eng
Выпуск #6/2019
К. С. Сычев
Применение ионной высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармацевтическом анализе
Применение ионной высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармацевтическом анализе
Просмотры: 2827
Показаны примеры применения ионной хроматографии для фармацевтического анализа: контроля качества лекарственных средств, скрининга и выделения примесей, фармакокинетических исследований. Описаны сложности работы с ион-парной хроматографией, отмечена нестабильность и плохая воспроизводимость получаемых результатов. Обсуждаются способы улучшения симметрии пиков с помощью специальной обработки колонки и особого температурного режима проведения хроматографического разделения. Представлены хроматограммы с применением неподвижной фазы I.B.S.pharm MA. Приведено резюме преимуществ ионных разделений для лабораторий отделов контроля качества (ОКК) и научно-исследовательских разработок (НИР) на фармацевтических производствах.
Теги: group selectivity ion high-performance liquid chromatography isocratic separation stationary phase групповая селективность изократическое разделение ионная высокоэффективная жидкостная хроматография неподвижная фаза
Показаны примеры применения ионной хроматографии для фармацевтического анализа: контроля качества лекарственных средств, скрининга и выделения примесей, фармакокинетических исследований. Описаны сложности работы с ион-парной хроматографией, отмечена нестабильность и плохая воспроизводимость получаемых результатов. Обсуждаются способы улучшения симметрии пиков с помощью специальной обработки колонки и особого температурного режима проведения хроматографического разделения. Представлены хроматограммы с применением неподвижной фазы I.B.S.pharm MA. Приведено резюме преимуществ ионных разделений для лабораторий отделов контроля качества (ОКК) и научно-исследовательских разработок (НИР) на фармацевтических производствах.
Введение
На сегодняшний момент ионная жидкостная хроматография – наиболее недооцененная ВЭЖХ‑техника для фармацевтического анализа.
Как правило, ионная хроматография прочно ассоциируется с неорганическими анионами и кондуктометрическим детектированием. В то же время ионный принцип отлично подходит для разделения любых органических ионов на стандартном ВЭЖХ‑оборудовании с УФ, флуориметрическим или рефрактометрическим детекторами.
Подавляющее большинство фармацевтиков в водных средах с рН от нейтрального до кислого – органические ионы. Таким образом, потенциал ионной хроматографии для фармацевтического анализа огромен, однако ее реальное применение, судя по EP (Европейская фармакопея) и USP (фармакопея США), ограничено единичными приложениями. Чем объяснить сложившуюся ситуацию?
При внимательном рассмотрении выясняется, что на самом деле порядка 20% фармакопейных методик выполнено в режиме ионной хроматографии. Это не бросается в глаза, поскольку для анализа применяют формально обращенные фазы в комбинации с подвижными фазами, содержащими ионные ПАВ – так называемые ион-парные добавки. Любой «тяжелый» ион-парный реагент (С6-С10 сульфонаты, ТБА и т. д.) фактически превращает обращенную фазу в ионную; этот процесс называется динамическим модифицированием.
Итак, ионная хроматография применяется в фармацевтике, но основным способом ее реализации является ион-парная хроматография. Как это произошло? Какими преимуществами и недостатками обладает ион-парная хроматография?
Ответ на первый вопрос уходит корнями в 1980–90-е годы, когда ВЭЖХ внедрялась в фармацевтический анализ наиболее активно и было создано большинство фармакопейных разделений. Компании, производящие ВЭЖХ‑колонки, боролись за открывшийся огромный рынок сбыта. При этом успех таких фирм в основном определялся предложением более совершенных обращенно-фазовых (ОФ) колонок, способных решить до 80% всех аналитических задач. Таким образом, работа над оставшимися 20%, для которых ОФ‑хроматография не подходила, легла на плечи разработчиков ВЭЖХ‑методик.
И они сделали то, что могли в этой ситуации – приспособили обращенные фазы для нужд ионной хроматографии. Тем более, что преимущество ион-парной хроматографии (по всей видимости, единственное) заключается в возможности, при наличии времени и «золотых рук», достичь почти любой необходимой селективности, то есть расположить пики на хроматограмме любым требуемым образом.
