in water by Nuclear Magnetic Resonance // Talanta. 2012. 97. P. 450–455.
4. Джимак С.С., Басов А.А., Федулова Л.В., Быков И.М., Ивлев В.А., Мелконян К.И., Тимаков А.А. Определение концентрации дейтерия в биологических жидкостях с помощью ЯМР-спектроскопии // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2016. 50(3). C. 42–47.
5. Varcarcel M., Caerdenas S., Gallego M. Sample screening systems in analytical chemistry // Trends in Analytical Chemistry. 1999. 18(11). P. 685–694.
6. Калабин Г.А., Козлов Ю.П., Рыков Р.С., Кулагина Н.В., Кушнарев Д.Ф., Рохин А.В. Новый алгоритм идентификации натуральных вин Грузии методом спектроскопии ЯМР // Вестник РУДН. Серия "Экология и безопасность жизнедеятельности". 2003. 9. C. 77–82.
7. Christoph N., Hermann A., Wachter H. 25 Years authentication of wine with stable isotope analysis in the European Union – Review and outlook // BIO Web of Conferences. 2015. 5. 02020. 8 p.
8. Martin G.J., Martin M.L., Mabon F., Michon M.J. Identification of the origin of natural alcohols by natural abundance hydrogen-2 nuclear magnetic resonance // Analytical Chemistry. 1982. 54. P. 2380–2382.
9. EC-Regulation 2676/1990 // Official Journal of the European Community. 1990. 64. L272.
10. Christoph C.B., Wachter H., Christoph N., Rossmann A., Adam L. Assignment of raw material and authentication of spirits by gas chromatography, hydrogen- and carbon-isotope ratio measurements I. Analytical methods and results of a study of commercial products // Zeitschrift fuer Lebensmitteluntersuchung und – forschung A. 1997. 204. P. 445–452.
11. Perini M., Guzzon R., Simoni M., Malacarne M., Lar¬cher R., Camin F. The effect of stopping alcoholic fermentation on the variability of H, C and O stable isotope ratios of ethanol // Food Control. 2014. 40. P. 368–373.
12. Калабин Г.А., Кулагина Н.В., Рыков Р.С., Козлов Ю.П., Кушнарев Д.Ф., Рохин А.В. Идентификация сырьевой природы этанола методом спектроскопии ЯМР // Вестник РУДН. Серия "Экология и безопасность жизнедеятельности". 2003. 7. С. 87–98.
Отзывы читателей
