eng
Выпуск #3/2021
А. Г. Талибова, В. С. Файнберг, М. Ю. Ганин, О. В. Федосеенко, С. С. Мозговая, С. В. Овчинников
Применение изотопной масс-спектрометрии для выявления фактов фальсификации и определения места происхождения продуктов пчеловодства
Применение изотопной масс-спектрометрии для выявления фактов фальсификации и определения места происхождения продуктов пчеловодства
Просмотры: 1796
DOI: 10.22184/2227-572X.2021.11.3.202.207
Приведены результаты исследования изотопного состава различных сортов меда согласно Протоколу анализа АОАС 998.12, который широко применяется в ЕС, США, Канаде, Австралии и других странах в течение многих лет. Обсуждается основанная на оценке изотопных отношений ряда легких элементов методика выявления фальсифицированной продукции пчеловодства и подтверждения региона их происхождения. Для измерений рекомендуется применение ВЭЖХ–IRMS – изотопного масс-спектрометра Elementar (Англия). Показаны преимущества предложенного метода по сравнению с другими способами оценки качества и подлинности происхождения меда.
Приведены результаты исследования изотопного состава различных сортов меда согласно Протоколу анализа АОАС 998.12, который широко применяется в ЕС, США, Канаде, Австралии и других странах в течение многих лет. Обсуждается основанная на оценке изотопных отношений ряда легких элементов методика выявления фальсифицированной продукции пчеловодства и подтверждения региона их происхождения. Для измерений рекомендуется применение ВЭЖХ–IRMS – изотопного масс-спектрометра Elementar (Англия). Показаны преимущества предложенного метода по сравнению с другими способами оценки качества и подлинности происхождения меда.
Теги: bee products c3 plants c4 plants honey hplc isotope mass spectrometer isotopic composition вэжх-изотопный масс-спектрометр изотопный состав мед продукты пчеловодства с3 растения с4 растения
Применение изотопной масс-спектрометрии для выявления фактов фальсификации и определения места происхождения продуктов пчеловодства
А. Г. Талибова , В. С. Файнберг к. т. н., М. Ю. Ганин, О. В. Федосеенко , С. С. Мозговая , С. В. Овчинников
Приведены результаты исследования изотопного состава различных сортов меда согласно Протоколу анализа АОАС 998.12, который широко применяется в ЕС, США, Канаде, Австралии и других странах в течение многих лет. Обсуждается основанная на оценке изотопных отношений ряда легких элементов методика выявления фальсифицированной продукции пчеловодства и подтверждения региона их происхождения. Для измерений рекомендуется применение ВЭЖХ–IRMS – изотопного масс-спектрометра Elementar (Англия). Показаны преимущества предложенного метода по сравнению с другими способами оценки качества и подлинности происхождения меда.
Ключевые слова: изотопный состав, мед, продукты пчеловодства, С3‑растения, С4‑растения, ВЭЖХ-изотопный масс-спектрометр
Статья получена 15.05.2021
Принята к публикации 03.06.2021
Пчелиный мед – это естественный продукт жизнедеятельности растений и пчел, содержащий широкий спектр химических соединений, таких как углеводы, белки, аминокислоты, макро- и микроэлементы в виде минеральных солей.
Сегодня в условиях возросшего потребления продуктов пчеловодства их получают в промышленных масштабах с применением различных технологических схем. Поэтому большое значение имеет контроль качества продуктов пчеловодства, и, в особенности, меда, на тех или иных стадиях производства по целому комплексу показателей. Поскольку достаточно просто фальсифицировать мед всевозможными посторонними примесями: мелом, крахмалом, сахарным сиропом, различными патоками или же путем подкормки пчел сахаром, то первостепенная задача при оценке качества состоит в подтверждении натуральности продукта и его естественного происхождения.
Известны различные методы оценки качества меда, ни один из которых в индивидуальном применении не может однозначно выявить подлинность и натуральность происхождения продукта. На сегодняшний день внимание разработчиков аналитических экспертных методик приковано к более широкому применению данных о стабильных изотопах при проверке натуральности продуктов пчеловодства, определении региона происхождения меда, а также решении задач по выявлению сортовой фальсификации.
Возможность использования информации об изотопном составе углерода, азота, водорода и кислорода связана с уникальной способностью многих растений к фракционированию.
Изотопный состав углерода обычно численно характеризуется параметром под названием «дельта изотопного состава» – δ13С, который рассчитывается в ‰ по формуле:
δ13С = 1 000 (R1 – R2) / R2,
где R1 – отношение 13С / 12С в исследуемом образце,
R2 – отношение 13С / 12С в стандартном образце.