К сожалению, «золотые руки» не масштабируются, и для многих лабораторий ОКК ион-парные разделения являются постоянным кошмаром, не позволяющим нормально работать и выдавать стабильные результаты.
Ион-парные разделения очень плохо воспроизводятся, а на кондиционирование колонок могут уходить дни. Аналитик заранее не знает, сможет ли он в следующий раз получить стабильный результат или нет и сколько на это уйдет времени, что совершенно недопустимо для заводской лаборатории как звена производственной цепочки в условиях непрерывного производства.
Сами реагенты дороги, их расход велик. Ион-парные системы генерируют множество мешающих определению системных сигналов, накладывают серьезные ограничения на состав дилюента для проб, несовместимы с масс-селективными и испарительными детекторами – список недостатков можно продолжать и дальше.
Таким образом, ион-парная хроматография – это вынужденная мера, которая была вызвана недостатком хороших ионных колонок и непониманием базовых принципов работы с ними. Такая ситуация во многом сохраняется и по сей день.
В меньшей степени это касается доступности ионных неподвижных фаз, их выпускают многие компании. В последнее время на рынке также начали появляться ионные фазы на основе поверхностно-пористого силикагеля (core-shell).
Гораздо хуже дело обстоит с пониманием принципов работы с ионными фазами на основе силикагеля. Ключевым моментом здесь является неосведомленность о том, что, в отличие от обращенно-фазовой, в ионной (а также гидрофильной, HILIC) хроматографии качество ионного разделения во многом определяется правильной промывкой и кондиционированием колонки. Попытка поставить «свежую» ионную колонку, заполненную изопропанолом, на анализ без проведения ее предварительной обработки неизбежно приведет к достаточно посредственному результату – пики будут в большей или меньшей степени асимметричны.
Перед применением ионной колонки на основе силикагеля из нее необходимо вытеснить изопропанол ацетонитрилом, а затем тщательно промыть колонку смесью ацетонитрила с водным буферным раствором в соотношении 1 : 1. Состав буферного раствора будет зависеть от состава применяемой подвижной фазы и обменной емкости ионной неподвижной фазы.
К примеру, сильные катиониты (SCX) на основе силикагеля, обладающие большой емкостью, перед применением целесообразно обрабатывать в достаточно жестких условиях. Для обработки подходит смесь ацетонитрила с буфером в соотношении 1 : 1, где в качестве буфера применяют 50-мМ водный раствор однозамещенного фосфата аммония с добавкой 0,5% фосфорной кислоты. В результате нескольких часов действия этой смеси негативное влияние микропор силикагельного материала в значительной мере подавляется, и пики становятся значительно симметричнее.
Для улучшения симметрии пиков также можно применять повышение температуры колонки до 40–45 °C. В этом случае для хроматографии на традиционных потоках 1,0–1,5 мл / мин нужен хороший – равномерный и быстрый – прогрев подвижной фазы перед входом в колонку.
Например, стандартный термостат ВЭЖХ‑колонок можно дополнить теплообменником «нулевого мертвого объема», позволяющим прогревать подвижную фазу до требуемых температур при объемной скорости потока до 1–3 мл / мин без видимого ухудшения эффективности и симметрии.
Условия эксперимента
Для хроматографического разделения применяли сильный катионит I.B.S.pharm MA в колонке размером 250 × 4,6 мм, упакованный 3-мкм частицами (I.B.S., Эстония). Неподвижная фаза поставляется уже промытой и обработанной, то есть готовой к применению без каких-либо дополнительных действий.
Эксперимент проводили на жидкостном хроматографе Sykam S600 (Sykam, Германия), укомплектованном сканирующим спектрофотометрическим детектором S3250, градиентным бинарным насосом S1132 HP, автосамплером S5300 со сборкой жидкостной системы в варианте для ионной хроматографии (I.B.S., Эстония), включающим контактный термостат колонок с высокоэффективным теплообменником.