Аналогичные соотношения используют для определения изотопного состава N, O, H и т. д.
Все публикуемые значения δ13С обычно приведены к международному образцу VPDB, представляющему собой кальцит окаменелости Belemnitella Americana мелового возраста, а δD и δ18О к VSMOW – международному стандарту океанической воды.
Для фотосинтезирующих растений различают циклы: Кальвина с образованием в качестве первичного продукта трехуглеродной фосфороглицериновой кислоты (наиболее распространенные растения С3‑типа) и Хетч-Слека, при котором первичными продуктами оказываются четырехуглеродные соединения малат и аспартат, как пути ассимиляции СО2 (в основном высшие покрытосеменные С4‑растения, такие как кукуруза, сорго, сахарный тростник) [2].
Диапазоны колебаний изотопного состава растений этих двух типов различны и даже не перекрываются. В наземных С3‑растениях δ13С варьирует от –21 до –33‰, углерод С4‑растений значительно тяжелее, δ13С в них колеблется от –10 до –18‰. Различие в изотопных эффектах углерода растений С3 и С4 позволяет однозначно идентифицировать не только сами растения и их плоды, но и продукты их переработки [1, 2].
Пчелы собирают пыльцу и нектар, как правило, с растений С3‑типа. Поэтому натуральный мед характеризуется средней величиной δ13С порядка –26‰ (табл. 1).Если мед разбавлен сиропом (кукурузным или из сахарного тростника, для которых δ13С составляет порядка –13 ÷ –11‰), или же производилась подкормка пчел полученным из растений С4‑типа сахаром, а также при сборе пчелами нектара преимущественно с таких растений, то изотопный состав углерода меда будет промежуточным – между –26‰ и –11‰. При этом, очевидно, известные в России традиционные сорта меда: липовый, гречишный, акациевый – должны иметь изотопный состав углерода, характерный для высших растений С3‑типа [1, 3, 5, 6].
В натуральном меде белковая и углеводная составляющие образовались одновременно и из одного источника, поэтому изотопное распределение углерода в них должно быть одинаковое. Отличие в данных изотопного состава будет говорить о фальсификации меда сахаром или сиропом. Согласно принятому в ЕС регламенту изотопный состав меда на выявление фальсификации с добавлением сахаров по методике АОАС 998.12 предполагает измерение и сравнение данных изотопного состава меда (преобладает углеводная составляющая) и его белковой фракции (рис. 1). При различии данных более, чем в 1‰, делается однозначный вывод о фальсификации. Также мед считается фальсифицированным, если процент содержания C4-сахара (СС4 сахар) в образце меда больше 7% или меньше –7%, согласно следующей формуле:
СС4сахар = 100(δ13Сбелок – δ13Смед) / (δ13Сбелок – (– 9,7)), %,
где δ13Сбелок– значение δ13С для белковой части меда, δ13Смед– значение δ13С для меда, а –9,7 – среднее значение δ13С для кукурузного сиропа.
Протокол анализа АОАС 998.12 широко применяется в ЕС, США, Канаде, Австралии и других странах в течение многих лет. Для различных сортов меда созданы базы изотопных данных, которые защищают производителя и конечного потребителя от вероятных подделок, связанных с регионом происхождения или сортом меда [4, 7, 8, 10].
К сожалению, в России и странах ТС на сегодняшний день не существует подобного регламента. В работе представлены результаты проверки согласно АОАС 998.12 различных российских и импортных образцов меда, представленных в розничной продаже в Москве (табл. 2).
Методика анализа
Белковую составляющую меда выделяли в соответствии с европейским протоколом AOAC 998.12. Для этого образец меда массой навески 10–12 г помещали в специальную пробирку (50 мл) для центрифуги, смешивали с 4 мл воды и затем добавляли 2 мл 0,335 моль / л H2SO4 и 2 мл 10% Na2WO4. Полученную смесь гомогенизировали, нагревали до 80 °C на водяной бане до флокуляции белков. В результате получали белковые частицы, достаточные для осаждения в прозрачной жидкости. Процесс контролировали визуально.
Затем раствор доводили водой до метки 50 мл, тщательно перемешивали, а затем помещали в центрифугу. Процесс разделения проводили при скорости вращения барабана 1 500 об / мин в течение 5 мин. В тех случаях, когда белок не осаждался, увеличивали скорость вращения до 10 000 об / мин. Разница в изотопном составе углерода белков С13, полученных из одного и того же меда при скоростях вращения центрифуги 1 500 и 10 000 об / мин, не превышала 0,2‰.
В результате получали белковый осадок. Процедуру повторяли не менее пяти раз, пока жидкость не становилась прозрачной, после чего ее удаляли. Осажденный белок сушили в сушильном шкафу до полного высыхания при температуре 75 °C не менее 8 ч.
Определение изотопного состава углерода в образцах проводили на специализированном масс-спектрометре для анализа изотопов легких элементов в газовой фазе в режиме онлайн с линией пробоподготовки (перевод образца в газ СО2 путем окисления) – элементный анализатор, в постоянном потоке газа-носителя (рис. 2). В качестве образца сравнения использовали стандартные образцы: целлюлоза IAEA-CH‑3 и сахароза IAEA-CH‑6 с известным изотопным составом (МАГАТЭ, Австрия). Масса навески пробы, помещаемой в барабан автодозатора, лежала в диапазоне 450–550 мкг. В ходе предварительных исследований оптимизирован режим работы аналитического комплекса для определения изотопного состава. Расчеты проводили автоматически на компьютерной рабочей станции в специализированном программном обеспечении. Результаты измерений регистрировались в графической и цифровой формах. Полученный результат выражался в промилле (‰) в виде показателя изотопного состава δ13С относительно мирового эталона – стандарта углерода VPDB. Полученные данные представлены в табл. 2.
В ходе исследований была успешно отработана методика, получены данные изотопного состава различных образцов меда. Среди исследованных проб выявлены фальсификаты, наличие которых невозможно обнаружить применяемыми и утвержденными на сегодняшний день в России и ТС для контроля качества меда методами [4, 5, 9, 10].
Применение данных изотопного состава легких элементов в меде и продуктах пчеловодства дает широкие возможности для исследований и создания новых регламентов контроля качества и происхождения продукции – сортовое разнообразие и регион происхождения (табл. 3).
Например, для быстрой сортовой идентификации-скрининга (мед с источником происхождения нектара с С3‑растений) анализ изотопного состава углерода можно проводить, не разделяя мед на белки и углеводы, так как даже незначительная примесь внесенного сахара С4 (тростниковый, кукурузный) в результате непосредственного добавления в мед заявленного происхождения, либо в виде кормовой прикормки для пчел будет отражаться на валовом изотопном составе углерода (рис. 3). Поэтому, образцы меда, имеющие δ13С со значениями выше, чем –23‰, будут считаться подозрительными. Кроме того, отсутствие манипуляций по разделению меда на белковую и углеводную фракции существенно снижает стоимость анализа на возможную фальсификацию [3, 4, 5].
В табл. 3 представлены измеренные величины δ13С для образцов меда, отобранных в различных районах Алтайского края, Новосибирской области и др.
Диапазон данных изотопного состава углерода исследуемых образцов меда составил от –25,57 до –28,02‰, что может свидетельствовать об их натуральном происхождении.
Выявлены различия между сотовым медом (δ13С = –26,93‰) и пчелиным воском тех же сот (δ13С = –28,74‰), которые, вероятно, могут быть следствием фракционирования углерода на стадиях пчелиного метаболизма (табл. 1). Этот результат может заинтересовать специализирующиеся на изучении пчел, их метаболизма и продуктах пчеловодства организации, например Институт Пчеловодства.
Мед из Бишкека (δ13С = –22,93‰) либо фальсифицирован добавлением сахара, либо имеет типичный для региона изотопный состав углерода, так как доля С4‑растений и растений смешанного типа фотосинтеза САМ (Crassulacean Acid Metabolism) в засушливых жарких районах выше. В данном случае необходимо провести дополнительное исследование с выделением белковой части [1, 2, 5, 6].
Для четкой дифференциации места происхождения меда перспективно использование изотопной системы дейтерий – кислород 18 (δD и δ18О). Питающие растительность определенного региона природные воды имеют индивидуальные изотопные составы водорода и кислорода, отражающие генезис и происхождение водной системы (табл. 4). Такая уникальная метка находит отражение в растениях [2].
Для более широкого применения данных изотопного состава углерода, кислорода, водорода и азота в меде в качестве метки, отражающей географическое происхождение и сорт, необходимо составление и сопоставление информационной базы данных изотопного состава перечисленных элементов в меде, воде и растительности, типичной для территории Российской Федерации и стран ТС. Подобная информационная база поможет идентифицировать мед по месту происхождения и установить региональный диапазон колебаний изотопного состава, что даст возможность экспертно выявлять фальсификацию продуктов пчеловодства.