Результаты и обсуждение
Неподвижная фаза I.B.S.pharm MA предназначена для определения органических низкомолекулярных соединений, либо одноосновных, либо амфотерных соединений основного характера, заряд которых в кислой среде не превышает +1.
К подобным соединениям можно отнести многие препараты для лечения заболеваний сердечнососудистой системы (бета-адреноблокаторы, блокаторы кальциевых каналов, антиаритмические средства, катехоламины), нервной системы (антидепрессанты группы СИОЗС, антипсихотические препараты – производные фенотиазина и пиперидина), дыхательной системы (бета-адреномиметики), антибиотики (амоксициллин, тилозин, тетрациклины и т. д.).
На рис. 1 приведена обзорная хроматограмма фармацевтических соединений различных классов, которые могут быть определены на сильном катионите.
Из этого рисунка видно основное отличие ионной хроматографии от обращенно-фазовой – объемный гидрофобный фрагмент не повышает удерживание, а умеренно снижает. В результате, любые однозарядные органические катионы различной гидрофобности элюируются в одном окне в изократических условиях.
По сравнению с обращенной фазой главным преимуществом ионного режима является высокая специфичность. Определение основных целевых фармацевтиков можно проводить в сложных матрицах напрямую, зачастую без пробоподготовки (рис. 2). При этом гидрофобные низко- и высокомолекулярные компоненты матрицы не загрязняют колонку и не мешают определению, что в принципе невозможно при использовании обращенно-фазовой хроматографии.
В отличие от ионного, обращенно-фазовое разделение демонстрирует низкую специфичность. При этом обращенно-фазовая колонка загрязняется компонентами матрицы образца, а на ионной колонке вся камедь элюируется в начале хроматограммы и не загрязняет колонку.
Ионный режим позволяет специфично определять в любых сложных матрицах, например биообразцах, остаточные количества антибиотиков (рис. 3 и 4). Это можно делать как с применением УФ‑детектора, так и с помощью высокочувствительного флуориметрического детектирования после постколоночной дериватизации любым подходящим реагентом.
Таким образом, в случае однозарядных целевых фармацевтиков и их метаболитов (первичных и вторичных аминов, карбоновых кислот) ионную хроматографию в сочетании с постколоночной дериватизацией и флуориметрическим детектированием можно применять для фармакокинетических исследований, составляя серьезную конкуренцию методу ВЭЖХ-МС.
Ионная хроматография может применяться не только для контроля качества лекарственных средств, но и БАДов; к примеру, ряд водорастворимых витаминов (рис. 5) и бетаинов (рис. 6) также может быть определен в ионном режиме.
Выводы
Ионные разделения отлично подходят для нужд лабораторий ОКК. Можно выделить три основных преимущества ионной хроматографии при рутинных определениях на потоке:
Как следствие, практическая работа заметно облегчается, так как при анализе мазей, пластырей, гелей, сиропов и т. д. не требуется пропободготовка. Колонка не загрязняется и из-за этого не выходит из строя. Применение ионной хроматографии не требует предколонок, если только матрица образца не содержит заряженные компоненты, по знаку совпадающие с целевыми соединениями.
По такому же принципу можно выделить два основных преимущества ионной хроматографии для лабораторий НИР при разработке ВЭЖХ‑методик и при проведении исследований:
удерживание в ионной хроматографии легко предсказывать – даже проще, чем в обращенно-фазовой хроматографии. Соединения со сравнимыми по величине зарядами одного знака элюируются в изократических условиях в одном окне. При этом удерживание уменьшается при увеличении гидрофобного участка молекулы.
По сути, определение на ионите является готовым решением для любой ВЭЖХ‑методики количественного определения основного действующего вещества, если в нейтральных или кислых условиях оно имеет заряд, не превышающий единицы.
Разделения в ионном режиме демонстрируют групповую селективность – это свойство хроматографической системы элюировать соединения определенного класса в одном окне, причем с очень высокой специфичностью. Групповая селективность необходима для скрининговых исследований образцов неизвестного состава (в фармацевтике такие задачи называются drug screening).