На сегодняшний день компания «МС-АНАЛИТИКА» предлагает законченное приборное решение на базе оборудования Elementar (Англия) для изучения и рутинного применения в лабораториях по контролю качества меда с методической поддержкой и сервисным сопровождением. Elementar – единственная компания, которая производит специализированный для исследований меда комплекс ВЭЖХ – изотопный масс-спектрометр, включающий программное обеспечение для обработки и базу изотопных данных по меду различного региона происхождения.
Сопряжение изотопного масс-спектрометра с ВЭЖХ позволяет определять изотопный состав в индивидуальных сахарах меда (трисахариды, дисахариды, глюкоза, фруктоза), с предварительным разделением на хроматографической колонке (табл. 5, рис. 4) [8, 11]. Все оборудование внесено в Реестр средств измерений РФ.
Литература
Галимов Э. М. Природа биологического фракционирования изотопов. М.: Наука, 1981.
Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимических адаптаций. М.: Мир, 1988.
Колеснов А. Ю., Мойсеяк М. Б., Талибова А. Г. Масс-спектрометрические исследования состава стабильных изотопов углерода 13С и 12С в сахарах различного происхождения. Сахар. 2011;(8):39–45.
Талибова А. Г., Колеснов А. Ю. Исследование стабильных изотопов для оценки качества и безопасности пищевых продуктов. Ч. 2. Углерод.Хранение и переработка сельхозсырья.2010;(12):51–54.
Ветрова О. В., Калашникова Д. А., Мелков В. Н., Симонова Г. В Выявление фальсификации меда сахарными сиропами методом масс-спектрометрии стабильных изотопов. Журн. аналит. химии. 2017;72(7):645.
Калашникова Д. А., Симонова Г. В. Отношения стабильных изотопов 13С / 12С и 15N / 14N в образцах подмора медоносных пчел и в продуктах их жизнедеятельности. Журн. аналит. химии. 2021;76(4):359–368.
Ruoff K., Bogdanov S. (2004) Authenticity of honey and other bee products. Apiacta. 2004;38:317–327.
JRC Technical Reports Results of honey authenticity testing by liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Ref. Ares (2016)6932951–13 / 12 / 2016, https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/safety/docs/oc_control-progs_honey_jrc-tech-report_2016.pdf, last accessed Mar 24, 2017.
Tosun M. Detection of adulteration in honey samples added various sugar syrups with 13C / 12C isotope ratio analysis method. Food Chem. 2013;138(2–3):1629–1632. doi: 10.1016/j.foodchem.
2012.11.068. Epub 2012 Nov 24. PMID: 23411291.
AOAC. Official methods of analysis method 998.12: C‑4 plant sugars in honey. Internal standard stable carbon isotope ratio method.AOAC International, 1998.
Cabanero A. I., Recio J. L., Rupérez M. Liquid Chromatography Couples to Isotope Ratio Mass Spectrometry: A New Perspective on Honey Adulteration Detection.J.Agric. Food Chem. 2006;54:9719–9727.
References
Galimov E. M. The nature of biological isotope fractionation. M.: Nauka publ., 1981.
Khochachka P., Somero Dzh. Biochemical adaptation strategy. M.: Mir publ., 1988.
Kolesnov A. Yu., Moiseyak M. B., Talibova A. G. Mass spectrometric studies of the composition of stable carbon isotopes 13C and 12C in sugars of various origins. Sakhar – Sugar. 2011;(8):39–45.
Talibova A. G., Kolesnov A. Yu. Study of stable isotopes for the assessment of food quality and safety. Part 2. Carbon. Khranenie i pererabotka sel.khozsyr.ya – Storage and processing of agricultural raw materials. 2010;(12):51–54.
Vetrova O. V., Kalashnikova D. A., Melkov V. N., Simonova G. V. Detection of falsification of honey with sugar syrups by stable isotope mass spectrometry. Zhurn. analit. Khimii – Journal of Analytical Chemistry. 2017;72(7):645.
Kalashnikova D. A., Simonova G. V. Ratios of stable isotopes 13С / 12С and 15N / 14N in samples of dead honey bees and in products of their vital activity. Zhurn. analit. Khimii – Journal of Analytical Chemistry.2021;76(4):359–368.
Ruoff K., Bogdanov S. (2004) Authenticity of honey and other bee products. Apiacta. 2004;38:317–327.
JRC Technical Reports Results of honey authenticity testing by liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Ref. Ares(2016)6932951–13/12/2016, https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/safety/docs/oc_control-progs_honey_jrc-tech-report_2016.pdf, last accessed Mar 24, 2017.
Tosun M. Detection of adulteration in honey samples added various sugar syrups with 13C / 12C isotope ratio analysis method. Food Chem. 2013;138(2–3):1629–1632. doi: 10.1016 / j.foodchem.
2012.11.068. Epub 2012 Nov 24. PMID: 23411291.
AOAC. Official methods of analysis method 998.12: C‑4 plant sugars in honey. Internal standard stable carbon isotope ratio method. AOAC International, 1998.
Cabanero A. I., Recio J. L., Rupérez M. Liquid Chromatography Couples to Isotope Ratio Mass Spectrometry: A New Perspective on Honey Adulteration Detection.J.Agric. Food Chem. 2006;54:9719–9727.
А. Г. Талибова , В. С. Файнберг к. т. н., М. Ю. Ганин, О. В. Федосеенко , С. С. Мозговая , С. В. Овчинников
Приведены результаты исследования изотопного состава различных сортов меда согласно Протоколу анализа АОАС 998.12, который широко применяется в ЕС, США, Канаде, Австралии и других странах в течение многих лет. Обсуждается основанная на оценке изотопных отношений ряда легких элементов методика выявления фальсифицированной продукции пчеловодства и подтверждения региона их происхождения. Для измерений рекомендуется применение ВЭЖХ–IRMS – изотопного масс-спектрометра Elementar (Англия). Показаны преимущества предложенного метода по сравнению с другими способами оценки качества и подлинности происхождения меда.
Ключевые слова: изотопный состав, мед, продукты пчеловодства, С3‑растения, С4‑растения, ВЭЖХ-изотопный масс-спектрометр
Статья получена 15.05.2021
Принята к публикации 03.06.2021
Пчелиный мед – это естественный продукт жизнедеятельности растений и пчел, содержащий широкий спектр химических соединений, таких как углеводы, белки, аминокислоты, макро- и микроэлементы в виде минеральных солей.
Сегодня в условиях возросшего потребления продуктов пчеловодства их получают в промышленных масштабах с применением различных технологических схем. Поэтому большое значение имеет контроль качества продуктов пчеловодства, и, в особенности, меда, на тех или иных стадиях производства по целому комплексу показателей. Поскольку достаточно просто фальсифицировать мед всевозможными посторонними примесями: мелом, крахмалом, сахарным сиропом, различными патоками или же путем подкормки пчел сахаром, то первостепенная задача при оценке качества состоит в подтверждении натуральности продукта и его естественного происхождения.
Известны различные методы оценки качества меда, ни один из которых в индивидуальном применении не может однозначно выявить подлинность и натуральность происхождения продукта. На сегодняшний день внимание разработчиков аналитических экспертных методик приковано к более широкому применению данных о стабильных изотопах при проверке натуральности продуктов пчеловодства, определении региона происхождения меда, а также решении задач по выявлению сортовой фальсификации.
Возможность использования информации об изотопном составе углерода, азота, водорода и кислорода связана с уникальной способностью многих растений к фракционированию.
Изотопный состав углерода обычно численно характеризуется параметром под названием «дельта изотопного состава» – δ13С, который рассчитывается в ‰ по формуле:
δ13С = 1 000 (R1 – R2) / R2,
где R1 – отношение 13С / 12С в исследуемом образце,
R2 – отношение 13С / 12С в стандартном образце.
Аналогичные соотношения используют для определения изотопного состава N, O, H и т. д.
Все публикуемые значения δ13С обычно приведены к международному образцу VPDB, представляющему собой кальцит окаменелости Belemnitella Americana мелового возраста, а δD и δ18О к VSMOW – международному стандарту океанической воды.
Для фотосинтезирующих растений различают циклы: Кальвина с образованием в качестве первичного продукта трехуглеродной фосфороглицериновой кислоты (наиболее распространенные растения С3‑типа) и Хетч-Слека, при котором первичными продуктами оказываются четырехуглеродные соединения малат и аспартат, как пути ассимиляции СО2 (в основном высшие покрытосеменные С4‑растения, такие как кукуруза, сорго, сахарный тростник) [2].