Ионная хроматография позволяет селективно выделять из комплексного образца, проявляющего биологическую активность, все соединения, имеющие определенный заряд, и далее исследовать их отдельно;
в ионной хроматографии на силикагельных фазах последние демонстрируют отличную нагружаемость (loadability).
В ионной хроматографии на силикагельных фазах можно добиваться весьма низких пределов определения, причем простым способом – за счет увеличения концентрации пробы и ее инжектируемого объема.
Ионные разделения легко масштабируются. Сочетание высокой нагружаемости и групповой селективности делает ионную хроматографию отличным выбором для препаративного выделения различных биологически активных компонентов и примесей с целью их дальнейшего изучения. ▪
Введение
На сегодняшний момент ионная жидкостная хроматография – наиболее недооцененная ВЭЖХ‑техника для фармацевтического анализа.
Как правило, ионная хроматография прочно ассоциируется с неорганическими анионами и кондуктометрическим детектированием. В то же время ионный принцип отлично подходит для разделения любых органических ионов на стандартном ВЭЖХ‑оборудовании с УФ, флуориметрическим или рефрактометрическим детекторами.
Подавляющее большинство фармацевтиков в водных средах с рН от нейтрального до кислого – органические ионы. Таким образом, потенциал ионной хроматографии для фармацевтического анализа огромен, однако ее реальное применение, судя по EP (Европейская фармакопея) и USP (фармакопея США), ограничено единичными приложениями. Чем объяснить сложившуюся ситуацию?
При внимательном рассмотрении выясняется, что на самом деле порядка 20% фармакопейных методик выполнено в режиме ионной хроматографии. Это не бросается в глаза, поскольку для анализа применяют формально обращенные фазы в комбинации с подвижными фазами, содержащими ионные ПАВ – так называемые ион-парные добавки. Любой «тяжелый» ион-парный реагент (С6-С10 сульфонаты, ТБА и т. д.) фактически превращает обращенную фазу в ионную; этот процесс называется динамическим модифицированием.
Итак, ионная хроматография применяется в фармацевтике, но основным способом ее реализации является ион-парная хроматография. Как это произошло? Какими преимуществами и недостатками обладает ион-парная хроматография?
Ответ на первый вопрос уходит корнями в 1980–90-е годы, когда ВЭЖХ внедрялась в фармацевтический анализ наиболее активно и было создано большинство фармакопейных разделений. Компании, производящие ВЭЖХ‑колонки, боролись за открывшийся огромный рынок сбыта. При этом успех таких фирм в основном определялся предложением более совершенных обращенно-фазовых (ОФ) колонок, способных решить до 80% всех аналитических задач. Таким образом, работа над оставшимися 20%, для которых ОФ‑хроматография не подходила, легла на плечи разработчиков ВЭЖХ‑методик.
И они сделали то, что могли в этой ситуации – приспособили обращенные фазы для нужд ионной хроматографии. Тем более, что преимущество ион-парной хроматографии (по всей видимости, единственное) заключается в возможности, при наличии времени и «золотых рук», достичь почти любой необходимой селективности, то есть расположить пики на хроматограмме любым требуемым образом.
К сожалению, «золотые руки» не масштабируются, и для многих лабораторий ОКК ион-парные разделения являются постоянным кошмаром, не позволяющим нормально работать и выдавать стабильные результаты.
Ион-парные разделения очень плохо воспроизводятся, а на кондиционирование колонок могут уходить дни. Аналитик заранее не знает, сможет ли он в следующий раз получить стабильный результат или нет и сколько на это уйдет времени, что совершенно недопустимо для заводской лаборатории как звена производственной цепочки в условиях непрерывного производства.
Сами реагенты дороги, их расход велик. Ион-парные системы генерируют множество мешающих определению системных сигналов, накладывают серьезные ограничения на состав дилюента для проб, несовместимы с масс-селективными и испарительными детекторами – список недостатков можно продолжать и дальше.
Таким образом, ион-парная хроматография – это вынужденная мера, которая была вызвана недостатком хороших ионных колонок и непониманием базовых принципов работы с ними. Такая ситуация во многом сохраняется и по сей день.