Диапазоны колебаний изотопного состава растений этих двух типов различны и даже не перекрываются. В наземных С3‑растениях δ13С варьирует от –21 до –33‰, углерод С4‑растений значительно тяжелее, δ13С в них колеблется от –10 до –18‰. Различие в изотопных эффектах углерода растений С3 и С4 позволяет однозначно идентифицировать не только сами растения и их плоды, но и продукты их переработки [1, 2].
Пчелы собирают пыльцу и нектар, как правило, с растений С3‑типа. Поэтому натуральный мед характеризуется средней величиной δ13С порядка –26‰ (табл. 1).Если мед разбавлен сиропом (кукурузным или из сахарного тростника, для которых δ13С составляет порядка –13 ÷ –11‰), или же производилась подкормка пчел полученным из растений С4‑типа сахаром, а также при сборе пчелами нектара преимущественно с таких растений, то изотопный состав углерода меда будет промежуточным – между –26‰ и –11‰. При этом, очевидно, известные в России традиционные сорта меда: липовый, гречишный, акациевый – должны иметь изотопный состав углерода, характерный для высших растений С3‑типа [1, 3, 5, 6].
В натуральном меде белковая и углеводная составляющие образовались одновременно и из одного источника, поэтому изотопное распределение углерода в них должно быть одинаковое. Отличие в данных изотопного состава будет говорить о фальсификации меда сахаром или сиропом. Согласно принятому в ЕС регламенту изотопный состав меда на выявление фальсификации с добавлением сахаров по методике АОАС 998.12 предполагает измерение и сравнение данных изотопного состава меда (преобладает углеводная составляющая) и его белковой фракции (рис. 1). При различии данных более, чем в 1‰, делается однозначный вывод о фальсификации. Также мед считается фальсифицированным, если процент содержания C4-сахара (СС4 сахар) в образце меда больше 7% или меньше –7%, согласно следующей формуле:
СС4сахар = 100(δ13Сбелок – δ13Смед) / (δ13Сбелок – (– 9,7)), %,
где δ13Сбелок– значение δ13С для белковой части меда, δ13Смед– значение δ13С для меда, а –9,7 – среднее значение δ13С для кукурузного сиропа.
Протокол анализа АОАС 998.12 широко применяется в ЕС, США, Канаде, Австралии и других странах в течение многих лет. Для различных сортов меда созданы базы изотопных данных, которые защищают производителя и конечного потребителя от вероятных подделок, связанных с регионом происхождения или сортом меда [4, 7, 8, 10].
К сожалению, в России и странах ТС на сегодняшний день не существует подобного регламента. В работе представлены результаты проверки согласно АОАС 998.12 различных российских и импортных образцов меда, представленных в розничной продаже в Москве (табл. 2).
Методика анализа
Белковую составляющую меда выделяли в соответствии с европейским протоколом AOAC 998.12. Для этого образец меда массой навески 10–12 г помещали в специальную пробирку (50 мл) для центрифуги, смешивали с 4 мл воды и затем добавляли 2 мл 0,335 моль / л H2SO4 и 2 мл 10% Na2WO4. Полученную смесь гомогенизировали, нагревали до 80 °C на водяной бане до флокуляции белков. В результате получали белковые частицы, достаточные для осаждения в прозрачной жидкости. Процесс контролировали визуально.
Затем раствор доводили водой до метки 50 мл, тщательно перемешивали, а затем помещали в центрифугу. Процесс разделения проводили при скорости вращения барабана 1 500 об / мин в течение 5 мин. В тех случаях, когда белок не осаждался, увеличивали скорость вращения до 10 000 об / мин. Разница в изотопном составе углерода белков С13, полученных из одного и того же меда при скоростях вращения центрифуги 1 500 и 10 000 об / мин, не превышала 0,2‰.
В результате получали белковый осадок. Процедуру повторяли не менее пяти раз, пока жидкость не становилась прозрачной, после чего ее удаляли. Осажденный белок сушили в сушильном шкафу до полного высыхания при температуре 75 °C не менее 8 ч.
Определение изотопного состава углерода в образцах проводили на специализированном масс-спектрометре для анализа изотопов легких элементов в газовой фазе в режиме онлайн с линией пробоподготовки (перевод образца в газ СО2 путем окисления) – элементный анализатор, в постоянном потоке газа-носителя (рис. 2). В качестве образца сравнения использовали стандартные образцы: целлюлоза IAEA-CH‑3 и сахароза IAEA-CH‑6 с известным изотопным составом (МАГАТЭ, Австрия). Масса навески пробы, помещаемой в барабан автодозатора, лежала в диапазоне 450–550 мкг. В ходе предварительных исследований оптимизирован режим работы аналитического комплекса для определения изотопного состава. Расчеты проводили автоматически на компьютерной рабочей станции в специализированном программном обеспечении. Результаты измерений регистрировались в графической и цифровой формах. Полученный результат выражался в промилле (‰) в виде показателя изотопного состава δ13С относительно мирового эталона – стандарта углерода VPDB. Полученные данные представлены в табл. 2.