В меньшей степени это касается доступности ионных неподвижных фаз, их выпускают многие компании. В последнее время на рынке также начали появляться ионные фазы на основе поверхностно-пористого силикагеля (core-shell).
Гораздо хуже дело обстоит с пониманием принципов работы с ионными фазами на основе силикагеля. Ключевым моментом здесь является неосведомленность о том, что, в отличие от обращенно-фазовой, в ионной (а также гидрофильной, HILIC) хроматографии качество ионного разделения во многом определяется правильной промывкой и кондиционированием колонки. Попытка поставить «свежую» ионную колонку, заполненную изопропанолом, на анализ без проведения ее предварительной обработки неизбежно приведет к достаточно посредственному результату – пики будут в большей или меньшей степени асимметричны.
Перед применением ионной колонки на основе силикагеля из нее необходимо вытеснить изопропанол ацетонитрилом, а затем тщательно промыть колонку смесью ацетонитрила с водным буферным раствором в соотношении 1 : 1. Состав буферного раствора будет зависеть от состава применяемой подвижной фазы и обменной емкости ионной неподвижной фазы.
К примеру, сильные катиониты (SCX) на основе силикагеля, обладающие большой емкостью, перед применением целесообразно обрабатывать в достаточно жестких условиях. Для обработки подходит смесь ацетонитрила с буфером в соотношении 1 : 1, где в качестве буфера применяют 50-мМ водный раствор однозамещенного фосфата аммония с добавкой 0,5% фосфорной кислоты. В результате нескольких часов действия этой смеси негативное влияние микропор силикагельного материала в значительной мере подавляется, и пики становятся значительно симметричнее.
Для улучшения симметрии пиков также можно применять повышение температуры колонки до 40–45 °C. В этом случае для хроматографии на традиционных потоках 1,0–1,5 мл / мин нужен хороший – равномерный и быстрый – прогрев подвижной фазы перед входом в колонку.
Например, стандартный термостат ВЭЖХ‑колонок можно дополнить теплообменником «нулевого мертвого объема», позволяющим прогревать подвижную фазу до требуемых температур при объемной скорости потока до 1–3 мл / мин без видимого ухудшения эффективности и симметрии.
Условия эксперимента
Для хроматографического разделения применяли сильный катионит I.B.S.pharm MA в колонке размером 250 × 4,6 мм, упакованный 3-мкм частицами (I.B.S., Эстония). Неподвижная фаза поставляется уже промытой и обработанной, то есть готовой к применению без каких-либо дополнительных действий.
Эксперимент проводили на жидкостном хроматографе Sykam S600 (Sykam, Германия), укомплектованном сканирующим спектрофотометрическим детектором S3250, градиентным бинарным насосом S1132 HP, автосамплером S5300 со сборкой жидкостной системы в варианте для ионной хроматографии (I.B.S., Эстония), включающим контактный термостат колонок с высокоэффективным теплообменником.
Результаты и обсуждение
Неподвижная фаза I.B.S.pharm MA предназначена для определения органических низкомолекулярных соединений, либо одноосновных, либо амфотерных соединений основного характера, заряд которых в кислой среде не превышает +1.
К подобным соединениям можно отнести многие препараты для лечения заболеваний сердечнососудистой системы (бета-адреноблокаторы, блокаторы кальциевых каналов, антиаритмические средства, катехоламины), нервной системы (антидепрессанты группы СИОЗС, антипсихотические препараты – производные фенотиазина и пиперидина), дыхательной системы (бета-адреномиметики), антибиотики (амоксициллин, тилозин, тетрациклины и т. д.).
На рис. 1 приведена обзорная хроматограмма фармацевтических соединений различных классов, которые могут быть определены на сильном катионите.
Из этого рисунка видно основное отличие ионной хроматографии от обращенно-фазовой – объемный гидрофобный фрагмент не повышает удерживание, а умеренно снижает. В результате, любые однозарядные органические катионы различной гидрофобности элюируются в одном окне в изократических условиях.
По сравнению с обращенной фазой главным преимуществом ионного режима является высокая специфичность. Определение основных целевых фармацевтиков можно проводить в сложных матрицах напрямую, зачастую без пробоподготовки (рис. 2). При этом гидрофобные низко- и высокомолекулярные компоненты матрицы не загрязняют колонку и не мешают определению, что в принципе невозможно при использовании обращенно-фазовой хроматографии.
В отличие от ионного, обращенно-фазовое разделение демонстрирует низкую специфичность. При этом обращенно-фазовая колонка загрязняется компонентами матрицы образца, а на ионной колонке вся камедь элюируется в начале хроматограммы и не загрязняет колонку.
Ионный режим позволяет специфично определять в любых сложных матрицах, например биообразцах, остаточные количества антибиотиков (рис. 3 и 4). Это можно делать как с применением УФ‑детектора, так и с помощью высокочувствительного флуориметрического детектирования после постколоночной дериватизации любым подходящим реагентом.
Таким образом, в случае однозарядных целевых фармацевтиков и их метаболитов (первичных и вторичных аминов, карбоновых кислот) ионную хроматографию в сочетании с постколоночной дериватизацией и флуориметрическим детектированием можно применять для фармакокинетических исследований, составляя серьезную конкуренцию методу ВЭЖХ-МС.
Ионная хроматография может применяться не только для контроля качества лекарственных средств, но и БАДов; к примеру, ряд водорастворимых витаминов (рис. 5) и бетаинов (рис. 6) также может быть определен в ионном режиме.
Выводы
Ионные разделения отлично подходят для нужд лабораторий ОКК. Можно выделить три основных преимущества ионной хроматографии при рутинных определениях на потоке:
- результаты стабильны – времена удерживания не «плывут», это нехарактерно для ионной хроматографии;
- разделения робастны – небольшие погрешности в приготовлении подвижной фазы никак не влияют ни на селективность, ни на удерживание, ни на разрешение;
- никакие гидрофобные соединения, включая нейтральные ПАВ и полимеры, не удерживаются в ионном режиме.
Как следствие, практическая работа заметно облегчается, так как при анализе мазей, пластырей, гелей, сиропов и т. д. не требуется пропободготовка. Колонка не загрязняется и из-за этого не выходит из строя. Применение ионной хроматографии не требует предколонок, если только матрица образца не содержит заряженные компоненты, по знаку совпадающие с целевыми соединениями.
По такому же принципу можно выделить два основных преимущества ионной хроматографии для лабораторий НИР при разработке ВЭЖХ‑методик и при проведении исследований:
удерживание в ионной хроматографии легко предсказывать – даже проще, чем в обращенно-фазовой хроматографии. Соединения со сравнимыми по величине зарядами одного знака элюируются в изократических условиях в одном окне. При этом удерживание уменьшается при увеличении гидрофобного участка молекулы.
По сути, определение на ионите является готовым решением для любой ВЭЖХ‑методики количественного определения основного действующего вещества, если в нейтральных или кислых условиях оно имеет заряд, не превышающий единицы.
Разделения в ионном режиме демонстрируют групповую селективность – это свойство хроматографической системы элюировать соединения определенного класса в одном окне, причем с очень высокой специфичностью. Групповая селективность необходима для скрининговых исследований образцов неизвестного состава (в фармацевтике такие задачи называются drug screening).
Ионная хроматография позволяет селективно выделять из комплексного образца, проявляющего биологическую активность, все соединения, имеющие определенный заряд, и далее исследовать их отдельно;
в ионной хроматографии на силикагельных фазах последние демонстрируют отличную нагружаемость (loadability).
В ионной хроматографии на силикагельных фазах можно добиваться весьма низких пределов определения, причем простым способом – за счет увеличения концентрации пробы и ее инжектируемого объема.
Ионные разделения легко масштабируются. Сочетание высокой нагружаемости и групповой селективности делает ионную хроматографию отличным выбором для препаративного выделения различных биологически активных компонентов и примесей с целью их дальнейшего изучения. ▪
Отзывы читателей