В ходе исследований была успешно отработана методика, получены данные изотопного состава различных образцов меда. Среди исследованных проб выявлены фальсификаты, наличие которых невозможно обнаружить применяемыми и утвержденными на сегодняшний день в России и ТС для контроля качества меда методами [4, 5, 9, 10].
Применение данных изотопного состава легких элементов в меде и продуктах пчеловодства дает широкие возможности для исследований и создания новых регламентов контроля качества и происхождения продукции – сортовое разнообразие и регион происхождения (табл. 3).
Например, для быстрой сортовой идентификации-скрининга (мед с источником происхождения нектара с С3‑растений) анализ изотопного состава углерода можно проводить, не разделяя мед на белки и углеводы, так как даже незначительная примесь внесенного сахара С4 (тростниковый, кукурузный) в результате непосредственного добавления в мед заявленного происхождения, либо в виде кормовой прикормки для пчел будет отражаться на валовом изотопном составе углерода (рис. 3). Поэтому, образцы меда, имеющие δ13С со значениями выше, чем –23‰, будут считаться подозрительными. Кроме того, отсутствие манипуляций по разделению меда на белковую и углеводную фракции существенно снижает стоимость анализа на возможную фальсификацию [3, 4, 5].
В табл. 3 представлены измеренные величины δ13С для образцов меда, отобранных в различных районах Алтайского края, Новосибирской области и др.
Диапазон данных изотопного состава углерода исследуемых образцов меда составил от –25,57 до –28,02‰, что может свидетельствовать об их натуральном происхождении.
Выявлены различия между сотовым медом (δ13С = –26,93‰) и пчелиным воском тех же сот (δ13С = –28,74‰), которые, вероятно, могут быть следствием фракционирования углерода на стадиях пчелиного метаболизма (табл. 1). Этот результат может заинтересовать специализирующиеся на изучении пчел, их метаболизма и продуктах пчеловодства организации, например Институт Пчеловодства.
Мед из Бишкека (δ13С = –22,93‰) либо фальсифицирован добавлением сахара, либо имеет типичный для региона изотопный состав углерода, так как доля С4‑растений и растений смешанного типа фотосинтеза САМ (Crassulacean Acid Metabolism) в засушливых жарких районах выше. В данном случае необходимо провести дополнительное исследование с выделением белковой части [1, 2, 5, 6].
Для четкой дифференциации места происхождения меда перспективно использование изотопной системы дейтерий – кислород 18 (δD и δ18О). Питающие растительность определенного региона природные воды имеют индивидуальные изотопные составы водорода и кислорода, отражающие генезис и происхождение водной системы (табл. 4). Такая уникальная метка находит отражение в растениях [2].
Для более широкого применения данных изотопного состава углерода, кислорода, водорода и азота в меде в качестве метки, отражающей географическое происхождение и сорт, необходимо составление и сопоставление информационной базы данных изотопного состава перечисленных элементов в меде, воде и растительности, типичной для территории Российской Федерации и стран ТС. Подобная информационная база поможет идентифицировать мед по месту происхождения и установить региональный диапазон колебаний изотопного состава, что даст возможность экспертно выявлять фальсификацию продуктов пчеловодства.
На сегодняшний день компания «МС-АНАЛИТИКА» предлагает законченное приборное решение на базе оборудования Elementar (Англия) для изучения и рутинного применения в лабораториях по контролю качества меда с методической поддержкой и сервисным сопровождением. Elementar – единственная компания, которая производит специализированный для исследований меда комплекс ВЭЖХ – изотопный масс-спектрометр, включающий программное обеспечение для обработки и базу изотопных данных по меду различного региона происхождения.
Сопряжение изотопного масс-спектрометра с ВЭЖХ позволяет определять изотопный состав в индивидуальных сахарах меда (трисахариды, дисахариды, глюкоза, фруктоза), с предварительным разделением на хроматографической колонке (табл. 5, рис. 4) [8, 11]. Все оборудование внесено в Реестр средств измерений РФ.
Литература
Галимов Э. М. Природа биологического фракционирования изотопов. М.: Наука, 1981.
Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимических адаптаций. М.: Мир, 1988.
Колеснов А. Ю., Мойсеяк М. Б., Талибова А. Г. Масс-спектрометрические исследования состава стабильных изотопов углерода 13С и 12С в сахарах различного происхождения. Сахар. 2011;(8):39–45.
Талибова А. Г., Колеснов А. Ю. Исследование стабильных изотопов для оценки качества и безопасности пищевых продуктов. Ч. 2. Углерод.Хранение и переработка сельхозсырья.2010;(12):51–54.
Ветрова О. В., Калашникова Д. А., Мелков В. Н., Симонова Г. В Выявление фальсификации меда сахарными сиропами методом масс-спектрометрии стабильных изотопов. Журн. аналит. химии. 2017;72(7):645.
Калашникова Д. А., Симонова Г. В. Отношения стабильных изотопов 13С / 12С и 15N / 14N в образцах подмора медоносных пчел и в продуктах их жизнедеятельности. Журн. аналит. химии. 2021;76(4):359–368.
Ruoff K., Bogdanov S. (2004) Authenticity of honey and other bee products. Apiacta. 2004;38:317–327.
JRC Technical Reports Results of honey authenticity testing by liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Ref. Ares (2016)6932951–13 / 12 / 2016, https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/safety/docs/oc_control-progs_honey_jrc-tech-report_2016.pdf, last accessed Mar 24, 2017.
Tosun M. Detection of adulteration in honey samples added various sugar syrups with 13C / 12C isotope ratio analysis method. Food Chem. 2013;138(2–3):1629–1632. doi: 10.1016/j.foodchem.
2012.11.068. Epub 2012 Nov 24. PMID: 23411291.
AOAC. Official methods of analysis method 998.12: C‑4 plant sugars in honey. Internal standard stable carbon isotope ratio method.AOAC International, 1998.
Cabanero A. I., Recio J. L., Rupérez M. Liquid Chromatography Couples to Isotope Ratio Mass Spectrometry: A New Perspective on Honey Adulteration Detection.J.Agric. Food Chem. 2006;54:9719–9727.
References
Galimov E. M. The nature of biological isotope fractionation. M.: Nauka publ., 1981.
Khochachka P., Somero Dzh. Biochemical adaptation strategy. M.: Mir publ., 1988.
Kolesnov A. Yu., Moiseyak M. B., Talibova A. G. Mass spectrometric studies of the composition of stable carbon isotopes 13C and 12C in sugars of various origins. Sakhar – Sugar. 2011;(8):39–45.
Talibova A. G., Kolesnov A. Yu. Study of stable isotopes for the assessment of food quality and safety. Part 2. Carbon. Khranenie i pererabotka sel.khozsyr.ya – Storage and processing of agricultural raw materials. 2010;(12):51–54.
Vetrova O. V., Kalashnikova D. A., Melkov V. N., Simonova G. V. Detection of falsification of honey with sugar syrups by stable isotope mass spectrometry. Zhurn. analit. Khimii – Journal of Analytical Chemistry. 2017;72(7):645.
Kalashnikova D. A., Simonova G. V. Ratios of stable isotopes 13С / 12С and 15N / 14N in samples of dead honey bees and in products of their vital activity. Zhurn. analit. Khimii – Journal of Analytical Chemistry.2021;76(4):359–368.
Ruoff K., Bogdanov S. (2004) Authenticity of honey and other bee products. Apiacta. 2004;38:317–327.
JRC Technical Reports Results of honey authenticity testing by liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Ref. Ares(2016)6932951–13/12/2016, https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/safety/docs/oc_control-progs_honey_jrc-tech-report_2016.pdf, last accessed Mar 24, 2017.
Tosun M. Detection of adulteration in honey samples added various sugar syrups with 13C / 12C isotope ratio analysis method. Food Chem. 2013;138(2–3):1629–1632. doi: 10.1016 / j.foodchem.
2012.11.068. Epub 2012 Nov 24. PMID: 23411291.
AOAC. Official methods of analysis method 998.12: C‑4 plant sugars in honey. Internal standard stable carbon isotope ratio method. AOAC International, 1998.
Cabanero A. I., Recio J. L., Rupérez M. Liquid Chromatography Couples to Isotope Ratio Mass Spectrometry: A New Perspective on Honey Adulteration Detection.J.Agric. Food Chem. 2006;54:9719–9727.
Отзывы читателей
